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二羟基青蒿素、其制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种二羟基青蒿素，其结构如式(Ⅰ)所示。本发明还提供了该化合物的制备方法及其应用。本发明中，为了避免青蒿素10位上的交叉耐药性，本发明利用微生物发酵方法在青蒿素的6位和7位以较高转化率的引入了羟基，提高了水溶性,不仅具有一定的抗疟活性，而且还为后续的结构修饰提供了新的先导化合物。

Description

二羟基青蒿素、其制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及二羟基青蒿素、其制备方法及其应用。
背景技术
青蒿素(Qinghaosu，Artemisinin，见式(A))是从中草药黄花蒿里提取出的含过氧基团的倍半萜内酯。但存在近期复燃率高、体内半衰期短、水溶性小等缺点，为此，有机化学家和药物学家对青蒿素进行了大量的结构改造，希望找到更为理想的抗疟新药。
通过大量的研究表明过氧桥环结构是最主要的药效团，环的扩大和缩小都会引起抗疟活性的降低。而C6、C7和C8原子很难用化学方法直接修饰，所以青蒿素衍生化的部位主要集中在C9到O11的内酯环，尤其是以C10位的改造最为常见。其中二氢青蒿素(Dihydroartemisinin)、蒿甲醚(Artemether)和青蒿琥酯(Artesunate)是对C10位氧原子修饰的典范。2006年世界卫生组织(WHO)开始强力推行ACTs(artemisinin-basedcombination therapies，以青蒿素为基础的联合用药疗法)，这三个化合物都榜上有名。
但是，2005年科学杂志报导要警惕个别疟原虫对青蒿素敏感性降低，2009年有少量报道在柬埔寨泰国边界出现了对青蒿琥酯(Artesunate)耐药的疟原虫，后续研究发现该疟原虫还致使ACTs的敏感性降低，但所幸没有扩散。2010年Enserink等在Science杂志上撰文担心现有的ACTs采用的三种C10位上氧原子修饰的青蒿素类药物结构太过于近似，将会产生交叉性耐药，未来世界将面临着爆发大规模疟疾的威胁。
发明内容
本发明的目的在于提供一种修饰C6、C7位的二羟基青蒿素，以解决上述技术问题中的至少一个。
本发明的另一个目的在于提供上述二羟基青蒿素的制备方法，以解决上述技术问题中的至少一个。
本发明的第三个目的在于提供上述二羟基青蒿素的应用，以解决上述技术问题中的至少一个。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种二羟基青蒿素，其结构如式(Ⅰ)所示：
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述二羟基青蒿素的制备方法，包括以下步骤：
(1)微生物发酵制备：
将菌种雅致小克银汉霉、产黄青霉或华根霉、层出镰刀菌、葡枝根霉或少根根霉的斜面培养物接种于种子培养基中，在25～30℃、转速150～200rpm下培养1～4天，获得种子液；
菌种雅致小克银汉霉(Cunninghamellaelegans)ATCC 9245购买于美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection)；
将种子液以5％(V/V)的接种量接种于1～1.2L的发酵培养基中，在25～30℃、转速150～200rpm下培养1～4天，再加入青蒿素10～30mL浓度为20～30mg/mL的青蒿素-甲醇溶液，然后，摇匀，继续在25～30℃、转速150～200rpm下培养10～20天，得到发酵液；
种子培养基和发酵培养基(一般需在121℃灭菌30min)可以为：10～30g沙氏葡萄糖肉汤(Sabouraud Dextrose Broth(Difco))、10～30g蔗糖、5～25蛋白胨和1000mL去离子水的混合物；
(2)提取分离将上述发酵液过滤，分为菌丝和滤液两部分，菌丝弃去，滤液用等体积乙酸乙酯萃取1～3次，萃取液经减压浓缩得浸膏，浸膏用硅胶柱(300–400目)进行柱层析分离(10～50％的乙酸乙酯-正己烷梯度洗脱)，得到二羟基青蒿素。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述二羟基青蒿素在制备治疗疟疾药物上的应用。
附图说明
图1为式(Ⅰ)化合物的单晶结构图。
图2为式(Ⅰ)化合物的核磁共振氢谱图。
图3为式(Ⅰ)化合物的核磁共振碳谱图。
图4为式(Ⅰ)化合物的质谱图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细的说明。
一、二羟基青蒿素的制备
