JP6352445B2

JP6352445B2 - 低色素症の改善及び脂肪形成抑制効能を有するペプチド及びその用途

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Publication number: JP6352445B2
Application number: JP2016565255A
Authority: JP
Inventors: チョン・ヨンジ; キム・ウンミ; リ・ウンジ; チョ・ギョンミ
Original assignee: Caregen Co Ltd
Current assignee: Caregen Co Ltd
Priority date: 2014-05-13
Filing date: 2014-11-21
Publication date: 2018-07-04
Anticipated expiration: 2034-11-21
Also published as: WO2015174599A1; US10093698B2; JP6530534B2; JP2018150348A; ES2743675T3; CN106536542A; EP3144316A4; CN106536542B; EP3144316A1; EP3144316B1; JP2017520515A; KR101713127B1; KR20150130615A; US20170051014A1

Description

本願は、２０１４年５月１３日付で大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０−２０１４−００５７１８９号に対して優先権を主張し、前記特許出願の開示事項は、本明細書に参考として組み込まれる。

本発明は、低色素症の改善及び脂肪形成抑制効能を有するペプチド及びその用途に関する。

メラニンは、表皮内の基底層に存在する色素細胞であるメラニン細胞（Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）でチロシンからドーパを経てチロシナーゼ（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）によって生成されるが、このようなメラニン生合成過程には、チロシナーゼ以外にも、Ｔｒｐ−１／２（チロシナーゼ関連タンパク質−１／２）が関与すると知られており（非特許文献１〜３）、またチロシナーゼ発現の上位信号としては、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）と、それによるＥＲＫ１／２（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌ−ａｃｔｉｖａｔｅｄｋｉｎａｓｅｓ−１／２）の持続的な活性化が関与すると知られている（非特許文献４〜５）。

メラニン細胞は、紫外線、炎症などの外部条件、ＭＳＨ（メラニン細胞刺激ホルモン）、ＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン）などのホルモンなどさまざまな因子の影響を受ける。

メラニンは、日光のうち、紫外線の光エネルギーを吸収して皮膚の深いところにある細胞を、紫外線による損傷から保護する役割を行うが、メラニンが非正常に過剰生産されれば、シミ、雀斑、色素沈着のような皮膚色素異常沈着症状が発生し、逆に、少なく生産されれば、白斑症（ｖｉｔｉｌｉｇｏ）、脱色素性母斑、白色粃糠疹（ｐｓｅｕｄｏｌｅｕｃｏｄｅｒｍａａｔｏｐｉｃｕｍ）、癜風（Ｔｉｎｅａｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、斑状強皮症、アレルギー、炎症後脱色症、特発性滴状低色素症、脱色素性母斑、部分的白皮症などのメラニン低色素症疾患（Ｌｅｕｋｏｄｅｒｍａ）が発生する（非特許文献６〜７）。

前記メラニン低色素症疾患のうち、白斑症は、メラニン細胞が破壊されて発病する疾患であり、残りの疾患は、メラニン細胞から生成されるメラニン量の減少によって発病する疾患である。

前記疾患の治療法としては、ソラレンなどの光増感剤を用いた光化学的方法、手術などの外科的方法、そして、フォースに、生姜、ピッパリー、黒いコショウの成分（非特許文献８）などメラニン細胞の増殖活性やメラニン生成促進活性を有した薬物投与によって皮膚の再着色を誘導する方法などがある。

一方、肥満は、多様な疾病の原因疾患であって、糖尿病患者の８０％、心臓疾患者の２１％が肥満が原因であり、肥満による社会経済的損失が莫大である。したがって、安全かつ効果的な肥満治療剤の開発は、莫大な社会経済的損失を減らしうる。しかし、市場状況を解決することができる医薬品は、食欲抑制剤及び脂肪吸収抑制剤に限っており、期待に及ばず、下記に提示された多様な副作用が存在する。ゼニカル（ロシュ）は、膵腸及び消化系から分泌されるリパーゼ抑制を誘導して脂肪吸収を抑制するが、２〜３％の低い体重減量効果及び頻繁な下痢、脂肪便など副作用を伴う。また、リダクティル（エボト）は、セロトニンとノルアドレナリンの再吸収抑制を通じて食欲を抑制させるが、５〜１０％の体重減量効果があるが、脳卒中と心筋梗塞など心血関係疾患の副作用があって、２０１０年ヨーロッパ医薬品庁（ＥＭＡ）と米国食品医薬品局（ＦＤＡ）とが処方と使用中止及び自発的回収勧告措置を下して市場から退出され、韓国国内では、２０１０年１０月食品医薬品安全庁によって販売が中断された。それ以外にも、その間に、抗肥満薬剤として開発された製品中には、深刻な副作用によって販売が禁止されたものも相当数に至る。例えば、アミノフィリンは、卓越した体脂肪の分解効果にも拘らず、精神神経系、循環器系、消化器系にわたって幅広い副作用が報告されたことがあり、フェンフルラミン、デクスフェンフルラミン、トピラマート、エフェドリンなども肥満治療の不適合薬物として判定されて販売が禁止された。

