CN106520783B - 控制大豆叶柄夹角大小的基因及其编码蛋白与应用 - Google Patents

控制大豆叶柄夹角大小的基因及其编码蛋白与应用 Download PDF

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CN106520783B CN201611130386.3A CN201611130386A CN106520783B CN 106520783 B CN106520783 B CN 106520783B CN 201611130386 A CN201611130386 A CN 201611130386A CN 106520783 B CN106520783 B CN 106520783B
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Abstract

本发明提供一种控制大豆叶柄夹角的GmLPA1基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供所述控制大豆叶柄夹角的GmLPA1基因编码的蛋白。本发明同时提供了控制大豆叶柄夹角的GmLPA1基因在调控植物株形中的应用。

Description

控制大豆叶柄夹角大小的基因及其编码蛋白与应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域,特别是涉及控制大豆叶柄夹角大小的GmLPA1基因及其编码的蛋白与应用。
背景技术
叶柄夹角是大豆及众多豆科植物株型性状的构成因素之一,直接影响植株光截获量、光和效率及最终产量,是作物育种中重要的育种目标性状。叶柄夹角是由被称为叶枕的马达器官所决定,叶枕是叶柄或叶片基部与主茎相连的膨大组织,决定植物的感夜运动和轻触性运动。现有研究中,仅蒺藜苜蓿中发现了控制小叶叶枕属性的ELP1/PLP基因,该基因功能缺失的蒺藜苜蓿突变体叶枕机构和感夜运动缺失。然而,控制叶柄夹角的遗传机制还未在任何植物中报道,因此,分离调控大豆叶柄夹角和感夜运动的主要因子,对通过优化株型提高大豆产量具有重要意义。
发明内容
为进一步优化株型提高大豆产量,本发明的目的是提供一种从大豆中分离的控制大豆叶柄夹角大小的GmLPA1基因及其编码蛋白与应用。
本发明提供一种控制大豆叶柄夹角大小的GmLPA1基因,其核苷酸序列为:
a如SEQ ID No.1所示;或b在SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等控制大豆叶柄夹角大小功能的由a衍生的基因。
核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的GmLPA1基因全长3708bp,共有4个外显子和3个内含子,CDS区基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,长1734bp。
本发明提供由上述控制大豆叶柄夹角的GmLPA1基因编码的蛋白,其为:
1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白;或2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等控制大豆叶柄夹角大小活性的由1)衍生的蛋白。
氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白由577个氨基酸残基组成,主要由6个功能域组成,从N端开始分别是TPR1、TPR2、TPR3、TPR4、TPR5、TPR6。
应当理解,本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列,在不影响其活性的前提下,取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸,得到所述蛋白的突变序列。例如,将非活性区段的第550位精氨酸替换为丝氨酸,得到蛋白的突变体序列,且不影响其活性。
因此,本发明的控制大豆叶柄夹角的GmLPA1基因编码的蛋白还包括SEQ ID No.2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸,具有同等活性的控制大豆叶柄夹角的GmLPA1基因编码的蛋白衍生得到的蛋白。本发明控制大豆叶柄夹角的GmLPA1基因包括编码所述衍生得到的蛋白的核酸序列,此外,应理解,考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性,本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
本发明还提供含有控制大豆叶柄夹角的GmLPA1基因核苷酸序列或其片段的克隆载体或各类表达载体。
本发明还提供含有所述载体的宿主细胞。
本发明还提供含有控制大豆叶柄夹角的GmLPA1基因核苷酸序列或其特异片段的转化植物细胞和转基因植物。
本发明还提供用于扩增GmLPA1基因的cDNA片段的特异性引物对,其为:
上游引物:5’-AGTGTAGCCGAAGGCAATGAG-3’,如SEQ ID No.4所示;
