CN106544420B - 一种判断罗非鱼是否处于低氧应激状态的方法及其引物和试剂盒 - Google Patents
一种判断罗非鱼是否处于低氧应激状态的方法及其引物和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种判断罗非鱼是否处于低氧应激状态的方法。分别测定正常罗非鱼的脾脏和待测低氧处理的罗非鱼的脾脏中GABA转运蛋白2基因的表达量，如果待测低氧处理的罗非鱼的脾脏中GABA转运蛋白2基因的表达量显著低于正常罗非鱼的脾脏中GABA转运蛋白2基因的表达量则表明待测低氧处理的罗非鱼处于低氧应激状态，如果两者表达量不存在显著性差异则表明待测低氧处理的罗非鱼不处于低氧应激状态。本发明用于检测罗非鱼脾脏中GABA转运蛋白2基因的特异性引物，经实验表明其具有良好的特异性和灵敏性，扩增效率好，用于检测GABA转运蛋白2基因的表达效率高低。
Description
技术领域：
本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种判断罗非鱼是否处于低氧应激状态的方法及其引物和试剂盒。
背景技术：
罗非鱼俗称非洲鲫鱼是世界水产业的重点科研培养的淡水养殖鱼类，且被誉为未来动物性蛋白质的主要来源之一。罗非鱼具有生长快，适应能力强等优点，是世界性的主要养殖鱼类。罗非鱼对低氧条件有较强的适应能力，但氧气浓度过低也会影响罗非鱼的生长和繁殖。因此，对罗非鱼低氧的研究具有重要的意义。在研究罗非鱼低氧相关问题时，首先需要能够准确判断罗非鱼是否处于低氧应激条件。
实时荧光定量PCR是一种简便高效的检测基因表达的方法。当罗非鱼处于低氧应激条件时，体内许多基因的表达会有很显著的变化，通过检测这些基因的表达，可以判断罗非鱼是否处于低氧应激条件。植物中的研究表明GABA是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，在缺氧、冷害、热刺激、盐胁迫等逆境条件下，GABA的含量均有明显的增加。GABA转运蛋白2是质膜上参与GABA运输的一种蛋白。由于GABA与低氧逆境的关系，GABA转运蛋白2的表达也可能会受低氧环境的影响。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种判断罗非鱼是否处于低氧应激状态的方法。
本发明的判断罗非鱼是否处于低氧应激状态的方法，其特征在于，分别测定正常罗非鱼的脾脏和待测低氧处理的罗非鱼的脾脏中GABA转运蛋白2基因的表达量，如果待测低氧处理的罗非鱼的脾脏中GABA转运蛋白2基因的表达量显著低于正常罗非鱼的脾脏中GABA 转运蛋白2基因的表达量则表明待测低氧处理的罗非鱼处于低氧应激状态，如果两者表达量不存在显著性差异则表明待测低氧处理的罗非鱼不处于低氧应激状态。
优选，所述的方法包括以下步骤：
分别提取正常罗非鱼的脾脏和待测低氧处理的罗非鱼的脾脏的RNA，然后分别反转录成 cDNA，以罗非鱼GABA转运蛋白2基因的特异性引物作为扩增引物，以cDNA作为模板进行荧光定量PCR反应，然后计算GABA转运蛋白2的相对表达量，比较正常罗非鱼和待测低氧处理的罗非鱼的GABA转运蛋白2的表达量，判断待测低氧处理的罗非鱼是否处于低氧应激状态，如果两者表达量存在显著性差异则表明待测低氧处理的罗非鱼处于低氧应激状态，如果两者表达量不存在显著性差异则表明待测低氧处理的罗非鱼不处于低氧应激状态；
所述的罗非鱼GABA转运蛋白2基因的特异性引物包括：
正向引物序列GAT2-F：5’-GGTGGCATGCAAACCTTCTG-3’(其序列如SEQ ID NO.3 所示)
反向引物序列GAT2-R：5’-CTGTCCGTCATCTTGAGGGG-3’(其序列如SEQ ID NO.4 所示)。
进一步优选，还设有内参基因，所述的内参基因为管家基因EF1α，其特异性引物包括：
