CN106536542A

CN106536542A - 具有改善色素减退及抑制脂肪形成的功效的肽及其的用途

Info

Publication number: CN106536542A
Application number: CN201480078609.9A
Authority: CN
Inventors: 郑镕池; 金银美; 李应智; 曹囧美
Original assignee: Caregen Co Ltd
Current assignee: Caregen Co Ltd
Priority date: 2014-05-13
Filing date: 2014-11-21
Publication date: 2017-03-22
Anticipated expiration: 2034-11-21
Also published as: WO2015174599A1; US10093698B2; JP6530534B2; JP2018150348A; ES2743675T3; JP6352445B2; EP3144316A4; CN106536542B; EP3144316A1; EP3144316B1; JP2017520515A; KR101713127B1; KR20150130615A; US20170051014A1

Abstract

本发明的由序列表中序列1或序列表中序列2的氨基酸序列形成的肽呈现出黑色素生成增加活性及脂肪生成抑制活性。本发明的肽增加作为增加酪氨酸酶的表达的转录因子的小眼相关转录因子和增加小眼相关转录因子的表达的腺苷环磷酸腺苷反应元件结合蛋白的磷酸化，结果，增加酪氨酸酶的表达并最终增加黑色素合成。本发明的肽减少积累在细胞内的脂肪的量并参与脂肪生成机制来减少脂滴包被蛋白及过氧化物酶体增殖物激活受体γ的表达，由此，最终抑制脂肪生成。本发明提供包含上述肽的黑色素色素减退的改善或治疗用组合物及肥胖治疗或预防用药剂学组合物。

Description

具有改善色素减退及抑制脂肪形成的功效的肽及其的用途

技术领域

本专利申请要求于2014年5月13日向韩国专利局提交的韩国专利申请第10-2014-0057189号的优先权，上述专利申请的公开内容以引用的方式并入本说明书中。

本发明涉及改善色素减退及具有抑制脂肪形成功效的肽及其的用途。

背景技术

黑色素在作为表皮内基底层中的色素细胞的黑色素细胞(Melano cyte)中，从酪氨酸经过多巴并借助酪氨酸酶(tyrosinase)生成，在上述黑色素生物合成过程中，除酪氨酸酶之外，还参与酪氨酸酶相关蛋白-1/2(Trp-1/2)(Korner和Pawelek，Science(1982)217:1163-1165；Kobayashi等，EMBO J(1994)13:5818-5825；Yokoyama等，Biochi mBiophys Acta(1994)1217:317-321)，并且，作为酪氨酸酶表达的上游信号，还参与环磷酸腺苷(cAMP，Cyclic Adenosine monophosp hate)和基于上述环磷酸腺苷的细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2，Ex tracellular signal-activated kinases-1/2)的持续活性化(Marshall，Cell(1995)80:179-185；Busca和Ballotti，Pigment Cell(2000)13:60-69)。

黑色素细胞受到紫外线、炎症等的外部条件、促黑素细胞激素(M SH)、促甲状腺激素(TSH)等的激素等多种因子的影响。

黑色素起到通过吸收太阳光中的紫外线及能量来护皮肤深处细胞因紫外线而被损伤的作用，但是，若异常地生产过多黑色素，则会发生如黄褐斑、雀斑、色素沉着等皮肤色素异常沉着症状，相反，若所生产的黑色素过少，则会发生白斑症(vitiligo)、色素脱失斑、白色糠疹(pseudoleucoderma atopicum)、紫癜风(Tinea versicolor)、斑状硬皮病、过敏、炎症后脱色症、特发性滴状色素减退症、色素脱失斑、部分白化病等的黑色素色素减退疾病(Leukoderma)(Bolognia和Paw elek，J Am Acad Dermatol(1988)19:217-255；Pinto和Bolognia，P ediatr Clin North Am(1991)38:991-1017)。