下游引物:5’-ACATGTGGATTAAGATCGAAGTGC-3’,如SEQ ID No.5所示。
本发明进一步提供控制大豆叶柄夹角的GmLPA1基因在调控植物株形中的应用,其为将GmLPA1基因转入待改造植物获得叶柄夹角变小的转基因植物,具体步骤为i将GmLPA1基因转入植物细胞;ii以i中的植物细胞培育转基因植株。
所述植物优选为豆科植物,更优选为大豆。
本发明的有益效果在于:
(1)本发明提供了控制大豆叶柄夹角的GmLPA1基因及其编码的蛋白,为进一步研究植物株型调控的分子机理提供依据。
(2)GMLPA1基因具有控制叶柄夹角大小的功能,有望以此对植物株形的形成进行调控进而对株形定向设计,以提高植物生产力。
附图说明
图1为大豆GMLPA1基因的基因组序列。
图2为实施例2中大豆GmLPA1基因的正义表达载体。
图3为实施例3中GmLPA1基因过量表达后的T2代大豆的叶柄夹角照片,其中,a为菏豆12号,b为Gmlpa1突变体,c为GmLPA1基因过量表达的Gmlpa1突变体。
图4为实施例4中不同大豆栽培品种感夜运动折线图。
图5为实施例4中GmLPA1基因在不同大豆栽培品种中的表达水平柱状图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段;所用的实验方法均为常规方法;所用的材料、试剂等,均可从商业途径得到。
实施例中所涉植物材料如下:
以下实施例中使用的大豆品种为菏豆12号(审定编号:鲁种审字2002012)。
实施例1 大豆中GmLPA1基因的分离和结构分析
(1)基因的分离
从大豆品种菏豆12号的幼嫩叶片中提取mRNA,以此mRNA为模板,以Oligo(T)17为引物合成cDNA第一条链。接着以该cDNA第一条链为模板,引物(5’-AGTGTAGCCGAAGGCAATGAG-3’,如SEQ ID No.4所示)和引物(5’-ACATGTGGATTAAGATCGAAGTGC-3’,如SEQ ID No.5所示)进行PCR扩增,获得了1个GmLPA1基因的长为1734bp的cDNA片段,克隆到pGEM T Easy载体(TaKaRa公司)中并命名为pGEM TEasy-LPA1。
pGEM T Easy-LPA1中所包含GmLPA1基因的CDS序列如SEQ ID NO:3所示,共1734bp,它编码一个577个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO:2)。
(2)基因的结构分析
以菏豆12号幼嫩叶片为材料,提取其中的DNA,接着以该基因组DNA为模板,OL4234/OL4235为引物进行扩增获得了GmLPA1基因组的片段,GmLPA1基因的DNA序列如SEQID NO:1所示,共3708bp,它含有3个内含子和4个外显子(如图1)。
实施例2 GmLPA1正义表达载体的构建
将GmLPA1的CDS和绿色荧光蛋白GFP的CDS融合正向连到植物表达载体pCAMBIA3301H(CAMBIA研究中心)中,得到带有GFP标签的GmLPA1正义的表达载体,该载体全长为11.4Kbp(如图2),在大肠杆菌中的抗性为卡那霉素抗性,在植物体中的抗性为草铵膦抗性。
实施例3 农杆菌介导法转化豆科植物
在本实施例中,通过农杆菌介导法转化大豆胚尖的方法,得到含有GmLPA1调控基因的正义表达载体的Gmlpa1突变体的外植体。
(A)大豆外植体的获得
从荷豆12号中发现叶柄夹角大的突变体植株(由γ射线诱变的菏豆12号突变体库中筛选获得),突变体命名为Gmlpa1,选取表面光滑、无破损、无病斑、无裂痕的Gmlpa1突变体成熟大豆种子,以氯气方法灭菌14h。将灭菌后的种子在超净台上通风,使氯气完全挥发,在萌发培养基萌发处理6h。去掉大豆1/2胚轴,将大豆沿胚轴纵向切开,将剩余下胚轴作为农杆菌介导转化的受体材料。
(B)大豆转化
农杆菌介导法采用二次农杆菌侵染,在共培养基上于22℃暗培养5d;SI-I培养基中,于强光下培养7d;切去外植体大芽,在SI-II培养基中,于强光下培养14d;切去外植体子叶和胚轴,于SE培养基中,每14d继代一次;将约3cm丛生芽剪下,放入生根培养基中生根;将RM生根培养基中,根部生长发达的植株转入土中栽植。最终筛选得到了8个抗性植株,Bar检测这8株植物均为阳性。在温室中培养5个月后果荚开始成熟,6个月后收种完毕。
(C)可以遗传的转基因植株
将收获的T1代种子在温室中每个株系种植4株,可以观察到过量表达GmLPA1基因的Gmlpa1突变体植株叶枕恢复膝状凸起结构、叶柄夹角明显小于Gmlpa1突变体叶柄夹角,与野生型荷豆12号的叶柄夹角一致(如图3)。
实施例4 大豆GmLPA1基因的育种学意义
通过分析和检测16个不同大豆品种(青杂豆、青皮豆、小黄金、压迫车、黑青豆8号、吉黄35号、满仓金、吉林19号、铁荚青、青皮豆16号、鞍挂豆、长农2号、吉林4号、吉林6号、吉林35号、吉林小粒)中感夜运动能力和GmLPA1基因的表达水平,发现不同品种的运动能力强弱可同通过12:00和18:00点的叶片夹角划分,所有品种在12:00点的叶片夹角显著大于18:00点的叶片夹角(如图4),同时,GmLPA1基因的表达水平在12:00点显著高于18:00点。GmLPA1基因的表达水平在运动能力强的品种中显著高于运动能力弱的品种(如图5)。因此,GmLPA1基因的表达水平与植物的运动能力直接存在显著正相关性。
