CN106496023B - 制备、分离与纯化蜂胶中蒿素c活性成分的方法 - Google Patents
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Abstract
一种制备、分离与纯化蜂胶中蒿素C(artepillin C)活性成分的方法，先将蜂胶与乙醇混合，再以离心方式去除蜂胶乙醇混合液中的杂质，以获得蜂胶乙醇萃取液，再将超临界二氧化碳流体与蜂胶乙醇萃取液进行分离，使蜂胶乙醇萃取液分离出蜡质与蒿素C、类黄酮成分，继而将超临界二氧化碳流体与前述蜂胶中蒿素C、类黄酮成分进行分离，以分离出蒿素C成分及类黄酮成分，再静置预定时间后，利用乙醇纯化蒿素C成分。其可大量分离与纯化蜂胶中蒿素C的活性成分，且能保持蒿素C活性成分的生物活性，不需经繁复的溶剂去除与浓缩、分离程序，且无溶剂残留等安全疑虑，制作成本低，甚为环保、安全，具实用价值。
Description
技术领域
本发明与蜂胶活性成分纯化的技术有关，更详而言之是指一种可大量制备、分离与纯化蜂胶中蒿素C(artepillin C)活性成分的方法。
背景技术
蜂胶在民间医药利用有悠久的历史，其具有各种生理活性，如抗癌活性、抗氧化活性、抗炎活性、抗菌活性等。具有生物活性的化合物包括肉桂酸衍生物、黄酮类、酯类、芳香醛和醇和萜类化合物等，类黄酮、芳香羧酸和酚的衍生物被认为抗菌和抗氧化性质的治疗效果的主要成分。其中，巴西蜂胶包含有3-[4-羟基-3,5-二(3-甲基-2-丁烯基)苯基]-2-丙烯酸，别名蒿素C(artepillin C)，因蜜蜂从巴西树种(Baccharisdracunculifolia)搜集材料，含有大量的抗氧化蒿素C(artepillin C)成分。
已知萃取与纯化蜂胶中类黄酮类与蒿素C(artepillin C)活性成分的方法，如欧洲专利EP0976399B1，将浸泡粉碎蜂胶块的乙醇，甘油和/或水的步骤中得到可用的蜂胶萃取物，再用阴离子交换树脂处理萃取物中的类黄酮类与蒿素C(artepillin C)成分。此方法的有机溶剂处理去除蜂胶中蜡质成分的过程，会造成蒿素C(artepillin C)与类黄酮成分的严重损失，且有机溶剂容易造成残留毒害与安全性疑虑。
其次，欧洲申请专利WO 2005094853 A1，选择不含有醇的甘油三酯或脂肪酸萃取蜂胶中有效蒿素C(artepillin C)成分的溶剂。中国申请专利CN1879656A，则添加界面活性剂如环状糊精，增加对蜂胶的有效成分的水溶性作用。中国申请专利CN1108057A，将蜂胶置于甘油中浸泡、加热、搅拌并进行热过滤，制备出一种水溶性蜂胶。前述专利的方法并无法去除蜂胶中蜡质成分，且助溶剂会大大地降低蜂胶中蒿素C(artepillin C)与类黄酮成分纯度，无法有效发挥蜂胶的机能功效。
再者，如中国专利CN101244086B所示，其提出利用超临界二氧化碳萃取蜂胶的方法，将细河沙与蜂胶的重量比例为5.3：1，萃取温度为55℃、压力为30MPa、萃取时间为2-4小时。中国专利CN101099547B，则提出利用水萃取蜂胶中具有生物活性的水溶性蜂胶萃取物。此两篇专利方法，并无法完全萃取出蜂胶中蒿素C(artepillin C)与类黄酮成分。
由上可知，已知蜂胶活性成分萃取与纯化的方法，不是制作过程较为繁杂、纯度不足，即是耗时或需使用大量的有机溶剂，有机溶剂在制作过程中可能会与机能成分产生化学反应，完成后溶剂去除与浓缩过程中，加热蒸发溶剂也易造成机能成分被破坏与溶剂残留的问题，显然仍需改进。
发明内容
本发明的主要目的即在提供一种制备、分离与纯化蜂胶中蒿素C(artepillin C)活性成分的方法，其可大量分离与纯化蜂胶中蒿素C(artepillin C)的活性成分，且能保持蒿素C(artepillin C)活性成分的生物活性，不需经繁复的溶剂去除与浓缩、分离程序，且无溶剂残留等安全疑虑，制作成本低，甚为环保、安全，甚具实用价值。