在上述黑色素色素减退疾病中，白斑症为因黑色素细胞被破坏而引起的疾病，其他疾病为因在黑色素细胞中生成的黑色素量的减少而引起的疾病。

作为上述疾病的治疗方法，利用补骨脂素等的光敏剂的光学方法、手术等的外科方法及通过向磷酸盐给药具有生姜、胡椒、黑胡椒成分(Ancient Science of Life，(1990)Vol.IV，No.4，202-206)等和色素细胞的增殖活性或和黑色素生成促进活性的药物来诱导皮肤的重新着色的方法等。

另一方面，肥胖为多种疾病的原因疾病，糖尿病患者的80％、心脏病患者的21％为肥胖的原因，因肥胖引起的社会经济性损失庞大。因此，安全且有效的肥胖治疗剂的开发可减少庞大的社会经济损失。但是，可解决市场状况的医药品局限于食欲抑制剂及脂肪吸收抑制剂，由此无法达到期待值，并存在以下提出的多种副作用。赛尼可(Xenic al，罗氏(Roche))通过抑制在脾脏及消化系统中分泌的脂肪酶来抑制脂肪吸收，但伴随2-3％的低的体重减少效果及频繁的腹泻、脂肪便等副作用。并且，诺美婷(Reductil，雅培(Abbott))通过再次吸收血清素和去甲肾上腺素来抑制食欲，由此存在5-10％的体重减少效果，但是存在中风和心肌梗死等细血管系统疾病的副作用，从而，在2010年，由欧洲药品管理局(EMA)和美国食品药品管理局(FDA)下达了处方和停用及自愿性召回公告，由此，上述药物从市场淘汰，在韩国，在2010年10月由食品药品管理局停止销售。此外，在期间作为抗肥胖药剂而被开发的产品中，因其严重的副作用而被禁止销售的药品数量众多。例如，氨茶碱具有卓越的体脂肪分解效果，但是，存在涉及精神神经系统、循环系统、消化系统等的多种副作用，且氟苯丙胺、右芬氟拉明、托吡酯、麻黄素等也被判定为不适当药物，从而禁止销售。

在说明书全文中，参照了多篇论文及专利文献，并表示了其引用。所引用的论文及专利文献的公开内容全部引用于本说明书作为参照，从而更加明确说明本发明所属技术领域的水平及本发明的内容。

发明内容

技术问题

本发明人员为了开发具有生物学有效活性的肽而努力研究的结果，查明了具有序列表中序列1或序列表中序列2的氨基酸序列的肽具有黑色素形成增加及脂肪生成抑制等优秀生理活性，由此完成了本发明。

因此，本发明的目的在于，提供具有黑色素生长增加活性或脂肪生成抑制活性的肽。

本发明的再一目的在于，提供黑色素色素减退(hypomelanosis)的改善或治疗用组合物。

本发明的另一目的在于，提供肥胖治疗或预防用药剂学组合物。

根据以下发明的详细说明及发明要求保护范围更加明确本发明的其他目的及优点。

解决问题的方案

根据本发明的一实施方式，本发明提供由选自由序列表中序列1及序列表中序列2的氨基酸序列组成的组中的一种氨基酸序列形成的黑色素生成增加活性的肽。

根据本发明的再一实施方式，本发明提供由选自由序列表中序列1及序列表中序列2的氨基酸序列组成的组中的一种氨基酸序列形成的脂肪生成抑制活性的肽。

本发明人员为了开发具有生物学有效活性的肽而努力研究的结果，查明了具有序列表中序列1或序列表中序列2的氨基酸序列的肽具有黑色素形成增加及脂肪生成抑制等优秀生理活性。

本发明的肽包括序列表中序列1或序列表中序列2的氨基酸序列。具体地，本发明的肽必须由序列表中序列1或序列表中序列2的氨基酸序列构成。

根据本发明的一实例，序列表中序列1或序列表中序列2的肽呈现出增加黑色素生成并抑制脂肪生成的活性。

根据本发明的再一实例，本发明的肽作为增加黑色素合成酶(酪氨酸酶)的表达的转录因子的小眼相关转录因子(MITF，Microphthal mia-associated transcriptionfactor)和增加小眼相关转录因子的表达的腺苷环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB，cAMP-responsive element binding protein)的磷酸化，结果，增加酪氨酸酶的表达并最终增加黑色素合成。