正向引物序列EF1α-F：5’-GCACGCTCTGCTGGCCTTT-3’(其序列如SEQ ID NO.1所示)；
反向引物序列EF1α-R：5’-GCGCTCAATCTTCCATCCC-3’(其序列如SEQ ID NO.2所示)。
基于内参基因的表达可以算出罗非鱼GABA转运蛋白2基因的相对表达量。
优选，所述的荧光定量PCR反应，其反应体系为：
荧光定量反应循环参数设置为：94℃，3min，然后95℃，15s,60℃，15s，72℃，20s，40个循环。
本发明第二个目的是提供一种罗非鱼脾脏GABA转运蛋白2的荧光定量PCR特异性引物，其特征在于，包括：
正向引物序列GAT2-F：5’-GGTGGCATGCAAACCTTCTG-3’(其序列如SEQ ID NO.3 所示)
反向引物序列GAT2-R：5’-CTGTCCGTCATCTTGAGGGG-3’(其序列如SEQ ID NO.4 所示)。
本发明的第三个目的是提供一种罗非鱼低氧应激判断试剂盒，其特征在于，包括上述罗非鱼脾脏GABA转运蛋白2的荧光定量PCR特异性引物和荧光定量PCR反应试剂。
本发明采用实时荧光定量PCR技术检测GABA转运蛋白2基因在脾脏中的表达，结果表明：在正常条件和低氧应激条件的罗非鱼脾脏中，GABA转运蛋白2基因的表达具有显著的差异， GABA转运蛋白2基因在低氧应激的罗非鱼脾脏中的表达量明显低于正常条件下罗非鱼脾脏中的表达量，因此用罗非鱼脾脏中GABA转运蛋白2基因的表达量来判断罗非鱼是否处于低氧应激状态。本发明用于检测罗非鱼脾脏中GABA转运蛋白2基因的特异性引物，经实验表明其具有良好的特异性和灵敏性，扩增效率好，用于检测GABA转运蛋白2基因的表达效率高低。
附图说明：
图1为本发明实施例1中利用EF1α和GABA转运蛋白2基因的特异性引物进行扩增的产物电泳检测结果，其中M表示marker。
图2为本发明实施例2中正常条件及低氧条件的脾脏中GABA转运蛋白2基因的荧光定量结果。
图3为正常条件及低氧条件的脾脏中EF1α的荧光定量结果。
图4为引物灵敏性实验中，两个质粒拷贝数梯度稀释的CT值与质粒拷贝数作图。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范畴。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
主要材料、试剂和仪器设备
罗非鱼，养殖箱，充气泵，氮气罐，溶氧计8304，酒精灯，剪刀镊子，1.5ml离心管，各规格移液枪及枪头，Trizol，氯仿，异丙醇，无水乙醇，DEPC处理水，琼脂糖，反转录试剂盒(东盛)，SYBR Green荧光定量试剂盒(东盛)，酵母提取物，蛋白胨，氯化钠，琼脂粉，氨苄青霉素，X-gal，IPTG，Top10感受态细胞，玻璃涂布棒，牙签，质粒提取试剂盒(东盛)，电子秤，高速冷冻离心机(Centrifuge 5804R，eppendorf)，BIO-RAD PCR仪，荧光定量PCR 仪(Lightcycler480Ⅱ，Roche)，电泳仪(DYY-6C型，北京六一)，凝胶成像系统(Tanon 4120，上海天能)，灭菌锅(LDZM-60KCS，上海申安)，-80℃超低温冰箱(Haier)，水浴锅，摇床 (FLY-100B，上海申贤)，恒温培养箱(SPX-250B)，超净工作台(SW-CJ-2FD，苏州安泰)。
实施例1罗非鱼脾脏中GABA转运蛋白2基因的特异性的PCR检测方法
样品为控制组和低氧处理组的6h，12h和24h样品。使用Trizol提取罗非鱼脾脏中的总 RNA,利用反转录试剂盒(东盛)合成cDNA第一链，作为GABA转运蛋白2基因的PCR检测和荧光定量PCR模板。
1.1.1罗非鱼实验处理及脾脏中总RNA提取
