CN106540277A - 6‑羟基多巴胺在构建色素脱失模型中的应用及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及6‑OHDA在构建色素脱失模型中的应用，以及一种利用6‑OHDA构建色素脱失模型的方法。本发明公开的6‑OHDA诱导的小鼠表皮色素脱失模型可用于分析色素脱失性疾病(包括但并不特指白癜风)的发病机理及进行治疗该病药物筛选。本发明的有益效果主要体现在：本发明6‑OHDA可成功构建色素脱失模型，可为白癜风基础和临床研究提供潜在的动物模型，为抗氧化药物筛选和抗白癜风药物筛选提供了基础。

Description

6-羟基多巴胺在构建色素脱失模型中的应用及方法

(一)技术领域

本发明涉及6-羟基多巴胺(6-OHDA)在构建色素脱失模型中的应用，以及一种利用6-OHDA构建色素脱失模型的方法。

(二)背景技术

白癜风是由于表皮黑素细胞缺失引起的色素障碍性皮肤病，其发病机制不明确，临床治愈困难。近几年人们对于黑素细胞缺失机制有了新认识：内源性损伤导致了免疫应答，进而引起黑素细胞自毁，引发白癜风(J Invest Dermatol.2005,124(4):798-806.)。氧化应激易引起细胞损伤，在进展期和稳定期的白癜风患者中都发现有氧化-抗氧化失衡的现象，这表明氧化应激对白癜风的发病乃至进展过程中都有重要的影响，而且这些现象的研究已直接引起临床治疗理念的革新，抗氧化治疗已成为白癜风临床治疗新策略。

氧化应激是活性氧分子的产生与生物系统对活性介质的清除能力、对其造成的组织损伤的修复能力之间的平衡被打破的表现。目前已有许多证据支持白癜风患者存在氧化应激：进展期白癜风患者表皮中过氧化氢水平明显升高，伴有多种抗氧化酶表达及活性的降低；白癜风患者皮损区角质形成细胞和非皮损区黑素细胞都存在ROS的聚集和细胞膜过氧化。此外，血液等皮肤外系统中也存在氧化还原的失衡，说明氧化应激在白癜风患者中具有多系统表现。

在众多引起氧化应激的因素中，多巴胺(Dopamine,DA)氧化是近年来发现的针对黑素细胞和DA能神经元的特殊氧化应激形式。近年来的研究表明，DA氧化在帕金森氏病、阿尔茨海默病等神经退行性病变中起重要作用。在黑素细胞黑素合成过程中，酪氨酸在酪氨酸酶催化下氧化为多巴、继续氧化为多巴醌、再与半胱氨酸结合后，氧化聚合为黑色素。另外黑素细胞及角质形成细胞分泌的DA也可被氧化成多巴醌。上述黑素合成过程中大部分为氧化反应，反应过程中会产生大量的氧自由基。目前关于DA的细胞毒性机制主要有：DA在细胞内及细胞外自身氧化产生活性氧簇(ROS)，在单胺氧化酶(MAO)催化下产生的过氧化氢和DA直接阻断线粒体呼吸链。表皮黑素细胞和角质形成细胞都可以自身合成DA，DA可能通过上述机制诱发黑素细胞发生氧化应激(J Dermatol Sci.2007.47(2).141-149)。白癜风患者中DA氧化的现象也非常常见，Iyengar等学者发现白癜风皮损边缘的黑素细胞色素下降，而多巴氧化酶、DA氧化酶活性较正常明显升高(Acta Anat(Basel).1988.133(1).62-65)。Morrone等检测了150名不同病期的白癜风患者24小时尿液，发现进展期患者尿液DA及其代谢产物高香草酸较正常对照有明显的升高，而稳定期患者则与正常对照组无明显区别(Pigment Cell Res.1992.5(2).65-69)。Cucchi等利用高效液相色谱法检测75名不同病期的非节段型白癜风患者血清中高香草酸水平，发现进展期白癜风患者高香草酸水平较稳定期患者明显升高(Pigment Cell Res.2000.13(1).28-32)。Chu等利用不同浓度的DA处理原代黑素细胞，发现DA处理后黑素细胞活力明显下降，细胞内活性氧升高，凋亡增加，并与DA浓度呈明显的正相关，而肾上腺素、去甲肾上腺素等其他儿茶酚胺类物质则没有这样的作用(BrJDermatol.2006.154(6).1071-1079)。Park等发现还原型谷胱甘肽(GSH)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)等能够明显抑制DA对黑素细胞的凋亡诱导作用，而维生素C、维生素E等则作用不明显，并认为DA诱导黑素细胞凋亡与P38和JNK通路激活相关(J Dermatol Sci.2007.47(2).141-149)。