根据本发明的另一实例，本发明的肽减少积累在细胞内的脂肪的量并参与脂肪生成机制来减少脂滴包被蛋白(perilipin)及过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisomeproliferator-activated receptor gamm a)的表达，由此，最终抑制脂肪生成。

本说明书所使用的术语“肽”意味着通过肽结合，氨基酸残基相互结合而成的线形分子。本发明的肽可根据本发明所属技术领域中公知的化学合成方法、尤其，固相合成技术(solid-phase synthesis techn iques；Merrifield,J.Amer.Chem.Soc.85:2149-54(1963)；Stewart,et al.,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd.ed.,Pierce Chem.Co.:Rockford,111(1984))或液相合成技术(美国授权专利第5516891号)制备。

根据本发明的一实例，上述肽的N-或C-末端可以与选自由乙酰基、芴甲氧羰基、甲酰基、棕榈酰基、肉豆蔻基、硬脂基及聚乙二醇(PEG)组成的组中的保护基相结合。

上述氨基酸的变形很大程度改善本发明的肽的稳定性。在本说明书中所提及的术语“稳定性”意味着“体内”稳定性，而且还意味着储存稳定性(例如，常温储存稳定性)。上述保护基起到从生物体内的蛋白质切割酶的攻击保护本发明的肽的作用。

根据本发明的另一实施方式，本发明提供包含由选自由上述序列表中序列1及序列表中序列2的氨基酸序列组成的组中的一种氨基酸序列形成的肽作为有效成分的色素减退的改善或治疗用组合物。

本发明的组合物包含上述本发明的由序列表中序列1或序列表中序列2的氨基酸序列形成的肽作为有效成分，因此，为了避免本说明书的过度复杂，将省略对相同内容的记载。

如以下实施例中证实，本发明的由序列表中序列1或序列表中序列2的氨基酸序列形成的肽增加酪氨酸酶的表达来促进黑色素合成，因此对色素减退的治疗或预防极为有效。

本发明的黑色素色素减退疾病改善或治疗用组合物可用于引起黑色素细胞的损失，或者阻碍黑色素生成，由此，黑色素生成无法达到正常水平而引起的所有疾病，例如，可用于白斑症、白化症、色素脱失斑、白色糠疹、紫癜风、炎症后脱色症、斑状硬皮病、部分白化病、特发性滴状色素减退症或点状白斑病。

根据本发明的一实例，本发明的组合物为如下的药剂学组合物，包含：(a)上述本发明的肽的药剂学有效量；以及(b)包含药剂学上接受的载体。

本说明书所使用的术语“药剂学有效量”意味着充分达成上述肽的功效或活性的量。

本发明的药剂学组合物所包含的药剂学上接受的载体为当制剂时所利用的载体，上述载体包含乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但并不局限于此。本发明的药剂学组合物除上述成分之外还可包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、保鲜剂等。药剂学上接受的载体及制剂详细记载于Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed.,1995)。

本发明的药剂学组合物可以口服或非口服给药，优选地，可以非口服给药，在非口服给药的情况下，可通过静脉内注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、局部给药、硬皮给药等方式给药。

本发明的药剂学组合物的适合的给药量可根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病状、食物、给药时间、给药途径、排泄速度及过敏反应性等因素开多种处方。另一方面，优选地，本发明的药剂学组合物的一个给药量为每日0.0001～200μg。

本发明的药剂学组合物通过本发明所属技术领域的普通技术人员可容易实施的方法，利用药剂学上接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化，由此可制成单位容量形态或者可内置于多容量容器内来制备。此时，剂型可以为油或水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态，或者也可以为浸膏剂、粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂或胶(例如，水凝胶)形态，而且还可包含分散剂或稳定剂。