本明細書の全般に亘って多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照して挿入されて、本発明が属する技術分野のレベル及び本発明の内容がより明確に説明される。

ＫｏｒｎｅｒとＰａｗｅｌｅｋ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８２）２１７：１１６３−１１６５Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、ＥＭＢＯＪ（１９９４）１３：５８１８−５８２５Ｙｏｋｏｙａｍａら、ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ（１９９４）１２１７：３１７−３２１Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｃｅｌｌ（１９９５）８０：１７９−１８５ＢｕｓｃａとＢａｌｌｏｔｔｉ，ＰｉｇｍｅｎｔＣｅｌｌ（２０００）１３：６０−６９ＢｏｌｏｇｎｉａとＰａｗｅｌｅｋ，ＪＡｍＡｃａｄＤｅｒｍａｔｏｌ（１９８８）１９：２１７−２５５ＰｉｎｔｏとＢｏｌｏｇｎｉａ，ＰｅｄｉａｔｒＣｌｉｎＮｏｒｔｈＡｍ（１９９１）３８：９９１−１０１７ＡｎｃｉｅｎｔＳｃｉｅｎｃｅｏｆＬｉｆｅ，（１９９０）Ｖｏｌ．ＩＶ，Ｎｏ．４，２０２−２０６

本発明者らは、生物学的に有効な活性を有する優れたペプチドを開発するために努力した結果、配列表の配列番号１または配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチドが、メラニン形成増加及び脂肪生成抑制など優れた生理活性を有するということを究明することによって、本発明を完成した。

したがって、本発明の目的は、メラニン生成増加活性または脂肪生成抑制活性を有するペプチドを提供することである。

本発明の他の目的は、メラニン低色素症（ｈｙｐｏｍｅｌａｎｏｓｉｓ）の改善または治療用組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、肥満の治療または予防用薬剤学的組成物を提供することである。

本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面によってより明確になる。

本発明の一態様によれば、本発明は、配列表の配列番号１及び配列表の配列番号２のアミノ酸配列で構成された群から選択される１種のアミノ酸配列からなるメラニン生成増加活性を有するペプチドを提供する。

本発明の他の一態様によれば、本発明は、配列表の配列番号１及び配列表の配列番号２のアミノ酸配列で構成された群から選択される１種のアミノ酸配列からなる脂肪生成抑制活性を有するペプチドを提供する。

本発明者らは、生物学的に有効な活性を有する優れたペプチドを開発するために努力した結果、配列表の配列番号１または配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチドが、メラニン形成増加及び脂肪生成抑制など優れた生理活性を有するということを究明した。

本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（ｉ）本発明の配列表の配列番号１または配列表の配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドは、メラニン生成増加活性及び脂肪生成抑制活性を示す。
（ｉｉ）本発明のペプチドは、チロシナーゼの発現を増加させる転写因子であるＭＩＴＦとＭＩＴＦの発現を増加させるＣＲＥＢのリン酸化を増加させて、結果的に、チロシナーゼの発現を増加させ、究極的にメラニン合成を増加させる。
（ｉｉｉ）本発明のペプチドは、細胞内に蓄積された脂肪の量を減少させ、脂肪生成機転に関与するペリリピン及びＰＰＡＲγの発現を減少させることによって、究極的に脂肪生成を抑制する。
（ｉｖ）本発明は、前述したペプチドを含むメラニン低色素症の改善または治療用組成物、及び肥満の治療または予防用薬剤学的組成物を提供する。