6-OHDA是DA能神经递质的羟基化衍生物，结构与DA类似,不能透过血脑屏障,只有直接脑内给药才能造成CNS神经元损伤。诸多研究表明，6-OHDA可诱导氧化应激，进而导致细胞凋亡和缺失。6-OHDA可以在体外诱导儿茶酚胺能神经元PC12细胞的凋亡，给予6-OHDA后6h内即可检测到黑质神经元凋亡，且随着时间的推移，凋亡细胞数目逐渐增多。帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种以黑质DA能神经元特征性缺失为主要病理改变的神经系统变性性疾病。应用6-OHDA注入黑质纹状体系统来损毁大鼠黑质DA能神经元所制成的模型，已被广泛应用于PD的研究。6-OHDA处理黑素细胞可引起细胞凋亡甚至死亡，而且对表皮中角质形成细胞的活性也有影响。

(三)发明内容

本发明目的是利用6-OHDA进行小鼠皮内注射获得小鼠表皮色素脱失模型，为白癜风基础和临床研究提供潜在的动物模型。

本发明采用的技术方案是：

6-OHDA在构建色素脱失模型中的应用。

所述模型可用于抗氧化药物筛选。

进一步，所述模型可用于治疗白癜风药物筛选。所述模型不仅可应用于白癜风，也可用于其它色素性疾病药物筛选。

本发明还涉及一种利用6-OHDA构建色素脱失模型的方法，所述方法包括：在C57BL/6小鼠臀部皮内注射给药6-羟基多巴胺溶液，6-OHDA每次注射量为15μg/g体重，每天一次，连续注射12～30天，获得色素脱失模型。

所述6-羟基多巴胺溶液由生理盐水为溶剂配制而成，6-羟基多巴胺浓度为200～500mM。

所述溶剂中还可含有L-抗坏血酸，浓度为1g/L。

6-OHDA作为表皮内细胞的氧化应激源，在6-OHDA注射区域周围影响表皮细胞，进而影响黑素细胞生成，表现为毛发变白。本发明公开的6-OHDA诱导的小鼠表皮色素脱失模型可用于分析色素脱失性疾病(包括但并不特指白癜风)的发病机理及进行治疗该病药物筛选。

本发明的有益效果主要体现在：本发明6-OHDA可成功构建色素脱失模型，可为白癜风基础和临床研究提供潜在的动物模型，为抗氧化药物筛选和抗白癜风药物筛选提供了基础。

(四)附图说明

图1为对照组和模型组小鼠毛发观察结果。

图2为模型组脱色区和对照组小鼠皮肤组织黑色素染色结果。

图3为模型组和对照组小鼠表皮组织IL-6基因mRNA表达检测结果。

图4为模型组和对照组小鼠表皮组织p-IKK、p-NF-κB p65表达检测结果。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

1、实验材料

1.1实验动物：清洁级C57BL/6小鼠，雌性，3周龄，15～20g/只，从浙江中医药大学动物实验中心购得。动物随机分为模型组和对照组，其中模型组3只，正常对照组3只。实验动物采用分笼饲养，每笼3只。

1.2基础饲料：小鼠饲料(浙江中医药大学动物实验中心提供)

1.3试剂：6-OHDA(购于美国sigma公司)，生理盐水和Vc溶液购于杭州市第三人民医院药房。将250mg的6-OHDA溶解在4ml的生理盐水-L-抗坏血酸(Vc)溶剂中(0.9％w/v生理盐水-0.1％w/v Vc液)，配制成400mM的母液，避光-20℃保存；