根据本发明的一个实例，本发明的组合物为如下化妆品组合物，包含：(a)上述本发明的肽的化妆品学有效量(cosmetically effective amount)；以及(b)化妆品学上接受的载体。

本说明书所使用的术语“化妆品学有效量”为充分达成上述肽的功效或活性的量。

可利用本发明的化妆品组合物制备在本发明所属技术领域中通常制备剂型，例如，可制备成溶液、悬浮液、乳状液、糊剂、凝胶、乳霜、乳液、粉末、肥皂、含表面活性剂的清洗奶，油，粉状粉底，乳状粉底，蜡状粉底和喷雾等，但并不局限于此。更详细地，可制备成柔性化妆水、营养水、营养霜、按摩霜、精华素、眼霜、清洁霜、洗面奶、卸妆水、面膜、喷雾或粉末的剂型。

在本发明的剂型为糊剂、乳霜或凝胶的情况下，作为载体成分，可利用动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石或氧化锌等。

在本发明的剂型为粉末或喷雾的情况下，作为载体成分，可利用乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉末，尤其，在剂型为喷雾的情况下，还可包含如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚的推进剂。

在本发明的剂型为溶液或乳状液的情况下，作为载体成分，利用溶剂、增溶剂或乳化剂，例如，水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁基二醇油、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇或失水山梨醇脂肪酸酯。

在本发明的剂型为悬浮液的情况下，作为载体成分，可利用如水、乙醇或丙二醇的液状稀释剂、如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯及聚氧乙烯失水山梨醇酯的悬浮剂、微晶纤维素、甲基氢氧化铝、膨润土、琼脂或黄芪胶等。

在本发明的剂型为含表面活性剂的清洗奶的情况下，作为载体成分，可利用脂肪族醇硫酸酯、脂肪族醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸盐、咪唑鎓衍生物，甲基牛磺酸、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰氨基甜菜碱、脂肪族醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等。

本发明的化妆品组合物所包含的成分可包含除作为有效成分的肽和载体成分之外，可包含通常用于化妆品组合物的成分，例如，抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、颜料和香料的普通辅助剂。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供包含由选自由上述序列表中序列1及序列表中序列2的氨基酸序列组成的组中的一种氨基酸序列形成的肽作为有效成分的肥胖治疗或预防用药剂学组合物。

本发明的组合物包含上述本发明的肽作为有效成分，因此，为了避免本说明书的过度复杂，将省略对相同内容的说明。

本发明所使用的术语“肥胖”意味着体内过度积累体脂肪的情况。

如以下实施例中证实，本发明的由序列表中序列1或序列表中序列2的氨基酸序列形成的肽减少积累在细胞内的脂肪并减少参与脂肪合成的基因(例如，脂滴包被蛋白、过氧化物酶体增殖物激活受体γ)的表达。因此，本发明的组合物可有效地对肥胖产生影响。

根据本发明的一个实例，本发明的组合物减少细胞内积累的脂肪并减少参与脂肪合成的基因(例如，脂滴包被蛋白、过氧化物酶体增殖物激活受体γ)的表达。因此，本发明的组合物对肥胖的治疗或预防极为有效。

根据本发明的还有一实施方式，本发明提供包括由将包含由序列表中序列1或序列表中序列2的氨基酸序列形成的肽作为有效成分的组合物给药到对象中的步骤的黑色素色素减退的改善或治疗方法。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供将包含由序列表中序列1或序列表中序列2的氨基酸序列形成的肽作为有效成分的组合物给药到对象中的步骤的肥胖预防或治疗方法。

本发明的黑色素色素减退的改善或治疗方法及肥胖预防或治疗方法利用上述组合物来实施，为了避免本说明书的过度复杂，将省略记载两者之间的共同内容。

发明的效果

归纳本发明的特征及优点如下：

(i)本发明的由序列表中序列1或序列表中序列2的氨基酸序列形成的肽呈现出黑色素生成增加活性及脂肪生成抑制活性。

(ii)本发明的肽增加作为增加酪氨酸酶的表达的转录因子的小眼相关转录因子和增加小眼相关转录因子的表达的腺苷环磷酸腺苷反应元件结合蛋白的磷酸化，结果，增加酪氨酸酶的表达并最终增加黑色素合成。