缘是，为达成前述的目的，本发明提供一种制备、分离与纯化蜂胶中蒿素C(artepillin C)活性成分的方法，其步骤至少包含有：萃取：将蜂胶与预定比例的乙醇混合，再以离心方式去除蜂胶乙醇混合液中的杂质，以获得蜂胶乙醇萃取液；除蜡：在预定温度与压力的超临界流体操作条件下，将超临界二氧化碳流体与蜂胶乙醇萃取液通入一层析管柱进行分离，使蜂胶乙醇萃取液在该层析管柱中分离出蜡质与蒿素C(artepillin C)、类黄酮成分，并自该层析管柱的底部去除蜂胶的蜡质成分，自该层析管柱的顶部取出蒿素C(artepillin C)与类黄酮成分；分离蒿素C(artepillin C)与类黄酮成分：在预定温度与压力的超临界流体操作条件下，将超临界二氧化碳流体与前述蜂胶中蒿素C(artepillin C)、类黄酮成分通入一吸附管柱内进行分离，使蒿素C(artepillin C)成分被该吸附管柱吸附，而在该吸附管柱的底部收集类黄酮成分；静置：将该吸附管柱静置预定时间；及纯化蒿素C(artepillin C)成分：在预定温度与压力的操作条件下，将乙醇通入该吸附管柱进行纯化，用以在该吸附管柱的底部脱附被吸附的蒿素C(artepillin C)成分，在该吸附管柱的顶部收集被纯化的蒿素C(artepillin C)成分。
更进一步地，萃取的步骤中，蜂胶乙醇萃取液以1:5-10(W/V)的比例将蜂胶与乙醇混合离心去除杂质而成。
更进一步地，备取1-2Kg的蜂胶，以1:5-10(W/V)的比例与乙醇混合产生10-20L蜂胶乙醇混合液。
更进一步地，除蜡的步骤中，在操作压力3000-4000psi、温度40-60℃、超临界二氧化碳流速6-9L/hr与蜂胶乙醇萃取液流速1-3L/hr的操作条件下，将超临界二氧化碳流体与蜂胶乙醇萃取液通入所述层析管柱内，在所述层析管柱底部去除蜂胶蜡质成分。
更进一步地，所述层析管柱内为内径36mm、高度1000mm的不锈钢槽体，其内充填有不锈钢单体片，所述单体片为Pro-Pak protruded metal、saddles、rings、structuredpacking或knitted packing金属。
更进一步地，分离蒿素C与类黄酮成分的步骤中，在操作压力2000-3000psi、温度40-60℃、超临界二氧化碳流速6-9L/hr的操作条件下，通入所述吸附管柱内进行分离。
更进一步地，所述吸附管柱内为内径36mm、高度1000mm的不锈钢槽体，其内充填有吸附剂，所述吸附剂为硅胶Silica gel、Sephadex或Resin这些可吸附蒿素C成分的材料。
更进一步地，静置的步骤中，将所述吸附管柱静置1-2小时。
更进一步地，纯化蒿素C成分的步骤中，在操作压力2000-3000psi、温度40-60℃、40-60％乙醇流速1-3L/hr的操作条件下，将乙醇通入所述吸附管柱进行纯化。
本发明的有益效果为：
本发明提供一种制备、分离与纯化蜂胶中蒿素C(artepillin C)活性成分的方法，其利用超临界二氧化碳当为溶剂，并配合层析与吸附技术，可大量分离与纯化蜂胶中蒿素C(artepillin C)的活性成分，且能保持蒿素C(artepillin C)活性成分的生物活性，不需经繁复的溶剂去除与浓缩、分离程序，且无溶剂残留等安全疑虑，制作成本低，甚为环保、安全，具实用价值。
附图说明
图1为本发明一较佳实施例的流程图。
图2为已知蜂胶萃取蒿素C(artepillin C)、类黄酮与蜡的感官评价比较分析图。
图3为本发明一较佳实施例与已知蜂胶萃取方法的蒿素C(artepillin C)、类黄酮与蜡的感官评价比较分析图。
图4为本发明一较佳实施例的HPLC图谱图。
具体实施方式
以下，兹举本发明一较佳实施例，并配合附图做进一步的详细说明如后，其中：
首先，请参阅图1所示，本发明一较佳实施例的制备、分离与纯化蜂胶中蒿素C(artepillin C)活性成分的方法100，可大量分离、纯化以取得蜂胶中蒿素C(artepillinC)的活性成分，不但制作成本低，且能保持蒿素C(artepillin C)成分的生物活性，其第一步骤为萃取110：将1-2Kg(本实施例为2Kg)的蜂胶，以1:5-10(W/V)(本实施例为1：10W/V)的比例与乙醇(共溶剂)混合产生10-20L(本实施例为20L)的蜂胶乙醇混合液，再以离心方式去除蜂胶乙醇混合液中的杂质，以获得蜂胶乙醇萃取液。