本発明のペプチドによるメラニン細胞でのメラニン生成量の変化を測定したグラフである。本発明のペプチドによるメラニン細胞でのメラニン生成量の変化を測定したグラフである。本発明のペプチドによるメラニン生成信号伝達物質の発現変化をウェスタンブロットで測定した結果である。本発明のペプチドによるメラニン生成信号伝達物質の発現変化をウェスタンブロットで測定した結果である。本発明のペプチドによるメラニン生成信号伝達物質の発現変化をＲＴ−ＰＣＲで測定した結果である。本発明のペプチドによるメラニン生成信号伝達物質の発現変化をＲＴ−ＰＣＲで測定した結果である。本発明のペプチドによるチロシナーゼのタンパク質発現レベルをウェスタンブロットで測定した結果である。本発明のペプチドによるチロシナーゼのタンパク質発現レベルをウェスタンブロットで測定した結果である。本発明のペプチドによる脂肪細胞での中性脂肪量の変化を測定した結果である。本発明のペプチドによる脂肪細胞での中性脂肪量の変化を測定した結果である。本発明のペプチドによる脂肪生成関連遺伝子の発現程度をＲＴ−ＰＣＲで測定した結果である。本発明のペプチドによる脂肪生成関連遺伝子の発現程度をＲＴ−ＰＣＲで測定した結果である。

本発明のペプチドは、配列表の配列番号１または配列表の配列番号２のアミノ酸配列を含む。具体的には、本発明のペプチドは、配列表の配列番号１または配列表の配列番号２のアミノ酸配列で必須的に構成されている。

本発明の一具現例によれば、配列表の配列番号１または配列表の配列番号２のペプチドは、メラニン生成を増加させ、脂肪生成を抑制する活性を示す。

本発明の他の具現例によれば、本発明のペプチドは、メラニン合成酵素（チロシナーゼ）の発現を増加させる転写因子であるＭＩＴＦ（Ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ）とＭＩＴＦの発現を増加させるＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）のリン酸化を増加させて、結果的に、チロシナーゼの発現を増加させ、究極的にメラニン合成を増加させる。

本発明の他の具現例によれば、本発明のペプチドは、細胞内に蓄積された脂肪の量を減少させ、脂肪生成機転に関与するペリリピン（ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ）及びＰＰＡＲγ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒｇａｍｍａ）の発現を減少させることによって、究極的に脂肪生成を抑制する。

本明細書で使われる用語“ペプチド”は、ペプチド結合によってアミノ酸残基が互いに結合されて形成された線形の分子を意味する。本発明のペプチドは、当業者に公知の化学的合成方法、特に、固相合成技術（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−５４（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔ，ｅｔａｌ．，ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ．ｅｄ．，ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍ．Ｃｏ．：Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，１１１（１９８４））または液相合成技術（ＵＳ登録特許第５，５１６，８９１号）によって製造可能である。

本発明の一具現例によれば、前記ペプチドのＮまたはＣ末端は、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で構成された群から選択される保護基が結合されうる。

前述したアミノ酸の変形は、本発明のペプチドの安定性を大きく改善する作用を行う。本明細書で言及される用語“安定性”は、“インビボ”安定性だけではなく、保存安定性（例えば、常温保存安定性）も意味する。前述した保護基は、生体内のタンパク質切断酵素の攻撃から本発明のペプチドを保護する作用を行う。

本発明の他の態様によれば、本発明は、前述した配列表の配列番号１及び配列表の配列番号２のアミノ酸配列で構成された群から選択される１種のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む低色素症の改善または治療用組成物を提供する。

本発明の組成物は、前述した本発明の配列表の配列番号１または配列表の配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含むために、共通した内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。

下記の実施例から立証されたように、本発明の配列表の配列番号１または配列表の配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドは、チロシナーゼの発現を増加させて、メラニン合成を促進させるために、低色素症の治療または予防に非常に有効である。

本発明のメラニン低色素症疾患の改善または治療用組成物は、メラニン細胞の損失が原因となるか、メラニン生成阻害が原因となって、メラニン生成が正常レベルに至ることができなくて発生するあらゆる疾患に使われるが、例えば、白斑症、白色症、脱色素性母斑、白色粃糠疹、癜風、炎症後脱色症、斑状強皮症、部分的白皮症、特発性滴状低色素症、または点状白皮症などに使われる。

本発明の一具現例によれば、本発明の組成物は、（ａ）前述した本発明のペプチドの薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物である。

本明細書で、用語“薬剤学的有効量”は、前述したペプチドの効能または活性を果たすのに十分な量を意味する。

本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微小結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含みうる。適した薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈｅｄ．，１９９５）に詳しく記載されている。