菌种雅致小克银汉霉(Cunninghamellaelegans)ATCC 9245购买于美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection)。
种子培养基和发酵培养基均为:20g沙氏葡萄糖肉汤(Sabouraud Dextrose Broth(Difco)),15g蔗糖,10g蛋白胨,1000mL去离子水，121℃灭菌30min。
将菌种雅致小克银汉霉ATCC 9245的斜面培养物接种于种子培养基，在28℃，转速180rpm下培养2天，获得种子液。
将种子液以5％(V/V)的接种量接种于20个装有1L发酵培养基的4L摇瓶中，在28℃、转速180rpm条件下培养2天，每瓶加入底物青蒿素500mg(青蒿素用甲醇溶解成浓度为25mg/mL，每瓶加20mL该溶液，20瓶总共加入青蒿素10g)。加入底物后摇瓶继续在28℃、转速180rpm条件下培养14天。
将上述发酵液过滤，分为菌丝和滤液两部分，菌丝弃去。滤液用等体积乙酸乙酯萃取3次，提取液经减压浓缩得浸膏约11g。浸膏用硅胶(300–400目)柱进行柱层析分离(10％-50％的乙酸乙酯-正己烷梯度洗脱)，得到无色针状结晶6β,7α-二羟基青蒿素225mg，转化率2.3％。
二、化合物的确认
上述制备方法得到的化合物，经1H-NMR、13C-NMR以及X-单晶衍射得以确认为6β,7α-二羟基青蒿素；其1H-NMR和13C-NMR谱图分别如图2和图3所示，X-单晶衍射谱图如图1所示。HRMS m/z:C15H22O7：[M+Na]+理论值337.1263,实测值337.1284，[2M+Na]+理论值651.2628,实测值651.2675，质谱图如图4所示。
产物6β,7α-二羟基青蒿素的核磁共振谱数据如下：
1H NMR(CD3OD,400MHz)δ6.58(1H,s,H-12),3.54(1H,brs,H-7β),3.33(1H,m,H-9),2.45(1H,m,H-4α),2.37(1H,m,H-8a),2.15(1H,m,H-4β),2.10(1H,m,H-5α),1.98(1H,m,H-5a),1.79(1H,m,H-8α),1.77(1H,m,H-5β),1.72(1H,m,H-8β),1.40(3H,s,Me-13),1.29(3H,s,Me-14),1.18(3H,d,J＝7.3Hz,Me-15)。
13C NMR(CD3OD,100MHz)δ175.5(s,C-10),106.6(s,C-3),96.8(d,C-12),81.4(s,C-12a),75.1(s,C-6),74.4(d,C-7),48.1(d,C-5a),38.8(d,C-8a),36.9(t,C-4),33.8(d,C-9),27.6(t,C-8),25.8(q,C-14),25.6(q,C-13),19.8(t,C-5),13.0(q,C-15)。
三、化合物的活性实验
1、疟原虫的培养
按Trager&Jensen(Trager,W.,and Jensen,J.B..Human malaria parasites incontinuous culture.Science 1976,193:673-675.)以及Haynes(Haynes,J.D.,Diggs,C.L.,Hines,F.A.and Desjardins,R.E..Culture of human malaria parasitesPlasmodium falciparum.Nature 1976,263:767-769.)法建立疟原虫P.falciparum W2株体外培养体系。疟原虫培养基为含25mmol/L HEPES、32mmol/L NaHCO3及10％A型人血清的RMPI 1640。A型红细胞用培养基稀释至红细胞比容为6％。培养条件为37℃、5％CO2、5％O2及90％N2。
2、6β,7α-二羟基青蒿素的体外抗疟活性试验
采用半自动微量稀释技术测定产物6β,7α-二羟基青蒿素的抗疟活性。药物先用70％乙醇溶解,再用培养基稀释至8.0μM，保证乙醇含量在0.1％以下。采用Desjardins法(Desjardins,R.E.,Canfield,C.J.,Haynes,J.D.,and Chulay J.D..Quantitativeassessment of antimalarial activity in vitro by a semiautomatedmicrodilutiontechnique.Antimicrob.Agents Chemother.1979,16:710-718.)用微量滴定板测定药物的抗疟活性。微量滴定板使用96孔板,每孔加培养基25μL。在板子的第二行(B)，每孔可加25μL待测的8.0μM药液，B行的孔加好药液后，用自动稀释器将板子的每列进行连续的2倍稀释，使每种药物有7种浓度，稀释范围64倍，最高浓度8.0μM在B行，2倍稀释后最低浓度0.125μM在H行。