综上所述,大豆GmLPA1基因可以参与调控植物的叶柄夹角大小的决定,通过转基因的手段可以改变植物叶枕结构及叶柄夹角大小,从而优化植物的株型结构,提高产量。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院东北地理与农业生态研究所
<120> 控制大豆叶柄夹角大小的基因及其编码蛋白与应用
<130> KHP161117683.4Q
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 3708
<212> DNA
<213> 大豆GMLPA1
<400> 1
agaagcccag aagcgaatga aaaagagagg gggaaaggaa ttggagagaa caatttgaaa 60
acagcagtgg cagtgtttgc attacatgca gtgtagccga aggcaatgag ttccaaagag 120
agttgcagaa gtgaacttcg cattgcgatc cgccaactca gtgatcgatg tctctactct 180
gcttctaaat ggtacccctt acaaaaaccc taattcaaac aaattggggg tttccacttg 240
acctcaagtt ttgaattttg aagtcccctt ttacttttct gtgtgattcc gcaaatgggt 300
cgtttgtttc tgacgaaaat gtggtttcag ggctgcagaa cagttggtgg gtattgagca 360
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ctattttgat tgccgtgagt ataagagagc tgctcatgtt cttcgtgatc agaacggaag 600
gaaatcggtg ttcctgcgct gccatgctct ctatctggtc agttttgtgt cccctctttt 660
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agtgtacatt gtttgtgtta atatttttcc ataatttttt tctttttaca ggctggtgaa 2040
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aatcatgaat tggtttcttt ggagagagag ttgtcaactt ttcgcaagaa tggcaaagtt 2160
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aagtcagttg tgtattttag gagagccctt aaattgaaca aaaacttttt atcggcttgg 2760
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cagccaaatg attctcgttt gtggattgca atggctcagt gttatgaaac tgatcaactt 3000
cgcatgcttg atgaagcaat aaagtgttac agaagggcag caaactgtaa tgacagggaa 3060
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gcattttact acaaaaagga cttagagagg atggaatctg aagaaaggga aggacctaaa 3180
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gtgttttatg ctgcatttat gagtttttat atagatgcat caaaacggat ggaaaacaag 3540
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ggtatacaca gcacttcact catatttgtc tttatatcag tgaattggtg gatatcgaca 3660
caaataacga gtatttgtag ttatttatcg gtatttaaga atttaaaa 3708
<210> 2
<211> 577
<212> PRT
<213> GMLPA1蛋白
<400> 2
Met Ser Ser Lys Glu Ser Cys Arg Ser Glu Leu Arg Ile Ala Ile Arg
1 5 10 15
Gln Leu Ser Asp Arg Cys Leu Tyr Ser Ala Ser Lys Trp Ala Ala Glu
20 25 30
Gln Leu Val Gly Ile Glu Gln Asp Pro Ala Lys Phe Thr Pro Ser Asn