本発明の薬剤学的組成物は、経口または非経口、望ましくは、非経口投与し、非経口投与である場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、局所投与、経皮投与などで投与することができる。

本発明の薬剤学的組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって多様に処方されうる。一方、本発明の薬剤学的組成物の望ましい投与量は、１日当たり０．０００１〜２００μｇである。

本発明の薬剤学的組成物は、当業者が容易に実施することができる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／または賦形剤を用いて製剤化することによって、単位容量の形態で製造されるか、または多容量容器内に内入させて製造可能である。この際、剤型は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、または乳液の形態であるか、エクストラクト剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、またはゲル（例えば、ヒドロゲル）の形態でもあり得るが、分散剤または安定化剤をさらに含みうる。

本発明の一具現例によれば、本発明の組成物は、（ａ）前述した本発明のペプチドの化粧品学的有効量（ｃｏｓｍｅｔｉｃａｌｌｙｅｆｆｅｃｔｉｖｅａｍｏｕｎｔ）；及び（ｂ）化粧品学的に許容される担体を含む化粧品組成物である。

本明細書で、用語“化粧品学的有効量”は、前述したペプチドの効能または活性を果たすのに十分な量を意味する。

本発明の化粧品組成物は、当業者に通常製造される如何なる剤型にも製造可能であり、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤−含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション、及びスプレーなどに剤型化されうるが、これらに限定されるものではない。より詳細には、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレーまたはパウダーの剤型に製造可能である。

本発明の剤型が、ペースト、クリームまたはゲルである場合には、担体成分として、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルクまたは酸化亜鉛などが用いられうる。

本発明の剤型が、パウダーまたはスプレーである場合には、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムまたはポリアミドパウダーが用いられ、特に、スプレーである場合には、さらにクロロフルオロハイドロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルのような推進体を含みうる。

本発明の剤型が、溶液または乳濁液である場合には、担体成分として、溶媒、溶解化剤または乳濁化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタンの脂肪酸エステルがある。

本発明の剤型が、懸濁液である場合には、担体成分として、水、エタノールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガまたはトラガントなどが用いられうる。

本発明の剤型が、界面−活性剤含有クレンジングである場合には、担体成分として、脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホスクシン酸モノエステル、イセチオン酸、イミダゾリウム誘導体、メチルタウリン、サルコシン酸、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体またはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが用いられうる。

本発明の化粧品組成物に含まれる成分は、有効成分としてのペプチドと担体成分の以外に、化粧品組成物に通用される成分を含み、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料、及び香料のような通常の補助剤を含みうる。

本発明の他の態様によれば、本発明は、前述した配列表の配列番号１及び配列表の配列番号２のアミノ酸配列で構成された群から選択される１種のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む肥満の治療または予防用薬剤学的組成物を提供する。

本発明の組成物は、前述した本発明のペプチドを有効成分として含むために、共通した内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。

本明細書で使われる用語“肥満”は、体内に体脂肪が過度に蓄積されることを意味する。

下記の実施例から立証されたように、本発明の配列表の配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドは、細胞内に蓄積された脂肪を減少させ、脂肪合成に関与する遺伝子（例えば、ペリリピン、ＰＰＡＲγ）の発現を減少させる。したがって、本発明の組成物は、肥満に効果的に促進させることができる。

本発明の一具現例によれば、本発明の組成物は、細胞内に蓄積された脂肪を減少させ、脂肪合成に関与する遺伝子（例えば、ペリリピン、ＰＰＡＲγ）の発現を減少させる。したがって、本発明の組成物は、肥満の治療または予防に非常に有効である。

本発明の他の態様によれば、本発明は、有効成分として配列表の配列番号１または配列表の配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを含む組成物を対象に投与する段階を含むメラニン低色素症の改善または治療方法を提供する。

本発明の他の態様によれば、本発明は、有効成分として配列表の配列番号１または配列表の配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを含む組成物を対象に投与する段階を含む肥満の予防または治療方法を提供する。

本発明のメラニン低色素症の改善または治療方法、及び肥満の予防または治療方法は、前述した組成物を用いて実施するものであって、この２つの間の共通した内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって、本発明の範囲が、これら実施例によって制限されないということは、当業者にとって自明である。