(1)罗非鱼实验处理：控制组(N＝5)的处理方法为向含有罗非鱼的鱼缸水体内持续充入氧气，氧气浓度维持在7.5-7.8mg/l左右；低氧组(N＝5)的处理方法为向含有罗非鱼的鱼缸水体内持续充入气体，气体由氧气和氮气组成，调节氧气和氮气的充入量，使氧气浓度保持在1.5-2.0mg/l之间。当低氧组氧气浓度达到要求时开始计时，分别在处理6h,12h和24h后对脾取样。
(2)RNA提取：将1.5ml灭菌离心管编好号，向管中加入800μl Trizol试剂(东盛)，取罗非鱼脾脏组织放入离心管中。用组织破碎仪破碎样品，破碎后再向管中加入200μlTrizol 试剂，静置10min。(Trizol的作用是裂解细胞)(2)向匀浆液中加入氯仿200μl，上下颠倒约 20次，待溶液呈乳白色无分层现象后，再室温静置15min。(氯仿使溶液分三层，RNA在上层)(3)12000rpm 4℃离心10min，小心取出离心管，吸取上清液转移至另一新的离心管中。 (切忌吸出白色中间层)(4)向上清中加入等体积的异丙醇(500～600μl)，上下颠倒离心管充分混匀后，静置10min。(异丙醇的作用是使RNA沉淀下来)(5)12000rpm 4℃离心10min，离心后底部沉淀为RNA。(6)RNA的清洗。小心倒掉上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇1ml(切勿触及沉淀)，上下颠倒洗涤离心管管壁，12000rpm 4℃离心2min后小心弃去乙醇(为了更好地控制RNA中的盐离子含量，应尽量除净乙醇)，重复洗涤一次。(75％乙醇用DEPC处理水配制)(7)室温自然干燥沉淀2-5min，加入约20μl DEPC处理水(作用是抑制RNase)，RNA沉淀溶解后于-80℃保存，由此获得各个样品的罗非鱼脾脏总RNA。
1.1.2利用反转录试剂盒合成第一链cDNA
(1)在冰浴的无菌离心管中配制下列混合物：2μg罗非鱼脾脏总RNA，1μl Oligo(dT)，补RNase-free ddH2O至13.4μl。(2)进行变性退火反应。70℃温浴5min后冰浴5min。(3) 配制混合液。将4μl 5×first-strand buffer，1μl dNTPs，0.6μl RNasin，1μlM-MLV(逆转录酶) 加入到上述13.4μl含有罗非鱼脾脏总RNA，1μl Oligo(dT)的溶液中。(4)反转录反应。42℃温浴60min后70℃温浴5min，置冰上进行后续实验。所用反转录试剂盒购于东盛。由此获得各个样品的第一链cDNA。
1.2引物设计及合成
根据罗非鱼GABA转运蛋白2基因和EF1α基因序列，利用NCBI在线primer blast工具分别设计一对扩增长度在100-300bp的特异引物。
EF1α基因的特异性引物：
正向引物序列EF1α-F：5’-GCACGCTCTGCTGGCCTTT-3’；反向引物序列EF1α-R： 5’-GCGCTCAATCTTCCATCCC-3’。
GABA转运蛋白2基因的特异性引物：
正向引物序列GAT2-F：5’-GGTGGCATGCAAACCTTCTG-3’；反向引物序列GAT2-R： 5’-CTGTCCGTCATCTTGAGGGG-3’。
引物由life公司合成。
1.3 PCR扩增
利用上述合成的两对特异性引物，以罗非鱼脾脏控制组第一链cDNA为模板进行扩增。其中PCR扩增的条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸20s，共34个循环；最后72℃延伸5min，16℃保持。PCR反应体系为20μl：10μl 2×DS mix(东盛)，0.8μl 10μM的正向引物及反向引物，1μlcDNA模板，补超纯水至20μl。
1.4电泳检测
将上述PCR扩增产物进行电泳检测，上样量为3μl，所用marker为low ladder(东盛)，结果如图1所示。
从图1可以看出，用EF1α基因的特异性引物能扩增出相对应的扩增产物(图1中的EF1α)，用GABA转运蛋白2基因的特异性引物能扩增出相对应的扩增产物(图1中的GAT-2)。