黑色素染色试剂盒购于福州迈新生物技术开发有限公司，小鼠IL-6基因特异性引物(上游引物：5’-CTGCAAGAGACTTCCATCCAG-3’(14-34))，下游引物：5’-AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG-3’(144-122))，小鼠β-actin基因引物(上游引物5’-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3’(854-875)；下游引物5’-GCCGGACTCATCGTACTCC-3’(1098-1080))由上海生工生物工程有限公司合成；总RNA提取试剂盒和cDNA第一链反转录试剂盒购自Takara-宝生物工程(大连)有限公司；荧光定量PCR试剂All-in-One^TM qPCR Mix购自广州复能基因有限公司；RIPA蛋白裂解液购自碧云天生物技术有限公司；核蛋白提取试剂盒购自美国PIERCE公司；p-IKKα/β兔单克隆抗体、IKKα兔单克隆抗体、p-NF-κBp65兔单克隆抗体、NF-κB兔单克隆抗体均购自美国cell signaling技术公司；Histone H1鼠单克隆抗体和β-Actin小鼠单克隆抗体购自美国Santa cruz技术公司；680RD山羊抗鼠抗体，800CW山羊抗兔抗体购自美国LI-COR技术公司；常规生化试剂购自华东生物医药公司。

2、实验材料

2.1小鼠处理：模型组小鼠，以150μg/g体重的剂量皮内注射6-OHDA至小鼠臀部，对照组小鼠，以50μl/g体重的剂量皮内注射生理盐水至小鼠臀部，连续注射30天后，脱颈处死小鼠，进行后续实验。

动物模型的验证方法包括观察动物毛发变化；免疫组织化学检测黑素分布，荧光定量PCR法检测IL-6基因mRNA表达变化，蛋白免疫印迹检测p-IKK和p-NF-κB p65蛋白表达变化。

观察对照组和模型组小鼠毛发，结果见图1。由图可见，对照组小鼠背部无明显白色毛发，注射6-OHDA的模型组小鼠背部可见散在性的白色毛发，如图中箭头所示。

2.2小鼠表真皮分离

颈椎脱臼处死小鼠，逆着毛发生长方向剪掉小鼠背毛，用无菌的解剖工具取下小鼠背部皮肤组织1cm×1cm，真皮面向上至于5cm皿中。将皮肤依次置于5ml碘伏中2min，70％乙醇中1min，70％乙醇中1min，无菌PBS中1min。真皮面向上置于5cm皿中，用无功的解剖刀刮去真皮的脂肪组织和肌肉。加入5ml的0.25％胰酶，使表皮向上悬于胰酶中，4℃过夜或者37℃温育2h后，用眼科镊分离表皮。用于后续实验。

2.3制备石蜡切片

从小鼠新鲜尸体上取下组织块(一般厚度不超过0.5厘米)投入预先配好的10％福尔马林固定液中约24h，取出组织块逐级脱水，从70％乙醇—80％乙醇—90％乙醇—无水乙醇(每级半小时)。然后将其再放置于透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精。将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。先制备好容器(如折叠一小纸盒)，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。冷却凝固成块即成。包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，一般为5-8μm厚。切下的薄片往往皱折，要放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干备用。

2.4黑色素染色检测

黑色素染色参照试剂盒说明书进行，简述如下：甲醛固定的石蜡切片脱蜡到水，蒸馏水洗1次，滴加100μl的硫酸亚铁1小时。蒸馏水洗3次，每次5分钟。滴加100μl的铁氰化钾液处理30分钟，滴加100μl的分化液稍洗。用现配制的酸性品红淮和饱和苦味酸液(1:9)混合后滴加100μl于切片上染1-2分钟。自来水速洗。95％乙醇、无水乙醇脱水，透明、封片，结果见图2。

由图可见，对于注射生理盐水的对照组，在小鼠毛囊内可见明显的墨绿色黑色素分布，与之相比在注射6-OHDA的模型组小鼠毛囊内较少或无明显的墨绿色黑色素分布(如图中箭头所示)。该结果表明小鼠表皮内注射6-OHDA可影响其黑色素的生成。