実施例
合成例１：ペプチド合成
クロロトリチルクロライドレジン（Ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅｒｅｓｉｎ；ＣＴＬｒｅｓｉｎ、ＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍＣａｔＮｏ．０１−６４−００２１）７００ｍｇを反応容器に入れ、メチレンクロライド（ＭＣ）１０ｍｌを加えて３分間撹拌した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍｌを入れて３分間撹拌した後、再び溶媒を除去した。反応器に１０ｍｌのジクロロメタン溶液を入れ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｓｗｉｓｓ）２００ｍｍｏｌｅ及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）４００ｍｍｏｌｅを入れた後、撹拌してよく溶かし、１時間撹拌しながら反応させた。反応後、洗浄し、メタノールとＤＩＥＡ（２：１）とをＤＣＭ（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）に溶かして１０分間反応させ、過量のＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１）で洗浄した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を１０ｍｌ入れて３分間撹拌した後、再び溶媒を除去した。脱保護溶液（２０％のピペリジン（Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ）／ＤＭＦ）１０ｍｌを反応容器に入れ、１０分間常温で撹拌した後、溶液を除去した。同量の脱保護溶液を入れ、再び１０分間反応を保持した後、溶液を除去し、それぞれ３分ずつＤＭＦで２回、ＭＣで１回、ＤＭＦで１回洗浄して、Ｃｙｓ−ＣＴＬレジン（Ｒｅｓｉｎ）を製造した。新たな反応器に１０ｍｌのＤＭＦ溶液を入れ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（Ｂａｃｈｅｍ，Ｓｗｉｓｓ）２００ｍｍｏｌｅ、ＨｏＢｔ２００ｍｍｏｌｅ及びＢｏｐ２００ｍｍｏｌｅを入れた後、撹拌してよく溶かした。反応器に４００ｍｍｏｌｅのＤＩＥＡを分画で２回に亙って入れた後、あらゆる固体が溶けるまで最小限５分間撹拌した。溶かしたアミノ酸混合溶液を脱保護されたレジンがある反応容器に入れ、１時間常温で撹拌しながら反応させた。反応液を除去し、ＤＭＦ溶液で３回５分ずつ撹拌した後、除去した。反応レジンを少量取ってカイザーテスト（ＮｉｈｙｄｒｉｎＴｅｓｔ）を用いて反応程度を点検した。脱保護溶液で、前記のように同様に２回脱保護反応させて、Ａｌａ−Ｃｙｓ−ＣＴＬレジンを製造した。ＤＭＦとＭＣとで十分に洗浄し、もう一度カイザーテストを行った後、前記と同様に、下記のアミノ酸付着実験を行った。選定されたアミノ酸配列に基づいて、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、及びＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）順に連鎖反応させた。Ｆｍｏｃ−保護基を脱保護溶液で１０分ずつ２回反応させた後、よく洗浄して除去した。無水酢酸とＤＩＥＡ、ＨｏＢｔを入れて１時間アセチル化を行った後、製造されたペプチジルレジンをＤＭＦ、ＭＣ及びメタノールでそれぞれ３回を洗浄し、窒素空気を徐々に流して乾燥した後、Ｐ_２Ｏ_５下で真空に減圧して完全に乾燥した後、脱漏溶液［トリフルオロ酢酸（Ｔｒｉｆｌｕｒｏａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）８１．５％、蒸留水５％、チオアニソール（Ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ）５％、フェノール（Ｐｈｅｎｏｌ）５％、ＥＤＴ２．５％、及びＴＩＳ１％］３０ｍｌを入れた後、常温で時々振りながら２時間反応を保持した。フィルタリングを行ってレジンを濾し、レジンを少量のＴＦＡ溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を用いて全体ボリュームが半分程度残るように蒸留し、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈澱を誘導した後、遠心分離して沈澱を集め、２回さらに冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去し、窒素下で十分に乾燥して、精製前、ＮＨ_２−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−ＣＯＯＨペプチド１を０．７５ｇ合成（収率：８６．５％）し、同じ方法でＮＨ_２−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−ＣＯＯＨペプチド２を０．７０ｇ合成した（収率：８０．７％）。分子量測定器を用いて測定時に、ペプチド１の分子量１１１７．０（理論値：１１１７．３）、ペプチド２の分子量１１６８．１（理論値：１１６８．３）が得られた。