实施例2利用实施例1中合成的EF1α基因的特异性引物和GABA转运蛋白2基因的特异性引物进行荧光定量PCR扩增，分析低氧组和控制组罗非鱼脾脏中GABA转运蛋白2的表达量。
1.1样本来源
实施例2中所用的样本为6h，12h和24h控制组及低氧处理组脾脏总RNA，每个处理三次重复。
1.1 cDNA合成及稀释用于荧光定量PCR
cDNA的合成如实施例1，得到的cDNA产物稀释10倍后用于荧光定量PCR(2μg RNA样品反转录后稀释到200μl)。
1.2荧光定量PCR
荧光定量PCR反应体系以10μl计算：
荧光定量PCR反应条件为：在Roche LightCycler480Ⅱ实时荧光定量PCR系统上进行反应，荧光定量反应循环参数设置为：94℃，3min，然后95℃，15s,60℃，15s，72℃，20s，40个循环。每个样品三个点样重复。
测定EF1α基因的相对表达量使用EF1α基因的特异性引物：
正向引物序列EF1α-F：5’-GCACGCTCTGCTGGCCTTT-3’；反向引物序列EF1α-R： 5’-GCGCTCAATCTTCCATCCC-3’。
测定GABA转运蛋白2基因的相对表达量使用GABA转运蛋白2基因的特异性引物：
正向引物序列GAT2-F：5’-GGTGGCATGCAAACCTTCTG-3’；反向引物序列GAT2-R： 5’-CTGTCCGTCATCTTGAGGGG-3’。
1.3荧光定量结果分析
利用
法计算GABA转运蛋白2的相对表达量，结果如图2所示，表示控制组和低氧处理组6h，12h和24h罗非鱼脾脏中GABA转运蛋白2的相对表达量。所有表达量以控制组6h的表达量作为基准(1)进行标准化。图2中GABA转运蛋白2的表达量以内参基因的表达进行了标准化。从图2中可以看出，在低氧处理的三个时间点(6h，12h和24h)，GABA 转运蛋白2的表达量在低氧处理组中的表达都是明显低于控制组。因此，在低氧条件下，罗非鱼脾脏中GABA转运蛋白2基因的表达量明显下降，可以据此判断罗非鱼是否处于低氧应激状态。图3为内参基因EF1α的表达，从图3可以看出在三个时间点，EF1α的表达在低氧组和控制组中都没有显著差异，说明EF1α的表达是稳定的。而GABA转运蛋白2的表达存在差异。图3中表达量的计算，是以6h控制组的表达量作为基准(1)，对其他时间点的控制组和对照组表达量进行标准化。
1.4EF1α基因和GABA转运蛋白2基因的特异性引物扩增效率分析
将其中一个样品的第一链cDNA模板进行2.5倍系列稀释，得到4个浓度梯度进行引物扩增效率分析。计算得到的引物扩增效率如下表1。
表1 EF1α基因和GABA转运蛋白2基因的特异性引物扩增效率
| 基因名称 | 扩增效率 |
| EF1α | 89.01％ |
| GABA转运蛋白2 | 88.47％ |
实施例3对引物特异性和灵敏性进行分析。
1.1引物特异性实验
1.1.1 PCR产物与T载体连接
将实施例1中的控制组的GABA转运蛋白2基因的特异性引物的扩增产物与pGEM-TEasy载体(Promega)连接，连接反应体系为2x连接buffer 5μl，pGEM-T Easy载体0.5μl， T4DNA连接酶1μl，PCR产物3.5μl，总体积10μl。混匀后置于4℃冰箱中连接过夜。
1.1.2含X-gal和IPTG的氨苄板制作
X-gal用DMSO配制成20mg/ml的贮存液。保存于铝箔封裹的管中以防因受光照而被破坏，贮存于-20℃。IPTG的配制：在8ml蒸馏水中溶解2g IPTG后，用蒸馏水定容至10ml。配完后用0.22μm滤器过滤除菌，并贮存于-20℃。将40μl X-gal和5μl IPTG混匀后均匀涂布到含氨苄的LB固体培养基上，晾干即可用于蓝白斑筛选。
1.1.3转化