(iii)本发明的肽减少积累在细胞内的脂肪的量并参与脂肪生成机制来减少脂滴包被蛋白及过氧化物酶体增殖物激活受体γ的表达，由此，最终抑制脂肪生成。

(iv)本发明提供包含上述肽的黑色素色素减退的改善或治疗用组合物及肥胖治疗或预防用药剂学组合物。

附图说明

图1a及图1b为测定本发明的肽的黑色素细胞中的黑色素生成量变化的曲线图。

图2a及图2b为通过蛋白质印迹法测定本发明的肽的黑色素生成信号传递物质的表达变化的结果。

图3a及图3b为通过逆转录聚合酶链反应测定本发明的肽的黑色素生成信号传递物质的表达变化的结果。

图4a及图4b为通过蛋白质印迹法测定本发明的肽的酪氨酸酶的蛋白质表达水平的结果。

图5a及图5b为测定本发明的肽的脂肪细胞中的中性脂肪量变化的结果。

图6a及图6b为通过逆转录聚合酶链反应测定本发明的肽的脂肪生成相关基因的表达程度的结果。

具体实施方式

以下，通过实施例，更加详细说明本发明。这些实施例仅用于更加具体说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围并不局限于这些实施例，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。

实施例

合成例1：肽合成

将700mg的氯三苯甲基氯树脂(Chloro trityl chloride resin；CT L resin，Nova biochem Cat No.01-64-0021)放入反应容器并添加10ml的二氯甲烷(MC)后搅拌3分钟。去除溶液并放入10ml的二甲基甲酰胺(DMF)后搅拌3分钟之后再次去除溶剂。向反应容器放入10ml的二氯甲烷溶液并放入200mmole的Fmoc-Cys-OH(Bachem，Swis s)及400mmole的二异丙基乙胺(DIEA)后进行搅拌并使其充分溶解，而且进行1小时的搅拌并使其发生反应。反应之后进行洗涤，使甲醇和二异丙基乙胺(2:1)溶解在二氯甲烷(DCM，dichloromethane)并使其反应10分钟，且用过量的二氯甲烷/二甲基甲酰胺(1:1)进行洗涤。去除溶液并放入10ml的二甲基甲酰胺后搅拌3分钟之后再次去除溶剂。将10ml的脱保护溶液(20％的哌啶(Piperidine)/二甲基甲酰胺)放入反应容器之后，在常温下搅拌10分钟之后去除溶液。放入相同量的脱保护溶液并再次维持反应10分钟之后去除溶液，并分别用二甲基甲酰胺进行两次、用二氯甲烷进行一次、用二甲基甲酰胺进行一次洗涤，且每次洗涤进行3分钟，由此制作Cys-CTL树脂(Resin)。在新的反应容器放入10ml的二甲基甲酰胺溶液并放入200mmole的F moc-Ala(Bachem，Swiss)、200mmole的1-羟基苯并三唑(HoBt)及200mmole的苯并三氮唑-1-基氧基三(Bop)之后进行搅拌并使其充分溶解。将400mmole的二异丙基乙胺分两次放入反应容器之后，直到固体均溶解，至少搅拌5分钟。将溶解的氨基酸混合溶液放入具有经脱保护的树脂的反应容器之后，在常温下搅拌1小时并使其进行反应。去除反应液并用二甲基甲酰胺溶液搅拌三次，且每次搅拌五分钟，之后去除二甲基甲酰胺溶液。采取少量反应树脂并通过茚三酮试验(Nih ydrin Test)检验了反应程度。如上所述，用脱保护溶液进行两次脱保护反应来制备Ala-Cys-CTL树脂。用二甲基甲酰胺和二氯甲烷充分进行洗涤之后，再次执行一次茚三酮试验之后，如上所述，执行了以下的氨基酸附着实验。按照选定的氨基酸序列，按Fmoc-Ser(tBu)、F moc-Arg(pbf)、Fmoc-Phe、Fmoc-Phe、Fmoc-Arg(pbf)、Fmoc-Cy s(Trt)及Fmoc-Gln(Trt)的顺序进行了连锁反应。用脱保护溶液，使Fmoc-保护基进行两次反应，且每次反应执行10分钟之后，通过进行洗涤来去除上述脱保护溶液。放入无水醋酸和二异丙基乙胺、1-羟基苯并三唑并执行1小时乙酰化之后用二甲基甲酰胺、二氯甲烷及甲醇分别对所制备的肽树脂进行三次洗涤，通过使氮气缓慢地流通来进行干燥之后，在P205的条件下进行真空减压来使其完全干燥之后，放入30ml的脱漏溶液(81.5％的三氟乙酸(Trifluroacetic acid)、5％的蒸馏水、5％的茴香硫醚(Thioanisole)、5％的苯酚(Phenol)、2.5％的1,2-乙二硫醇(EDT)及1％的三异丙基硅烷(TIS))，且在常温条件下，偶尔进行摇动并维持2小时反应。通过进行过滤来筛选树脂，用少量的三氟乙酸(TFA)溶液对树脂进行洗涤之后与使其母液相混合。利用减压的方式使整体体积保留一半左右，添加50ml的冷乙醚来诱导沉淀之后，进行离心分离来聚集沉淀，且还用冷乙醚进行了两次洗涤。去除母液，在氮的条件下使其充分干燥，由此合成了0.75g的纯化前N H₂-Gln-Cys-Arg-Phe-Phe-Arg-Ser-Ala-Cys-COOH肽1(产率：86.5％)，并通过相同方法合成了0.70g的NH₂-Tyr-Cys-Arg-Phe-Phe-Asn-Ala-Phe-Cys-COOH肽2。当利用分子量测定仪进行测定时，肽1的分子量为1117.0(理论值：1117.3)，肽2的分子量为1168.1(理论值：1168.3)。