実施例１：メラニン生成量の測定
６ウェル培養用平板に、メラニン形成細胞（Ｂ１６Ｆ１０細胞株）を３７℃培養器で２４時間培養した後、各板の培地を除去し、新たな培地に取り替えた後、配列表の配列番号１または配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有する本発明のペプチドを濃度別に処理する。７２時間培養した後、培養液を除去し、細胞を取り外した後、１．５ｍｌチューブに移して、１３，０００ｒｐｍで３分間遠心分離して、上澄み液を除去し、細胞ペレットを回収してメラニンを測定する。細胞ペレットに、２ＭＮａＯＨを１５０μｌずつ入れて、６０℃で３０分間細胞内メラニンを溶解させる。９６ウェル平板の各ウェルに溶解させて得た上澄み液を１００μｌずつ入れて、４９０ｎｍで吸光度を測定する。

マウスメラニン形成細胞Ｂ１６Ｆ１０に、本発明のペプチドを濃度別にそれぞれ処理し、７２時間培養した時、濃度依存的なメラニン形成増加が観察された（図１ａ及び図１ｂ）。

実施例２：メラニン形成信号伝達物質の観察
メラニン形成細胞（Ｂ１６Ｆ１０細胞株）を６ウェル培養用平板に２４時間培養後、本発明のペプチドを濃度別に処理する。６時間から２４時間まで細胞を培養した後、細胞を溶解してメラニン形成に関与する信号伝逹物質であるＣＲＥＢリン酸化とＭＩＴＦの発現をそれぞれの特異的な抗体を用いたウェスタンブロット方法を用いて観察する。抗ｐＣＲＥＢ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，米国）と抗ＭＩＴＦ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，米国）とを用いて実験を進行した。

マウスメラニン形成細胞Ｂ１６Ｆ１０に、配列表の配列番号１または配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチドをそれぞれ処理し、時間別にメラニン生成信号伝達物質の発現変化を観察した時、メラニン形成酵素の発現を増加させる転写因子であるＭＩＴＦやＭＩＴＦの発現を増加させるＣＲＥＢのリン酸化レベルが増加することを確認した（図２ａ及び図２ｂ）。

実施例３：メラニン形成酵素遺伝子レベルの変化観察
メラニン形成細胞（Ｂ１６Ｆ１０細胞株）を６ウェル培養用平板に２４時間培養後、本ペプチドを濃度別に処理する。２４時間培養した後、細胞を取り外してメラニン形成に関与する酵素であるチロシナーゼ、ＴＲＰ１に対するそれぞれの特異的なプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲで発現の増加を観察する。

メラニン形成に関与する酵素のＰＣＲに用いられたターゲット−特異的プライマー配列は、次の通りである：チロシナーゼ正方向プライマー配列、５’−ＧＧＣＣＡＧＣＴＴＴＣＡＧＧＣＡＧＡＧＧ−３’及びチロシナーゼ逆方向プライマー、５’−ＴＧＧＴＧＣＴＴＣＡＴＧＧＧＣＡＡＡＡＴ−３’（アニーリング温度、５１℃）；ＴＲＰ１正方向プライマー配列、５’−ＣＣＧＡＡＡＣＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＴ−３’及びＴＲＰ１逆方向プライマー、５’−ＴＣＴＧＴＧＡＡＧＧＴＧＴＧＣＡＧＧＡＧ−３’（アニーリング温度、６０℃）。

マウスメラニン形成細胞Ｂ１６Ｆ１０に、配列表の配列番号１または配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチドをそれぞれ処理し、メラニン形成に関与する酵素であるチロシナーゼ、ＴＲＰ１遺伝子の発現態様を時間別に観察した時、６時間、２４時間処理時に、対照群に比べて発現が増加することを確認した（図３ａ及び図３ｂ）。

実施例４：メラニン形成酵素タンパク質レベルの変化観察
メラニン形成細胞（Ｂ１６Ｆ１０細胞株）を６ウェル培養用平板に２４時間培養後、本発明のペプチドを濃度別に処理する。２４時間培養した後、細胞を溶解してメラニン形成に関与する核心酵素であるチロシナーゼの発現を特異的な抗体を用いたウェスタンブロット方法を用いて観察する。抗チロシナーゼ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，米国）を用いて実験を進行した。

マウスメラニン形成細胞Ｂ１６Ｆ１０に、配列表の配列番号１または配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチドをそれぞれ処理し、メラニン形成に関与する酵素であるチロシナーゼタンパク質の発現態様を時間別に観察した時、６時間、２４時間処理時に、対照群に比べて発現が増加することを確認した（図４ａ及び図４ｂ）。

