CN106544343A - 具有神经保护作用的寡核苷酸、药物组合物及其医药用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有神经保护作用的寡核苷酸、药物组合物及其医药用途。所述寡核苷酸的序列如SEQ ID NO：1所示。所述寡核苷酸经3’端胆固醇修饰，5’端两个硫代骨架修饰，3’端四个硫代骨架修饰，全链甲氧基修饰。本发明将寡核苷酸与可接受的药学载体组成药物组合物，通过静脉、肌肉或腹腔注射等用来治疗与缺血性神经元损伤有关的疾病，尤其针对缺血性脑卒中。本发明的寡核苷酸在大鼠全脑缺血和局灶性脑缺血后应用可以明显减轻缺血再灌注引起的脑损伤，具有良好的药物应用前景。

Description

具有神经保护作用的寡核苷酸、药物组合物及其医药用途
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及一种寡核苷酸，尤其涉及一种具有神经保护作用的寡核苷酸、药物组合物及其医药用途。
背景技术
脑卒中(Stroke)是威胁人类生命的主要危险因素，它是一种由急性脑循环障碍所致的脑功能缺损综合征，具有高发病率，高死亡率、高致残率的特点，且发病率呈逐年上升趋势。急性缺血性脑卒中是脑供血不足导致的脑组织坏死，占全部脑卒中的60％－80％。目前，急性缺血性脑卒中在临床上常见的治疗方法是采用溶栓药恢复或改善血供，同时需配合神经保护药物阻止脑缺血的进一步发展，但目前临床上神经保护药物的疗效和安全性仍不理想。故积极探索脑缺血再灌注神经损伤的分子机制，筛选药物作用靶点，寻找更有效的神经保护药物，具有重要的医学价值和社会意义。
寡核苷酸是生物医学领域研究和治疗的一种新型基因靶向治疗药物，在多种疾病的治疗中具有良好的应用前景。寡核苷酸，或经修饰的药物组合物与细胞膜亲和力更强，药效明显，具有更高的稳定性和特异性，且不易产生耐药性，可以作为治疗中枢神经系统疾病的一种手段。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种寡核苷酸，可用于治疗缺血再灌注造成的神经元损伤。
为实现上述目的，本发明提供了一种具有神经保护作用的寡核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
所述的寡核苷酸由化学合成方法制备，可以经过不同的化学修饰。
所述的寡核苷酸经3’端胆固醇修饰，5’端两个硫代骨架修饰，3’端四个硫代骨架修饰，全链甲氧基修饰。
本发明的另一个目的是提供一种药物组合物，可用于治疗缺血再灌注造成的神经元损伤。
本发明提供的药物组合物，包含活性成分的寡核苷酸以及药学上可接受的载体。所述载体可以选自稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入调味剂、香味剂等。
本发明的药物组合物可以制成片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液及注射液等多种形式。上述各种剂型均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明的再一个目的是提供所述寡核苷酸的医药用途，可用于制备治疗神经系统疾病的药物和神经元保护药物。其中，所述的神经系统疾病指与缺血性神经元损伤有关的神经系统疾病，如缺血性脑卒中。
本发明提供的寡核苷酸可以明显减轻缺血再灌注引起的脑损伤，治疗与缺血性神经元损伤有关的疾病，其在医学领域、尤其是神经医学领域具有良好的应用前景。
附图说明
图1显示了本发明的寡核苷酸对大鼠全脑缺血再灌注引起的海马神经元损伤的影响(A：大鼠脑组织石蜡切片的焦油紫染色图；B：A的统计图)；
图2显示了本发明的寡核苷酸对大鼠局灶性脑缺血再灌注引起的脑损伤的影响(A1：大鼠MCAO脑组织TTC染色图；A2：A1的统计图；B：动物神经行为学Longa评分)。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1寡核苷酸的制备
