CN106520996A - 一组与安义瓦灰鸡瓦灰羽色相关的分子标记及应用 - Google Patents

一组与安义瓦灰鸡瓦灰羽色相关的分子标记及应用 Download PDF

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张细权
聂庆华
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叶峭
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    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
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Abstract

本发明提供了一组与安义瓦灰鸡瓦灰羽色相关的分子标记，为MC1R基因从N端起第668位的C/T碱基突变，和第730位的A/G碱基突变，和第854位的T/C碱基突变，和第883位的A/G碱基突变，和第1093位的T/C碱基突变，和第1100位的A/C碱基突变；用该分子标记，通过PCR扩增即可挑出安义瓦灰鸡瓦灰羽色纯合体，剔除不符合羽色选育要求的安义瓦灰鸡个体，建立安义瓦灰鸡瓦灰羽色纯系，该方法确定了与瓦灰羽色相关的基因变异，其准确率接近100%，操作简便，用时短，速度快，从拿到待检个体血样到决定被检个体的选淘只需要2天时间，每人每天至少可以完成144个体的检测，具有广泛且实际的应用价值。

Description

一组与安义瓦灰鸡瓦灰羽色相关的分子标记及应用
技术领域
本发明涉及分子标记应用技术领域，更具体地，涉及一组与安义瓦灰鸡瓦灰羽色相关的分子标记及应用。
背景技术
标准安义瓦灰鸡羽色表型为公母鸡全身羽毛呈现瓦灰色，无其他颜色。实际育种过程中育种者一般通过观察个体表型对安义瓦灰鸡的羽色进行选择，但是由于羽色的复杂性，关于其羽色的选育进展到一定程度后，进展非常缓慢，常规的方法是利用全部是瓦灰羽色的个体纯繁，但后代个体出现非瓦灰羽个体，例如颈部出现带有浅黄色或者是出现淡黄麻羽色个体；这样每一代淘汰不合格的个体，逐渐将携带不符合要求遗传背景的个体淘汰，逐代降低群体中不符合羽色要求的等位基因频率，但是上述方法由于无法精确的经过一代淘汰不合格的等位基因，因此进展缓慢，选育时间长，准确率低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一组与安义瓦灰鸡瓦灰羽色相关的分子标记。
本发明的第二个目的是提供所述分子标记的应用。
本发明的第三个目的是提供一种选育安义瓦灰鸡瓦灰羽色个体的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：
一组与安义瓦灰鸡瓦灰羽色相关的分子标记，所述分子标记为MC1R基因从N端起第668位的C/T碱基突变，和第730位的A/G碱基突变，和第854位的T/C碱基突变，和第883位的A/G碱基突变，和第1093位的T/C碱基突变，和第1100位的A/C碱基突变。
本发明检测了瓦灰鸡的瓦灰色羽色个体的单倍型情况，结果显示瓦灰鸡的瓦灰色羽色是由于E基因座位上E等位基因控制，鸟类和哺乳动物上的研究表明，E基因座对应的编码基因即为MC1R基因，主要影响黑色色素（真黑素）和红色色素（嗜黑素）的相对分布。研究显示瓦灰鸡的瓦灰羽色是在黑色羽的基础上形成的，因此将携带黑色羽等位基因纯合子的个体选出，淘汰杂合子个体，群体的羽色一致性一定会大大提高，而本发明研究发现含有以上分子标记位点的安义瓦灰鸡均为纯合子。
因此，本发明提供所述分子标记在安义瓦灰鸡瓦灰羽性状辅助选择中的应用。
本发明还提供一种筛选安义瓦灰鸡瓦灰羽色个体的方法，是测定待测安义瓦灰鸡MC1R基因从N端起第668位、第730位、第854位、第883位、第1093位和第1100位的碱基，如果第668位、第730位、第854位、第883位、第1093位和第1100位的碱基分别是C、A、T、A、T、A，则待测安义瓦灰鸡为瓦灰羽色个体，否则不是瓦灰羽色个体。
具体地，所述方法是设计引物MC1R-F和MC1R-R，对待测安义瓦灰鸡MC1R基因进行PCR扩增，将所得扩增产物直接进行测序，若扩增产物第668位的碱基为C，第730位的碱基为A，第854位的碱基为T，第883位的碱基为A，第1093位的碱基为T，第1100位的碱基为A，则待测安义瓦灰鸡为瓦灰羽色个体，否则，待测安义瓦灰鸡不是瓦灰羽色；所述引物MC1R-F和MC1R-R的序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。
优选地，所述PCR扩增的条件为：（1）94℃ 3min，（2）94℃ 30s，58℃ 30s，72℃1min，32个循环，（3）72℃ 10min。
优选地，所述PCR的反应体系为：PCR MIX 10微升，双蒸水7.6微升，2微升的DNA模板，各0.2微升的MC1R-F和MC1R-R。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一组与安义瓦灰鸡瓦灰羽色相关的分子标记，所述分子标记为SEQ IDNO：1所述序列中第668位的C/T碱基突变，和第730位的A/G碱基突变，和第854位的T/C碱基突变，和第883位的A/G碱基突变，和第1093位的T/C碱基突变，和第1100位的A/C碱基突变；用该分子标记，通过PCR扩增待测样本，即可挑出安义瓦灰鸡瓦灰羽色纯合体，从而剔除不符合羽色选育要求的安义瓦灰鸡个体，将其遗传背景统一，建立安义瓦灰鸡瓦灰羽色纯系，该方法确定了与瓦灰羽色相关的基因变异，基于此可以通过分子手段直接对个体的瓦灰羽色表型进行选择，其准确率接近100%，操作简便，用时短，速度快，从拿到待检个体血样到决定被检个体的选淘只需要2天时间，每人每天至少可以完成144个体的检测，具有广泛且实际的应用价值。
具体实施方式
下面将结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤、条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若无特别说明，实施例中所用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法和技术，试剂或材料均为通过商业途径得到。
实施例1 瓦灰鸡MC1R基因单倍型分析
从自由交配得到的群体中随机选取24只全身为瓦灰色羽的瓦灰鸡和24只羽毛有淡黄色羽的非瓦灰羽色的瓦灰鸡个体。
一、DNA 抽提
采用一次性注射器从鸡翅下静脉中抽取约1mL血液，注入经高压灭菌并装有约200μL2%无菌EDTA（Ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA）抗凝剂的1.5mL离心管中，轻轻摇匀，记录翅号，-20℃保存备用。
基因组DNA的抽提采用苯酚-氯仿抽提法（奥斯泊F等，1998）：
（1）取全血30μL置于1.5mL离心管，分别加入470μL1×SET缓冲液、12.5μL20%SDS和6μL10mg/mL蛋白酶K，混合均匀后放于55℃水浴过夜；