表1

实施例1：测定黑色素生成量

在6孔培养板，在37℃的温度下，在培养基培养24小时黑色素形成细胞(B16F10细胞株)之后，去除各个板的培养基并用新的培养基进行更换之后，按浓度对具有序列表中序列1或序列表中序列2的氨基酸序列的本发明的肽进行处理。在培养72小时之后，去除培养液并获取细胞之后，将上述细胞移动到1.5ml的培养管，并在13000rpm的条件下，进行3分钟的离心分离来去除上层液，回收细胞团并测定黑色素。向细胞团放入150μl的2M的NaOH，并在60℃的温度下，使细胞内黑色素溶解30分钟，。在96孔板的各个孔放入100μl的经溶解获得的上层液，并在490nm的条件下测定吸光度。

在小鼠黑色素形成细胞B16F10，当按浓度对本发明的肽进行处理并培养72小时时，观察到了浓度依赖性黑色素形成的增加(图1a及图1b)。

实施例2：观察黑色素形成信号传递物质

在6孔培养板培养24小时黑色素形成细胞(B16F10细胞株)之后，按浓度对本发明的肽进行处理。培养细胞6小时至24小时之后，使细胞溶解，并通过利用各个特异性抗体的蛋白质印迹法观察作为参与黑色素形成的信号传递物质的腺苷环磷酸腺苷反应元件结合蛋白的磷酸化和小眼相关转录因子的表达。利用磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白抗体(Santa Cruz Biotechnology，美国)和小眼相关转录因子抗体(Santa CruzBiotechnology，美国)进行了实验。

在小鼠黑色素形成细胞B16F10，分别对具有序列表中序列1或序列表中序列2的氨基酸序列的肽进行处理，当按时间观察黑色素生成信号传递物质的表达变化时，确认了作为增加黑色素形成酶的表达的转录因子的小眼相关转录因子或增加小眼相关转录因子的表达的腺苷环磷酸腺苷反应元件结合蛋白的磷酸化水平的增加(图2a及图2b)。