本发明的寡核苷酸由上海吉玛制药技术有限公司合成，经3’端胆固醇修饰，5’端两个硫代骨架修饰，3’端四个硫代骨架修饰，全链甲氧基修饰，紫外定量后真空干燥，-20℃保存备用。经化学修饰的寡核苷酸增加了其稳定性和靶向亲和性，降低了细胞毒性，可通过静脉，肌肉或腹腔注射等，能够达到生物治疗缺血性脑损伤的目的。
通过与GeneBank联机blast序列比对，得寡核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示：5’-AGUGAAUUCUACCAGUGCCAUA-3’，其具有很好的特异性。
实施例2寡核苷酸对大鼠全脑缺血再灌注引起的海马神经元损伤的影响
(1)主要试剂
阴性对照的寡核苷酸由上海吉玛制药技术有限公司合成，其核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示：5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’。
异氟烷(2％)购自美国Baxter公司；水合氯醛及其他常规化学试剂购自国药集团化学试剂有限公司；2,3,5-氯化三苯四氮唑(TTC)购自Ameresco公司。
(2)主要仪器
小动物麻醉机(ABS-100)、小动物诱导箱(IC-R)购自上海玉研科学仪器有限公司；小动物立体定位仪购自美国STOELTING公司。
(3)实验动物
SPF级Sprague-Dawley(SD)健康雄性大鼠，体重为220-300g，由徐州医科大学实验动物中心提供，饲养于SPF级动物房，许可证号：SCXK(苏)2015-0009。
(4)实验分组
建立假手术组，缺血再灌注5天组，缺血加寡核苷酸组，缺血加阴性对照组，单纯寡核苷酸组。其中假手术组同实验组一样建立全脑缺血模型，但不进行缺血，不注射任何药物；缺血再灌注5天组同实验组一样建立全脑缺血模型，同样进行缺血15min，但不注射任何药物；缺血加寡核苷酸组和缺血加阴性对照组是在缺血后50min分别完成侧脑室注射寡核苷酸和阴性对照；单纯寡核苷酸组是不缺血但侧脑室注射寡核苷酸。
(5)实验方法
采用四动脉结扎法，参照Liu Y等人(Brain Res，2001，909：51-58)建立SD大鼠四动脉结扎全脑缺血模型，其中全脑缺血15min，在缺血再灌注50min后完成侧脑室注射寡核苷酸或对照药物。在脑缺血再灌注第5天，焦油紫染色观察注射药物对缺血再灌注损伤后海马CA1区锥体神经元存活的影响。具体操作如下：
雄性SD大鼠以20％水合氯醛(0.15ml/kg)腹腔注射麻醉，固定在电凝器上，电凝双侧椎动脉，分离双侧颈动脉，24h后在大鼠清醒状态下，使用动脉夹夹闭双侧颈动脉，15min之后取下动脉夹，恢复颈部血流供应，再灌注计时从取下动脉夹的时间开始。假手术组给予相同的处理，但是不夹闭双侧颈动脉。缺血过程保持大鼠直肠温度在36.5℃-37.5℃之间。
模型构建成功参考指标：(1)1min内意识丧失，翻正反射消失，失去活动能力，四肢和尾巴僵直；(2)双侧瞳孔放大眼球发白，再灌注后眼球立即恢复粉红色、瞳孔缩回。
侧脑室注射方法：按侯筱宇等人建立的方法(Neurosci lett,2003,343：125-128)。异氟烷麻醉大鼠，给予实验动物吸入2％异氟烷进行诱导麻醉，由呼吸机控制通气，保持正常呼气末O2和CO2浓度，麻醉后固定于小动物立体定位仪上，切开头皮暴露颅骨，使其保持水平位置，H2O2烧灼暴露前囟点，钻头钻孔，位置为前囟后0.8mm，旁开1.5mm，微量注射针插入，深度为从颅骨表面向下3.5mm。注射速率：1μl/min，体积为10μl，注射完后留针10min。适量无核酶水溶解寡核苷酸或阴性对照，使用前用等体积转染试剂(Santa Cruz,sc-29528)混匀，每只大鼠脑室注射寡核苷酸或阴性对照0.1nmol。
灌注取脑方法：大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，打开胸腔暴露心脏，将针头从左心尖穿过左心室插入主动脉，剪开右心耳，用200ml左右生理盐水快速冲洗，至流出的生理盐水中没有血迹，换冰冷的4％多聚甲醛灌注，用量约为300ml，30min之内灌结束，灌注结束大鼠断头取脑，置于4％多聚甲醛中4℃进行后固定。