（2）取出样本于1.5mL离心管，加入500μL饱和苯酚，轻摇20min，10,000rpm离心10min；
（3）取上清，再次加入500μL饱和苯酚，轻摇20min，10,000rpm离心10min；
（4）取上清，加入500μL氯仿-异戊醇（23：1）轻摇20min，10,000rpm离心10min；
（5）取上清，加入1mL冰无水乙醇（-20℃），来回摇摆以沉淀DNA，10,000rpm离心10min后倒出乙醇；
（6）用1mL75%乙醇清洗DNA一次，倒掉乙醇，置于50℃干燥箱内烘干；（7）待DNA完全干燥后加入300μL灭菌后的双蒸水溶解，50℃水浴锅中过夜以溶解DNA；
（8）存放于-20℃冰箱中保存备用。
二、PCR扩增
扩增程序：94℃变性3min，32次循环（94℃30s，58℃30s，72℃1min），72℃延伸10min，得到PCR扩增产物；
扩增体系：20微升体系，具体为：PCR MIX：10微升，双蒸水7.6微升，2微升的DNA模板，各0.2微升的上下游引物。
三、测序分型
PCR产物送生物公司测序，利用DNAsp4.10软件对获得的序列进行单倍型分型，结果显示被检群体中共存在三个单倍型（表1），瓦灰羽个体至少携带一个E等位基因，而非瓦灰羽个体均不携带E等位基因（表2）。
该实验结果表明瓦灰鸡的瓦灰色羽色是由于E基因座位上E等位基因控制。
实施例2 瓦灰羽色的分子标记辅助
通过分子标记辅助选择的办法选出基因型为EE纯合子的瓦灰鸡个体，将选出的瓦灰羽个体进行纯繁，观察后代的羽色性状有无分离。
经过分子标记辅助选择，选出E等位基因纯合的公鸡个体（EE）10只，母鸡个体100只（EE），自繁过程如下：
（1）人工受精以及集蛋
用选出的个体组成新的群体进行自繁，混精受精。组成新群体7天后开始集蛋。连续集蛋7天。
（2）孵化：按照孵化要求将搜集的种蛋进行孵化。
（3）后代羽色表型的观察统计
将得到的550羽后代（公275，母265）饲养至120天，观察羽色情况。结果显示550个体羽色全部为瓦灰色羽，无非瓦灰羽色个体出现。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 一组与安义瓦灰鸡瓦灰羽色相关的分子标记及应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1538
<212> DNA
<213> 扩增片段
<400> 1
atcccaaggt acacagtgac ccgctgtgca cggtgcccca gcatggctca gcccccagct 60
accggggcac aggctgtcat gtgcgtgccc acccttctca ggaggaggag ccgagggagc 120
cagctttaaa tcaggacaga gaaagggccc tttcttcccc atcaccgccg ctgagccctc 180
tctgagctcc ggatacgccg ggcagtgccg gtggggaggg cggccgagac agcggagtcc 240
ccgcgctgct gcccagaggg ctcccgggtg ggggaccgct tccccatcct tgtgcctggg 300
gtgcagaggt gcccacatcc cctctgcctc gtgaccgcgt gctgcgggag cactggtggg 360
gctggttggg cgcacggggg ctttgtaggt gctgcagttg tgcctcgggg ccacggcctc 420
cagccagggc ggtccctggg ggctgaggcc ggggccatgt cgatgctggc ccccctgcgc 480
ctcgtgcgcg agccctggaa cgccagtgag ggcaaccaga gcaatgccac ggccggggcc 540
ggaggtgcct ggtgccaggg gctggacatc cccaatgagc tcttcctgac gctggggctg 600
gtgagcctgg tggagaacct gctggtggtg gccgccatcc tcaagaacag gaatctgcac 660
tcgcccacgt actacttcat ctgctgcctg gccgtctccg acatgctggt gagcgtcagc 720
aacctggcca agacgctctt catgctgctg atggagcacg gcgtgctggt gatccgcgcc 780
agcatcgtcc gccacatgga caatgtcatc gacatgctca tctgcagctc cgtcgtgtcc 840
tccctctcct tcctgggggt catcgccgtg gaccgctaca tcaccatctt ctatgcgctg 900
cgctaccaca gcatcatgac gctgcagcgc gccgtggtca ccatggccag cgtctggctg 960
gccagcaccg tctccagcac cgtcttaatc acctactacc gcaacaacgc catcctgctc 1020
tgcctcattg gcttcttcct cttcatgctg gtcctcatgc tggtgctcta cattcacatg 1080
ttcgcgctgg cgtgccacca cgtgcgcagc atctccagcc agcagaagca gcccaccatc 1140
taccgcacca gcagcctgaa gggagccgtc acgctcacca tcctgctggg agtcttcttc 1200
atctgctggg ggcccttctt cttccacctc atcctcatcg tcacctgccc caccaacccc 1260
ttctgcacct gcttcttcag ctatttcaac ctcttcctca tcctcatcat ctgcaattca 1320
gtggtcgatc ccctgatcta tgccttccgg agccaggagc tccggcggac gctgcgggag 1380
gtggtgctgt gctcctggta ggaggcggca cagacaggag gatggatgga tggatggatg 1440
gacggatgga cggatggatg gatggacaaa cagatgggtg gatggacaga tgggtggatg 1500
gacaaacaga cgcaccgcgg ggtgtcccct gggtgccc 1538
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> MC1R-F
<400> 2
atcccaaggt acacagtgac 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> MC1R-R
<400> 3
gggcacccag gggacacc 18