2.5实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)：

取小鼠分离后的表皮片30mg，参照TaKaRa公司的Total RNA提取试剂说明书，分别加入Total RNA提取试剂在组织研磨器中充分匀浆，转至1.5mL的Eppendorf管中，室温静置5min，加入200μL氯仿，剧烈震荡15s后室温静置5min分层，4℃12000g离心15min，取上层水相于一新的Eppendorf管中，加入400μL异丙醇，混匀后静置10min，4℃12000g离10min，弃上清，沉淀用1mL的75％乙醇洗涤后室温干燥，适量DEPC水溶解用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的提取质量，并用紫外分光光度计测定总RNA浓度和纯度根据样品在260nm波长处的吸光度值确定RNA样品的浓度，以便在反转录的过程中进行定量。

cDNA第一条链合成，用TaKaRa公司的M-MLV反转录酶将总RNA反转录为cDNA具体过程如下：取每个样品总RNA 1μg，oligo(dT)1μL，加入DEPC水至6ul，PCR仪上70℃反应10min，迅速置于冰上冷却，加入5×反应缓冲液5μL，dNTP(10mmol/L)1.25ul，RNA酶抑制剂25U，M-MLV反转录酶(200U/μL)1μL，用DEPC水补至总体积为20μL(以上操作均在冰上进行)稍离心后置于水浴锅上反应，42℃保温60min，70℃灭活15min，将所得cDNA产物置于-20℃保存每个样品都以反转录所得cDNA体积的1/10为模板，用小鼠IL-6基因特异引物扩增(扩增基因部分片段，131bp)，比较不同组织中IL-6基因的表达量，同时以小鼠β-actin基因作为内参照(扩增基因部分片段和，245bp)。以上PCR扩增条件为：94℃4min，94℃10S，60℃20S，72℃15S，40个循环，72℃-95℃,0.5℃/10S，25℃30S。美国Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪检测并分析qPCR实验结果，结果见图3。

由图可见，与注射生理盐水的对照组相比，注射6-OHDA的模型组小鼠表皮内IL-6基因mRNA表达量极显著增加(P<0.05)。该结果表明6-OHDA可促进小鼠表皮内IL-6基因mRNA的表达。

2.6蛋白免疫印迹检测

取小鼠分离后的表皮片30mg，加入100ul的RIPA蛋白裂解液，用匀浆器处理后，4℃，12000rpm离心10min，上清液即为总蛋白，用于检测p-Ikk蛋白、Ikk蛋白及β-Actin蛋白。

取小鼠分离后的表皮片30mg，用胞质胞核蛋白提取方法按照试剂盒说明书操作，细胞去培养液，PBS洗一遍，加胞质裂解液，冰上放置15min，4℃，最大转速离心15min，取上清，为胞质蛋白。胞核蛋白提取法：将上述沉淀加胞核蛋白裂解液，悬浮、混匀冰上放置45min，4℃，12000rpm离心15min，取上清，为胞核蛋白质。胞质+胞核蛋白用于检测NF-κB蛋白，胞核蛋白用于检测p-NF-κB p65蛋白及核内参蛋白Histone H1蛋白。所有提取蛋白参照Bradford法测定蛋白浓度。

每组蛋白上样量50μg进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并转聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜。PVDF膜常温下5％BSA封闭1h后，加入1∶1000稀释的p-IKKα/β兔单克隆抗体、IKKα兔单克隆抗体、p-NF-κB p65兔单克隆抗体、NF-κB兔单克隆抗体、β-Actin或HistoneH1单克隆抗体，室温孵育1h，PBST洗涤3次后加入1∶5000稀释的680RD山羊抗鼠抗体，800CW山羊抗兔抗体，室温下避光孵育30min，PBST洗涤3次，应用LI-COROdyssey红外激光扫描成像系统检测并分析蛋白表达水平，结果见图4。

由图可见，与注射生理盐水的对照组相比，注射6-OHDA的模型组小鼠表皮内p-IKK和p-NF-KB p65蛋白表达水平极显著增加(P<0.05)。该结果表明6-OHDA可促进小鼠表皮内p-IKK和p-NF-KB p65蛋白的表达。

综合以上免疫组织化学染色、荧光定量PCR及蛋白免疫印迹的检测结果，验证了6-OHDA可以用于建立小鼠色素脱失模型。

Claims (6)

1.6-羟基多巴胺在构建色素脱失模型中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述模型用于抗氧化药物筛选。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述模型用于治疗白癜风药物筛选。

4.一种利用6-羟基多巴胺构建色素脱失模型的方法，所述方法包括：在C57BL/6小鼠臀部皮内注射给药6-羟基多巴胺溶液，6-羟基多巴胺每次注射量为15μg/g体重，每天一次，连续注射12～30天，获得色素脱失模型。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述6-羟基多巴胺溶液由生理盐水为溶剂配制而成，浓度为200～500mM。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述溶剂中还含有L-抗坏血酸，浓度为1g/L。