実施例５：中性脂肪量の測定
脂肪前駆細胞（３Ｔ３−Ｌ１細胞株）を２４ウェル培養用平板に４８時間培養後、分化組成物（０．５ｍＭＩＢＭＸ、０．２５ｍＭデキサメタゾン、１０ｍｇ／ｍｌインスリン）と共に本発明のペプチドを濃度別に処理して７日間培養する。

細胞を取り外した後、溶解緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、タンパク質分解酵素抑制剤）を入れ、氷に３０分間保管する。４℃で１４，０００ｇで１０分間遠心分離後、油層を含んだ上澄み液を収集し、トリグリセリド試薬を添加して３７℃培養器で５分間反応させた後、５４０ｎｍで吸光度を測定して中性脂肪量を測定する。

脂肪前駆細胞３Ｔ３−Ｌ１に、分化誘導物質及び配列表の配列番号１または配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチドをそれぞれ処理し、７日間培養時に、脂肪形成機転が抑制されて、対照群に比べて細胞内に蓄積された脂肪であるトリグリセリドの数値が濃度依存的に減少することを確認した（図５ａ及び図５ｂ）。

実施例６：脂肪生成関連遺伝子の変化観察
脂肪前駆細胞（３Ｔ３−Ｌ１細胞株）を６ウェル培養用平板に４８時間培養後、分化組成物（０．５ｍＭＩＢＭＸ、０．２５ｍＭデキサメタゾン、１０ｍｇ／ｍｌインスリン）と共に本ペプチドを濃度別に処理して７日間培養する。培養後、脂肪生成機転に関与する遺伝子であるペリリピンとＰＰＡＲγに対する特異的なプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを進行する。ペリリピンとＰＰＡＲγのｍＲＮＡ値が抑制されたか否かを確認する。

脂肪生成機転に関与する酵素のＰＣＲに用いられたターゲット−特異的プライマー配列は、次の通りである：ペリリピン正方向プライマー配列、５’−ＡＡＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＣＣＴＣＡＣＡＣ−３’及びペリリピン逆方向プライマー、５’−ＣＣＴＣＴＧＣＴＧＡＡＧＧＧＴＴＡＴＣＧ−３’（アニーリング温度、６０℃）；ＰＰＡＲγ正方向プライマー配列、５’−ＴＴＴＴＣＡＡＧＧＧＴＧＣＣＡＧＴＴＴＣ−３’及びＰＰＡＲγ逆方向プライマー、５’−ＡＡＴＣＣＴＴＧＧＣＣＣＴＣＴＧＡＧＡＴ−３’（アニーリング温度、６０℃）。

脂肪前駆細胞３Ｔ３−Ｌ１に、分化誘導物質及び配列表の配列番号１または配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチドをそれぞれ処理し、７日間培養時に、脂肪形成機転に関与する物質であるペリリピンとＰＰＡＲγの遺伝子発現が、対照群に比べて減少したことを確認した（図６ａ及び図６ｂ）。

以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者において、このような具体的な技術は、単に一具現例であり、これにより、本発明の範囲が制限されるものではない点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物とによって定義される。

Claims

配列表の配列番号１のアミノ酸配列からなるメラニン生成増加活性を有するペプチド。
前記ペプチドは、ＭＩＴＦの発現及びＣＲＥＢのリン酸化を増加させる活性を有することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
前記ペプチドは、チロシナーゼの発現を増加させる活性を有することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
配列表の配列番号１のアミノ酸配列からなる脂肪生成抑制活性を有するペプチド。
前記ペプチドは、細胞内に蓄積された脂肪を減少させる活性を有することを特徴とする請求項４に記載のペプチド。
前記ペプチドは、ペリリピン及びＰＰＡＲγの発現を減少させる活性を有することを特徴とする請求項４に記載のペプチド。
請求項１から３のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含むメラニン低色素症の改善または治療用組成物。
前記低色素症は、白斑症、白色症、脱色素性母斑、白色粃糠疹、癜風、炎症後脱色症、斑状強皮症、部分的白皮症、特発性滴状低色素症、または点状白皮症であることを特徴とする請求項７に記載のメラニン低色素症の改善または治療用組成物。
請求項４から６のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む肥満の治療用薬剤学的組成物。