35 40 45
Thr Arg Phe Gln Arg Gly Ser Ser Ser Ile Arg Arg Lys Tyr Lys Thr
50 55 60
His Glu Ile Thr Gly Thr Pro Ile Ala Gly Val Ser Tyr Val Ala Thr
65 70 75 80
Pro Ala Met Glu Glu Asp Glu Leu Val Asp Gly Asp Phe Tyr Leu Leu
85 90 95
Ala Lys Ser Tyr Phe Asp Cys Arg Glu Tyr Lys Arg Ala Ala His Val
100 105 110
Leu Arg Asp Gln Asn Gly Arg Lys Ser Val Phe Leu Arg Cys His Ala
115 120 125
Leu Tyr Leu Ala Gly Glu Lys Arg Lys Glu Glu Glu Met Ile Glu Leu
130 135 140
Glu Gly Pro Leu Gly Lys Ser Asp Ala Val Asn His Glu Leu Val Ser
145 150 155 160
Leu Glu Arg Glu Leu Ser Thr Phe Arg Lys Asn Gly Lys Val Asp Pro
165 170 175
Phe Cys Leu Tyr Leu Tyr Gly Leu Val Leu Lys Gln Lys Gly Ser Glu
180 185 190
Asn Leu Ala Arg Ala Val Leu Val Glu Ser Val Asn Ser Tyr Pro Trp
195 200 205
Asn Trp Asn Ala Trp Thr Glu Leu Gln Ser Leu Cys Lys Thr Val Asp
210 215 220
Ile Leu Asn Ser Leu Asn Leu Asn Ser His Trp Met Lys Asp Phe Phe
225 230 235 240
Leu Ala Ser Val Tyr Gln Glu Leu Arg Met His Asn Asp Ser Leu Ser
245 250 255
Lys Tyr Glu Tyr Leu Leu Gly Thr Phe Ser Asn Ser Asn Tyr Val Gln
260 265 270
Ala Gln Ile Ala Lys Ala Gln Tyr Ser Leu Arg Glu Phe Asp Gln Val
275 280 285
Glu Ala Ile Phe Glu Glu Leu Leu Ser Asn Asp Pro Tyr Arg Val Glu
290 295 300
Asp Met Asp Met Tyr Ser Asn Val Leu Tyr Ala Lys Glu Cys Phe Ser
305 310 315 320
Ala Leu Ser Tyr Leu Ala His Arg Val Phe Met Thr Asp Lys Tyr Arg
325 330 335
Pro Glu Ser Cys Cys Ile Ile Gly Asn Tyr Tyr Ser Leu Lys Gly Gln
340 345 350
His Glu Lys Ser Val Val Tyr Phe Arg Arg Ala Leu Lys Leu Asn Lys
355 360 365
Asn Phe Leu Ser Ala Trp Thr Leu Met Gly His Glu Phe Val Glu Met
370 375 380
Lys Asn Thr Pro Ala Ala Val Asp Ala Tyr Arg Arg Ala Val Asp Ile
385 390 395 400
Asp Pro Arg Asp Tyr Arg Ala Trp Tyr Gly Leu Gly Gln Ala Tyr Glu
405 410 415
Met Met Gly Met Pro Phe Tyr Ala Leu His Tyr Phe Lys Lys Ser Val
420 425 430
Phe Leu Gln Pro Asn Asp Ser Arg Leu Trp Ile Ala Met Ala Gln Cys
435 440 445
Tyr Glu Thr Asp Gln Leu Arg Met Leu Asp Glu Ala Ile Lys Cys Tyr
450 455 460
Arg Arg Ala Ala Asn Cys Asn Asp Arg Glu Ala Ile Ala Leu His Asn
465 470 475 480
Leu Ala Lys Leu His Ser Glu Leu Gly Arg Pro Glu Glu Ala Ala Phe
485 490 495
Tyr Tyr Lys Lys Asp Leu Glu Arg Met Glu Ser Glu Glu Arg Glu Gly