每块板可以测定12列数据，如果做2个复孔，则可以测定12/3＝4个化合物(本实验中用1～3孔测定6β,7α-二羟基青蒿素)。这样，A行的1-8孔是疟原虫对照(没有药物)，9-12孔是红细胞对照(没有药物和疟原虫)，B行的1-3孔是8.0μM的6β,7α-二羟基青蒿素，C行的1-3孔是4.0μM的6β,7α-二羟基青蒿素，D行的1-3孔是2.0μM的6β,7α-二羟基青蒿素，E行的1-3孔是1.0μM的6β,7α-二羟基青蒿素，F行的1-3孔是0.5μM的6β,7α-二羟基青蒿素，G行的1-3孔是0.25μM的6β,7α-二羟基青蒿素，H行的1-3孔是0.125μM的6β,7α-二羟基青蒿素。
除了A行最后的4个孔，200μL疟原虫感染的红细胞悬浮液被加到微量滴定板的每个孔里。A行最后的4个孔每孔加入200μL等量的非疟原虫感染的A型人红细胞悬浮液。这样每个孔总体积是225μL。A行最开始的8个孔，不含药物，是疟原虫对照。A行最后的4个孔，既不含药物也不含疟原虫，是非疟原虫感染的红细胞对照。完成后，微量滴定板置于潮湿密闭的CO2培养箱中(5％CO2、5％O2及90％N2)，37℃培养24小时,然后从箱中取出,每孔加入25μL的含有0.5μCi[G-3H]-次黄嘌呤的培养基,再置入箱中培育18小时,最后用自动细胞收集器采集每孔的固体残留物,通过次黄嘌呤的摄入量(测量每分钟衰变数，DPM)来反映原虫的生长指数(需扣除非疟原虫感染的红细胞对照组的DPM)。实验数据用Desjardins法进行分析，所用的统计学软件是SPSS 20，按照常规，DPM增量小于疟原虫对照组DPM增量50％的孔视为有效，实验重复3次。
表1：第一次实验采集的Disintegrations per minute(dpm)数据
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 49009 49210 48730 49240 49500 50040 49048 49687 770 725 787 756
B 10202 10678 10339
C 11718 11647 11233
D 13568 13760 13883
E 17252 17756 17665
F 24482 24697 24569
G 31491 32067 32432
H 34807 34202 34814
经软件处理得到IC50＝0.49uM
表2：第二次实验采集的Disintegrations per minute(dpm)数据
经软件处理得到IC50＝0.57uM
表3：第三次实验采集的Disintegrations per minute(dpm)数据
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 56230 55878 55347 57479 56348 55945 56916 55745 690 731 724 707
B 11789 10962 11982
C 1245 12116 24780
D 16008 14976 14665
E 21378 20107 19432
F 27686 28142 27173
G 37374 36157 36547
H 40279 39148 39357
经软件处理得到IC50＝0.47uM
结合3次实验结果显示6β,7α-二羟基青蒿素抗疟活性IC50值为0.51±0.05μM，证明本发明的二羟基青蒿素有一定的抗疟活性，可以用于制备治疗治疗疟疾的药物。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.二羟基青蒿素，其结构如式(Ⅰ)所示：
2.权利要求1所述的二羟基青蒿素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)微生物发酵制备：
将菌种雅致小克银汉霉、产黄青霉或华根霉、层出镰刀菌、葡枝根霉或少根根霉的斜面培养物接种于种子培养基中，在25～30℃、转速150～200rpm下培养1～4天，获得种子液；
将种子液以5％(V/V)的接种量接种于1～1.2L的发酵培养基中，在25～30℃、转速150～200rpm下培养1～4天，再加入青蒿素10～30mL浓度为20～30mg/mL的青蒿素-甲醇溶液，然后，摇匀，继续在25～30℃、转速150～200rpm下培养10～20天，得到发酵液；
(2)提取分离
将上述发酵液过滤，分为菌丝和滤液两部分，菌丝弃去，滤液用有机溶剂萃取1～3次，萃取液经减压浓缩得浸膏，浸膏经过柱层析分离，得到二羟基青蒿素。
3.权利要求1所述的二羟基青蒿素在制备治疗疟疾药物上的应用。
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