Claims (5)

1.一组与安义瓦灰鸡瓦灰羽色相关的分子标记，其特征在于，所述分子标记为MC1R基因从N端起第668位的C/T碱基突变，和第730位的A/G碱基突变，和第854位的T/C碱基突变，和第883位的A/G碱基突变，和第1093位的T/C碱基突变，和第1100位的A/C碱基突变。
2.权利要求1所述分子标记在安义瓦灰鸡瓦灰羽性状辅助选择中的应用。
3.一种筛选安义瓦灰鸡瓦灰羽色个体的方法，其特征在于，测定待测安义瓦灰鸡MC1R基因从N端起第668位、第730位、第854位、第883位、第1093位和第1100位的碱基，如果第668位、第730位、第854位、第883位、第1093位和第1100位的碱基分别是C、A、T、A、T、A，则待测安义瓦灰鸡为瓦灰羽色个体，否则不是瓦灰羽色个体。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，设计引物MC1R-F和MC1R-R，对待测安义瓦灰鸡MC1R基因进行PCR扩增，将所得扩增产物直接进行测序，若扩增产物第668位的碱基为C，第730位的碱基为A，第854位的碱基为T，第883位的碱基为A，第1093位的碱基为T，第1100位的碱基为A，则待测安义瓦灰鸡为瓦灰羽色个体，否则，待测安义瓦灰鸡不是瓦灰羽色；所述引物MC1R-F和MC1R-R的序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件为：（1）94℃ 3min，（2）94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 1min，32个循环，（3）72℃ 10min。
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