500 505 510
Pro Lys Met Val Glu Ala Leu Leu Tyr Leu Ala Lys Tyr Tyr Arg Ala
515 520 525
Gln Lys Lys Phe Glu Asp Ala Glu Val Tyr Cys Thr Arg Leu Leu Asp
530 535 540
Tyr Thr Gly Pro Glu Arg Glu Thr Ala Lys Ser Ile Leu Arg Gly Met
545 550 555 560
Arg Ser Thr Gln Ser Asn Phe Pro Ser Met Asp Val Glu His Phe Pro
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Pro
<210> 3
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ttggagagag agttgtcaac ttttcgcaag aatggcaaag ttgatccttt ttgtttgtac 540
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gaatctgtga atagctaccc ttggaactgg aatgcctgga ctgagttgca atccttatgc 660
aaaacagtgg atatattgaa tagtcttaat ctcaatagcc attggatgaa ggactttttc 720
cttgccagtg tttaccaaga attaaggatg cacaatgact ctctgtcaaa atatgaatac 780
ctactaggaa cctttagtaa tagtaattat gtacaagcac aaattgcaaa agcccagtac 840
agtttgaggg aatttgacca agttgaagca atatttgaag aactgctgag taatgatcct 900
tacagagtgg aagacatgga catgtactcc aatgtgcttt atgctaagga atgcttttct 960
gctttgagtt atcttgccca tagagtattc atgactgata aatacagacc tgaatcttgt 1020
tgtattattg ggaattacta tagtttaaag ggacagcatg agaagtcagt tgtgtatttt 1080
aggagagccc ttaaattgaa caaaaacttt ttatcggctt ggacacttat ggggcatgag 1140
tttgtagaga tgaaaaacac tcctgctgct gtggatgcct atcgtcgggc agtagatata 1200
gacccacgtg attatcgtgc ttggtatgga ctaggacagg cttatgagat gatgggcatg 1260
cctttctatg cgcttcatta cttcaaaaaa tctgtattct tgcagccaaa tgattctcgt 1320
ttgtggattg caatggctca gtgttatgaa actgatcaac ttcgcatgct tgatgaagca 1380
ataaagtgtt acagaagggc agcaaactgt aatgacaggg aagcaattgc tctgcacaac 1440
ttggcaaaac ttcactcgga gctagggcgc cctgaagagg ctgcatttta ctacaaaaag 1500
gacttagaga ggatggaatc tgaagaaagg gaaggaccta aaatggttga ggctttactc 1560
tatcttgcaa aatattacag agcacaaaaa aaatttgaag atgctgaagt ttactgtaca 1620
cgtcttctgg attatactgg cccggagaga gaaacagcaa agagtatact tagaggaatg 1680
cgatcaacgc aatctaattt tccttccatg gatgttgagc attttcctcc ctaa 1734
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
agtgtagccg aaggcaatga g 21
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
acatgtggat taagatcgaa gtgc 24

Claims (2)

1.GmLPA1基因在调控大豆植物株形中的应用,所述GmLPA1基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,将GmLPA1基因转入待改造大豆植物获得叶柄夹角变小的转基因大豆植物。
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