向一管Top10感受态细胞(100μl)中加入2μl连接产物，轻弹混匀，在冰浴中静置30min。将离心管置于42℃水浴中放置90s，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3min，该过程不要摇动离心管。向离心管中加入900μl无菌的LB液体培养基(不含氨苄)，混匀后置于 37℃摇床上震荡培养45min(150rpm)。吸取100μl已转化的感受态细胞加到含有X-gal和IPTG 的氨苄板上，涂布均匀。将平板正向置于37℃培养箱中，待液体被吸收后翻过来倒置培养14h。
1.1.4挑白斑提质粒测序
用牙签挑取单个白斑放入装有3ml LB液体培养基(含氨苄)的摇菌管(10ml)中，250rpm 37℃过夜培养。质粒提取按照试剂盒方法操作。用1.5ml无菌离心管收集1-5ml菌液，12000rpm 离心1min，弃上清。加入250μl溶液Ⅰ/RNaseA混合液，涡旋震荡直至菌体完全重新悬浮，室温静置1-2min。加入250μl溶液Ⅱ，轻柔的反复颠倒混匀5-6次，室温放置1-2min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。加入350μl溶液Ⅲ，立即轻柔地反复颠倒混匀5-6 次，此时会出现白色絮状沉淀。12000rpm室温离心10min，收集上清。将上清置于DNA纯化柱中，静置1-2min。12000rpm离心1min，弃滤液。加入500μl溶液PB，12000rpm离心1min，弃滤液。加入500μl溶液W，12000rpm离心1min，弃滤液，重复一次。12000rpm离心3min，彻底去除纯化柱中残留的液体。将DNA纯化柱置于新的离心管中，向纯化柱中央处，悬空滴加50-100μl溶液Eluent，室温放置2min，12000rpm离心1min，管底即为高纯度质粒DNA。质粒提取完后送给公司测序。测序结果显示插入片段，即引物扩增片段确实为 GABA转运蛋白2基因部分片段。
1.2引物灵敏性实验
将1.1中提取的质粒测浓度，换算成质粒拷贝数。计算公式为：
copy数(/μl)＝摩尔数x 6.02x 1023
摩尔数＝浓度(g/μl)/mw
dsDNA平均分子量(mw)＝碱基数x660道尔顿/碱基
本发明中所用载体大小为3015bp，扩增片段大小为154bp。所用质粒原始浓度101ng/μl，换算成质粒拷贝数后为2.91x1010(/μl)，预先稀释100000倍后，再按梯度稀释。稀释倍数及方法按表2 所示。
稀释的各质粒样品进行荧光定量PCR，具体程序如下：
荧光定量PCR反应体系以10μl计算：
使用的引物是使用GABA转运蛋白2基因的特异性引物：
正向引物序列GAT2-F：5’-GGTGGCATGCAAACCTTCTG-3’；反向引物序列GAT2-R： 5’-CTGTCCGTCATCTTGAGGGG-3’。
荧光定量PCR反应条件为：在Roche LightCycler480Ⅱ实时荧光定量PCR系统上进行反应，荧光定量反应循环参数设置为：94℃,3min，然后95℃,15s,60℃,15s，72℃,20s,40个循环。每个样品三个点样重复。
图4结果显示梯度稀释的质粒模板扩增的CT值呈直线，且能扩增模板为7.5个左右的质粒拷贝数，说明所用GABA转运蛋白2基因的特异性引物具有较好的特异性和灵敏性。
表2
| 图4中横坐标代号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 10倍梯度质粒拷贝数(/μl) | 291000 | 29100 | 2910 | 291 | 29 | 3 |
| 2倍梯度质粒拷贝数(/μl) | 291 | 146 | 73 | 36 | 18 | 9 |
Claims (4)
1.一种判断罗非鱼是否处于低氧应激状态的方法，其特征在于，分别测定正常罗非鱼的脾脏和待测低氧处理的罗非鱼的脾脏中GABA转运蛋白2基因的表达量，如果待测低氧处理的罗非鱼的脾脏中GABA转运蛋白2基因的表达量显著低于正常罗非鱼的脾脏中GABA转运蛋白2基因的表达量则表明待测低氧处理的罗非鱼处于低氧应激状态，如果两者表达量不存在显著性差异则表明待测低氧处理的罗非鱼不处于低氧应激状态。