本发明的第二步骤为除蜡120：在操作压力3000-4000psi(本实施例为4000psi)、温度40-60℃(本实施例为60℃)、超临界二氧化碳流速6-9L/hr(本实施例为9L/hr)与蜂胶乙醇萃取液流速1-3L/hr(本实施例为3L/hr)的操作条件下，将超临界二氧化碳流体与蜂胶乙醇萃取液通入一层析管柱进行分离，使蜂胶乙醇萃取液可在该层析管柱中分离出蜡质与蒿素C(artepillin C)、类黄酮成分，并自该层析管柱的底部去除蜂胶的蜡质成分，自该层析管柱的顶部取出蒿素C(artepillin C)与类黄酮成分。
该层析管柱内为内径36mm、高度1000mm的不锈钢槽体，其内充填有不锈钢单体片，该单体片为Pro-Pak protruded metal、saddles、rings、structured packing或knittedpacking等金属。
本发明的第三步骤为分离蒿素C(artepillin C)与类黄酮成分130：在操作压力2000-3000psi(本实施例为3000psi)、温度40-60℃(本实施例为60℃)、超临界二氧化碳流速6-9L/hr(本实施例为9L/hr)的操作条件下，将超临界二氧化碳流体与前述蜂胶中蒿素C(artepillin C)、类黄酮成分通入一吸附管柱内进行分离，使蒿素C(artepillin C)成分被该吸附管柱吸附，而在该吸附管柱的底部收集类黄酮成分。
该吸附管柱内为内径36mm、高度1000mm的不锈钢槽体，其内充填有吸附剂，该吸附剂为硅胶(Silica gel)、聚酰胺(Sephadex)或Resin(树脂)等可吸附蒿素C(artepillin C)成分的材料。
本发明的第四步骤为静置140：将该吸附管柱静置1-2小时。
本发明的最后步骤为纯化蒿素C(artepillin C)成分150：在操作压力2000-3000psi(本实施例为3000psi)、温度40-60℃(本实施例为60℃)、40-60％(本实施例为60％)乙醇流速1-3L/hr(本实施例为3L/hr)的操作条件下，将乙醇通入该吸附管柱进行纯化，用以在该吸附管柱的底部脱附被吸附的蒿素C(artepillin C)成分，在该吸附管柱的顶部收集被纯化的蒿素C(artepillin C)成分。
以下，兹将本发明与已知蜂胶萃取方法进行比较，以突显本发明的特色与功效：
【一】首先，将已知乙醇萃取蜂胶法、超临界二氧化碳萃取法与超临界二氧化碳配合共溶剂乙醇萃取法，比较三种萃取方式所获得的蜂胶中蒿素C(artepillin C)、类黄酮与蜡质成分，及将不同萃取方法获得的蜂胶萃取物以1cc滴入100cc水中，观察其颜色、味道与口感接受度。
如图2所示，蜂胶中蒿素C(artepillin C)、类黄酮与蜡质成分的接受度，以0至10分显示，10分代表萃取物或纯化物中的蒿素C(artepillin C)、类黄酮与蜡质成分的含量最高，0分代表萃取物或纯化物中的蒿素C(artepillin C)、类黄酮与蜡质成分的含量最低。
其中，蒿素C(artepillin C)成分含量的分析方法，依照利用C18层析管柱，以HPLC定量分析仪器，比对标准品标准曲线，定量样品在波长320nm的吸光值，换算出蜂胶样品中的蒿素C(artepillin C)浓度。类黄酮成分含量的分析方法，依照以槲皮酮为标准品，定量样品在波长415nm的吸光值，换算出蜂胶样品中的类黄酮浓度。蜡质成分含量的分析方法，依照将1cc蜂胶萃取物或纯化物滴入100cc水中，取悬浮水层上的不溶解物的干物重量，换算出蜂胶样品中的蜡质浓度。颜色、味道与口感品评方法，依照将1cc蜂胶萃取物或纯化物滴入100cc水中，如以0分计算时显示其颜色呈现大量混浊、味道刺激与口感不佳，10分即表示其颜色、味道与口感接受度高。