焦油紫染色方法：取出固定好的脑块，用流水冲洗，然后以70％(3d)、80％(1d)、90％(12h)、95％(2h×2次)、100％(1h×2次)梯度酒精脱水；二甲苯：乙醇(1:1)(30min)、二甲苯(30min)透明；60℃浸蜡(6h)；取出脑块包埋；包埋好的蜡块置4℃冰箱保存。蜡块复温半小时石蜡切片机切片，6μm厚，在45℃温水中漂片，贴片于明胶处理过的载玻片上，63℃摊片2h，载玻片保存于4℃冰箱待焦油紫染色。复温载玻片，脱蜡：二甲苯(37℃，20min×2次)、100％酒精(5min)、95％酒精(5min)、80％酒精(5min)、70％酒精(5min)、蒸馏水(5min)，0.1％的焦油紫染色35min，70％、80％、95％、100％梯度酒精分色、二甲苯透明(15min×2次)，中性树脂封片后用显微镜观察神经细胞存活情况。
结果显示：正常细胞呈圆形，核淡染，细胞膜及细胞核清晰可见(图1A中a和f)。缺血再灌注5天，存活的正常细胞非常少，锥体细胞大量死亡，可观察到核深染固缩(图1A中b和g)。与假手术组相比，缺血再灌注5天后侧脑室不注射药物和分别注射寡核苷酸或阴性对照海马CA1区神经元都发生了明显的损伤；与缺血再灌注5天组相比，缺血加寡核苷酸组明显减少了海马CA1区锥体神经元的损伤(图1A中c和h)，而缺血加阴性对照组与缺血再灌注5天组无明显差别(图1A中d和i)。单纯寡核苷酸组与假手术组相比无明显差别(图1A中e和j)。
图2B为图2A的统计图。结果显示：单纯寡核苷酸组与缺血实验组相比差异有统计学意义，结果显示，全脑缺血再灌注后注射本发明的寡核苷酸能减轻全脑缺血再灌注造成的神经元损伤。本实验重复5次，*P＜0.05表示与假手术组相比差异有统计学意义，#P＜0.05表示与缺血再灌注5天组相比差异有统计学意义。
实施例3寡核苷酸对大鼠局灶性脑缺血性引起的脑损伤的影响
采用线栓法，参照Longa等人(Stroke,1989,20(1):84-91)建立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型。缺血后侧脑室注射寡核苷酸或阴性对照(每只大鼠1nmol，缺血后40min完成)。在MCAO(90min)后再灌注24h，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC；2％)染色观察注射药物对缺血再灌注损伤后脑梗死组织面积的影响。具体操作如下：
动物饲养及手术温度控制在25℃左右，术前12h禁食不禁水。将雄性SD大鼠以20％水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉，仰卧固定于手术台上，取颈正中切口，暴露右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，结扎颈外动脉和颈总动脉近心端，于颈内动脉远心端备线，在颈总动脉近分叉处剪一约0.2mm的“V”形切口，将预先经多聚赖氨酸处理过的直径为0.26mm的尼龙渔线(北京西浓科技有限公司，2634号线栓)经该切口顺颈总动脉插入颈内动脉(18±1)mm，感到有轻微阻力时停止，使大脑中动脉起始部阻塞。扎紧备线并固定线栓，缝合皮肤切口，90min后将线栓拔出约10mm，恢复再灌注。麻醉清醒后根据Longa评分进行神经行为学检查：0分：正常，无神经功能缺损；1分：右侧前爪不能完全伸展，轻度神经功能缺损；2分：行走时，大鼠向右侧(瘫痪侧)转圈，中度神经功能缺损；3分，行走时，大鼠身体向右侧(瘫痪侧)倾倒。重度神经功能缺损；4分，不能自发行走，有意识丧失。2分或3分组模型成功。假手术组给予相同的处理，置线栓深度为10mm，，不造成大脑中动脉阻塞。
建立假手术组、MCAO组、MCAO加寡核苷酸组、MCAO加阴性对照组。MCAO加寡核苷酸组、MCAO加阴性对照组同MCAO组一样建立局灶性脑缺血模型，在缺血40min后完成侧脑室注射寡核苷酸或对照药物。