2.根据权利要求1所述的判断罗非鱼是否处于低氧应激状态的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
分别提取正常罗非鱼的脾脏和待测低氧处理的罗非鱼的脾脏的RNA，然后分别反转录成cDNA，以罗非鱼GABA转运蛋白2基因的特异性引物作为扩增引物，以cDNA作为模板进行荧光定量PCR反应，然后计算GABA转运蛋白2的表达量，比较正常罗非鱼和待测低氧处理的罗非鱼的GABA转运蛋白2的表达量，判断待测低氧处理的罗非鱼是否处于低氧应激状态，如果待测低氧处理的罗非鱼的脾脏中GABA转运蛋白2基因的表达量显著低于正常罗非鱼的脾脏中GABA转运蛋白2基因的表达量则表明待测低氧处理的罗非鱼处于低氧应激状态，如果两者表达量不存在显著性差异则表明待测低氧处理的罗非鱼不处于低氧应激状态；
所述的罗非鱼GABA转运蛋白2基因的特异性引物包括：
正向引物序列GAT2-F：5’-GGTGGCATGCAAACCTTCTG-3’；
反向引物序列GAT2-R：5’-CTGTCCGTCATCTTGAGGGG-3’。
3.根据权利要求2所述的判断罗非鱼是否处于低氧应激状态的方法，其特征在于，还设有内参基因，所述的内参基因为管家基因EF1α，其特异性引物包括：
正向引物序列EF1α-F：5’-GCACGCTCTGCTGGCCTTT-3’；
反向引物序列EF1α-R：5’-GCGCTCAATCTTCCATCCC-3’。
4.根据权利要求3所述的判断罗非鱼是否处于低氧应激状态的方法，其特征在于，所述的荧光定量PCR反应，其反应体系为：
荧光定量反应循环参数设置为：94℃，3min，然后95℃，15s,60℃，15s，72℃，20s，40个循环。
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|---|---|---|---|---|
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1768139A (zh) * | 2003-02-10 | 2006-05-03 | 独立行政法人产业技术总合研究所 | 通过dna干扰调控基因的表达 |
| CN103667449A (zh) * | 2013-11-07 | 2014-03-26 | 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 | 一种鉴别吉富罗非鱼性别的实时荧光pcr方法及引物组 |
| CN105687202A (zh) * | 2016-01-20 | 2016-06-22 | 复旦大学附属金山医院 | 应用γ-氨基丁酸转运蛋白亚型Ⅰ基因剔除小鼠系建立新型药物诱导癫痫动物模型 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Oxidative stress in macrophages from spleen of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) exposed to sublethal concentration of endosulfan;Martha Cecilia Tellez-Ban˜uelos等;《Fish & Shellfish Immunology》;20081120;第105-111页 * |
| XM_005459044.2;BioProject: PRJNA72943;《GenBank》;20150730;第1-3页 * |
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