实施例3：观察黑色素形成酶基因水平变化

在6孔培养板培养24小时黑色素形成细胞(B16F10细胞株)之后，按浓度对本发明的肽进行处理。培养24小时之后获取细胞，并利用对于作为参与黑色素形成酶的酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白1的各个特异性引物来通过逆转录聚合酶链反应观察表达。

用于参与黑色素形成的酶的聚合酶链式反应(PCR)的靶特异性引物序列如下：酪氨酸酶正向引物序列，5'-GGCCAGCTTTCAGGCAGAGG-3’及酪氨酸酶反向引物，5'-TGGTGCTTCATGGGCAAAAT-3’(退火温度，51℃)；酪氨酸酶相关蛋白1正向引物序列，5'-CCGAAACACAGTGGAAGGTT-3’及酪氨酸酶相关蛋白1反向引物，5'-TCTGTGAAGGTGTGCAGGAG-3’(退火温度，60℃)。

在小鼠黑色素形成细胞B16F10，分别对具有序列表中序列1或序列表中序列2的氨基酸序列的肽进行处理，当按时间观察作为参与黑色素形成的酶的酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白1基因的表达状态时，当进行6小时、24小时处理时，与对照组相比，确认了表达的增加(图3a及图3b)。

实施例4：观察黑色素形成酶蛋白质水平变化

在6孔培养板培养24小时黑色素形成细胞(B16F10细胞株)之后，按浓度对本发明的肽进行处理。在培养24小时之后，使细胞溶解，并通过利用特异性抗体的蛋白质印迹法观察作为参与黑色素形成的核心酶的酪氨酸酶的表达。利用酪氨酸酶抗体(Santa CruzBiotechnology，美国)进行了实验。

在小鼠黑色素形成细胞B16F10，分别对具有序列表中序列1或序列表中序列2的氨基酸序列的肽进行处理，当按时间观察作为参与黑色素形成的酶的酪氨酸酶蛋白质的表达状态时，当进行6小时、24小时处理时，与对照组相比，确认了表达的增加(图4a及图4b)。

实施例5：测定中性脂肪量

在24孔培养板培养48小时脂肪前驱细胞(3T3-L1细胞株)之后，与分化组合物(0.5mM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、0.25mM的地塞米松、10mg/ml的胰岛素)一同按浓度对本发明的肽进行处理并培养7日。

获取细胞之后，放入溶解缓冲液(50mM的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、150mM的NaCl、1％的聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、蛋白质分解酶抑制剂)并在冰块中保管30分钟。在4℃的温度下，用14000g进行10分钟离心分离之后，收集包括油层的上层液并添加甘油三酯试剂，且在37℃的培养基反应5分钟之后，在540nm的条件下测定了吸光度来测定中性脂肪量。

在脂肪前驱细胞3T3-L1，分别对分化诱导物质及具有序列表中序列1或序列表中序列2的氨基酸序列的肽进行处理并培养7日时，在形成脂肪之前被抑制，由此，与对照组相比，确认了作为积累在细胞内的脂肪的甘油三酯的数值以浓度依赖性的方式减少(图5a及图5b)。

实施例6：观察脂肪生成相关基因变化

在6孔培养板培养脂肪前驱细胞(3T3-L1细胞株)48小时之后，与分化组合物(0.5mM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、0.25mM的地塞米松、10mg/ml的胰岛素)一同按浓度本上述对进行处理并培养7日。培养后，利用对作为参与脂肪生成机制的基因的脂滴包被蛋白和过氧化物酶体增殖物激活受体γ的特异引物进行逆转录聚合酶链反应。确认脂滴包被蛋白和过氧化物酶体增殖物激活受体γ的mRNA值是否被抑制。