侧脑室注射方法：按侯筱宇等人(Neurosci lett,2003,343：125-128)建立的方法。异氟烷麻醉大鼠后固定于小动物立体脑定位仪上，切开头皮暴露颅骨，使其保持水平位置，H2O2烧灼暴露前囟点。钻头钻孔，位置为前囟后0.8mm，旁开1.5mm，微量注射针插入，深度为从颅骨表面向下3.5mm。注射速率：1μl/min，体积为10μl，注射完后留针10min。适量无核酶水溶解寡核苷酸或阴性对照，使用前用等体积转染试剂(Santa Cruz,sc-29528)混匀，每只大鼠脑室注射寡核苷酸或阴性对照1nmol。
大鼠脑组织切片TTC染色测定脑梗死面积：大鼠局灶性脑缺血90min，再灌注24h，迅速断头取脑，将脑组织-20℃冷冻10min后在冰盘上进行冠状切片，在视交叉切第一刀，在视交叉前2mm切第2刀，在视交叉后2mm切第3刀，在第3刀后2mm切第4刀，在第4刀后2mm切第5刀，将6片脑组织放入质量浓度为2％的TTC磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，37℃避光恒温孵育30min，4％多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定24h后拍照。使用Imaga-Pro Plus 6.0图像分析软件计算脑梗死面积。梗死面积(％)＝(对侧脑组织面积–缺血侧正常脑组织面积)/对侧脑组织面积×100％(Du W等人，J Clin Invest，2010，120(10)：3480-3492)。
结果显示：假手术组全脑未见失染区域；MCAO组缺血侧的纹状体及额顶叶皮质失染呈苍白色，其对侧未见失染区域；MCAO加寡核苷酸组缺血侧的失染区(白色区域)明显减小；MCAO加阴性对照组没有保护作用。
图2A2为图2A1的统计图：MCAO加寡核苷酸组与MCAO组相比差异有统计学意义。结果提示：局灶性脑缺血后注射本发明的寡核苷酸能明显减轻局灶性脑缺血再灌注引起的脑损伤，阴性对照没有保护作用。实验重复6次，*P＜0.05表示与MCAO组相比差异有统计学意义。
图2B为MCAO模型动物和缺血后侧脑室注射寡核苷酸的MCAO模型动物神经行为学评分，结果显示局灶性脑缺血后侧脑室注射寡核苷酸可以明显减轻神经功能缺损，阴性对照没有保护作用。实验重复6次，*P＜0.05表示与MCAO组相比差异有统计学意义。
综上所述，脑缺血后应用本发明的寡核苷酸可以明显减轻缺血再灌注引起的脑损伤。因此，以本发明的寡核苷酸为活性成分的药物可以作为神经元保护药物，尤其是与脑卒中等缺血性神经元损伤有关的治疗药物。

Claims (10)

1.一种具有神经保护作用的寡核苷酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的具有神经保护作用的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸经过化学修饰。
3.根据权利要求2所述的具有神经保护作用的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸经过3’端胆固醇修饰，5’端两个硫代骨架修饰，3’端四个硫代骨架修饰，全链甲氧基修饰。
4.一种药物组合物，其特征在于，包含活性成分的权利要求1至3任一项所述的寡核苷酸以及药学上可接受的载体。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药学上可接受的载体选自稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、调味剂、香味剂中的一种或多种。
6.根据权利要求1至3任一项所述的寡核苷酸在制备用于治疗神经系统疾病药物中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的神经系统疾病为与缺血性神经元损伤有关的神经系统疾病。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的神经系统疾病为缺血性脑卒中。
9.根据权利要求1至3任一项所述的寡核苷酸在制备神经元保护药物中的用途。
10.根据权利要求4或5所述的药物组合物在制备用于治疗与缺血性神经元损伤有关的神经系统疾病药物中的用途。
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