参与脂肪生成机制的酶的聚合酶链式反应所利用的靶特异性引物序列如下：脂滴包被蛋白正向引物序列，5'-AAGGATCCTGCACCTCACAC-3’及脂滴包被蛋白反向引物，'-CCTCTGCTGAAGGGTTATCG-3’(退火温度，60℃)；过氧化物酶体增殖物激活受体γ正向引物序列，5'-TTTTCAAGGGTGCCAGTTTC-3’及过氧化物酶体增殖物激活受体γ反向引物，5'-AATCCTTGGCCCTCTGAGAT-3’(退火温度，60℃)。

在脂肪前驱细胞3T3-L1，分别对分化诱导物质及具有序列表中序列1或序列表中序列2的氨基酸序列的肽进行处理并培养7日时，与对照组相比，作为参与脂肪形成机制的物质的脂滴包被蛋白和过氧化物酶体增殖物激活受体γ的基因表达有所减少(图6a及图6b)。

以上，详细记述了本发明的特定部分，对本发明所属技术领域的普通技术人员来说，这种具体的记述只是一实例，本发明的范围并不局限于上述实例。因此，本发明的实际范围通过发明要求保护范围及其的等同技术方案定义。

序列表

<110> Caregen Co. Ltd.

<120> 具有改善色素减退及抑制脂肪形成的功效的肽及其的用途

<130> PP140060

<150> KR 2014/0057189

<151> 2014-05-13

<160> 10

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽1

<400> 1

Gln Cys Arg Phe Phe Arg Ser Ala Cys

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽2

<400> 2

Tyr Cys Arg Phe Phe Asn Ala Phe Cys

1 5

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 酪氨酸酶正向引物

<400> 3

ggccagcttt caggcagagg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 酪氨酸酶反向引物

<400> 4

tggtgcttca tgggcaaaat 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TRP1正向引物

<400> 5

ccgaaacaca gtggaaggtt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TRP1反向引物

<400> 6

tctgtgaagg tgtgcaggag 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脂滴包被蛋白正向引物

<400> 7

aaggatcctg cacctcacac 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 脂滴包被蛋白反向引物

<400> 8

cctctgctga agggttatcg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PPARγ正向引物

<400> 9

ttttcaaggg tgccagtttc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PPARγ反向引物

<400> 10

aatccttggc cctctgagat 20

Claims

1.一种肽，其特征在于，由选自由序列表中序列1及序列表中序列2的氨基酸序列组成的组中的一种氨基酸序列形成，具有黑色素生成增加活性。

2.根据权利要求1所述的肽，其特征在于，上述肽具有增加小眼相关转录因子的表达及腺苷环磷酸腺苷反应元件结合蛋白的磷酸化的活性。

3.根据权利要求1所述的肽，其特征在于，上述肽具有增加酪氨酸酶的表达的活性。

4.一种肽，其特征在于，由选自由序列表中序列1及序列表中序列2的氨基酸序列组成的组中的一种氨基酸序列形成，具有脂肪生成抑制活性。

5.根据权利要求4所述的肽，其特征在于，上述肽具有减少积累在细胞内的脂肪的活性。

6.根据权利要求4所述的肽，其特征在于，上述肽具有减少脂滴包被蛋白及过氧化物酶体增殖物激活受体γ的表达的活性。

7.一种黑色素色素减退改善或治疗用组合物，其特征在于，包含权利要求1至3中任一项所述的肽作为有效成分。

8.根据权利要求7所述的黑色素色素减退改善或治疗用组合物，其特征在于，上述色素减退为白斑症、白化症、色素脱失斑、白色糠疹、紫癜风、炎症后脱色症、斑状硬皮病、部分白化病、特发性滴状色素减退症或点状白斑病。

9.一种肥胖治疗或预防用药剂学组合物，其特征在于，包含权利要求4至6中任一项所述的肽作为有效成分。

10.一种黑色素色素减退的改善或治疗方法，其特征在于，包括将包含权利要求1至3中任一项所述的肽作为有效成分的组合物给药到对象中的步骤。

11.一种肥胖预防或治疗方法，其特征在于，包括将包含权利要求4至6中任一项所述的肽作为有效成分的组合物给药到对象中的步骤。