如图2所示，利用已知乙醇萃取法(如图中乙醇曲线显示)，乙醇对蜂胶中蒿素C(artepillin C)、类黄酮与蜡质成分的溶解度大，可以完全萃取蜂胶中的机能成分，但是其缺点即是将萃取物用水稀释或添加于液体应用，蜂胶中这些长链的非极性C24-C34的hydrocarbon、esters、acids混合物组合的蜡质成分，在液体中会形成大量树酯状的结晶，造成外观混浊状，且强烈抑制蜂胶中机能成分的吸收与利用。蜂胶乙醇萃取液具有辛辣的刺激味，滴于水中溶解后蜡质与油脂会析出并附着在容器上等缺点。
利用已知超临界二氧化碳萃取法(如图中超临界流体曲线显示)，只能得到蜂胶中的脂溶性有效成分，无法萃取出蜂胶中蒿素C(artepillin C)与类黄酮成分。
而利用超临界二氧化碳配合共溶剂乙醇萃取法(如图中超临界+乙醇曲线显示)，优点是高压可快速萃取蜂胶中蒿素C(artepillin C)、类黄酮等有效成分，但缺点是产量较低，无法避免蜂胶中的蜡质与油脂成分一并被萃取出来。
从经济上说，以乙醇萃取法萃取蜂胶，操作方便，成本又低。从技术上说，超临界二氧化碳萃取法并无法将蜂胶中大部分蒿素C(artepillin C)、类黄酮成分等同时萃取出来，而利用超临界二氧化碳配合共溶剂乙醇萃取法，萃取得到的蒿素C(artepillin C)、类黄酮成分，与乙醇萃取法得到含量相似，但其生产成本是乙醇萃取法生产成本的二十倍以上。
【二】其次，如图3所示，本发明方法证实可以有效率的完全分离蜂胶中蒿素C(artepillin C)与类黄酮成分，如图中超临界二氧化碳萃取法曲线显示，可去除蜂胶中95％以上的蜡质成分，提高蜂胶分离物其颜色、味道与口感接受度。
而若先以正己烷去除蜂胶中95％以上的蜡质成分后，再利用已知超临界二氧化碳萃取法(如图中正己烷+超临界流体曲线显示)，只能得到蜂胶中的脂溶性有效成分，无法完全分离出蜂胶中蒿素C(artepillin C)与类黄酮成分。
而若先以正己烷去除蜂胶中95％以上的蜡质成分后，再利用已知超临界二氧化碳配合共溶剂乙醇萃取法(如图中正己烷+超临界流体/乙醇曲线显示)，只能分离出蜂胶中60％的蒿素C(artepillin C)与类黄酮成分。且，选择有机溶剂如正己烷去除蜂胶中的蜡质，将会造成蒿素C(artepillin C)与类黄酮成分损失率约30％，处理后的蒿素C(artepillin C)与类黄酮成分回收率仅有60％。
基此，本发明利用超临界流体的管柱层析方法，可巧妙地将蜂胶中的蜡质分离，同时地完全分离出蜂胶中蒿素C(artepillin C)与类黄酮成分。相反地，若以正己烷去除蜂胶中95％以上的蜡质成分，反而会造成蒿素C(artepillin C)与类黄酮成分损失率约20-30％，且有机溶剂容易造成残留毒害与安全性疑虑。
【三】再者，本发明分离出蜂胶中蒿素C(artepillin C)与类黄酮成分后，再在超临界流体操作条件下将蜂胶中蒿素C(artepillin C)成分的吸附于该吸附管柱内，并静置1-2小时后，再脱附被该吸附管柱吸附的蜂胶中蒿素C(artepillin C)成分，如图4所示，本发明方法证实可有效率的完全纯化蜂胶中蒿素C(artepillin C)至纯度约90-95％含量，如图中Step4的HPLC图谱显示。
由上可知，本发明可以完全萃取出蜂胶中蒿素C(artepillin C)与类黄酮成分(如图2中Ethanol曲线显示)，完全去除蜂胶中蜡质成分(如图3中SFE column曲线显示)，更可以从蜂胶中得到纯度约90-95％蒿素C(artepillin C)成分(如图4中Step4的HPLC图谱显示)。
其次，由图4更可显示与证明:
1.蜂胶经过本发明第一步骤处理，得到的蜂胶乙醇萃取液中蒿素C(artepillinC)成分含量，如图中步骤1的HPLC图谱显示，蜂胶乙醇萃取液中含纯度约10-15％的蒿素C成分。
2.蜂胶经过本发明第二、三步骤处理，得到的分离蜂胶中蒿素C(artepillin C)成分含量，如图中步骤3的HPLC图谱显示蜂胶分离液中含纯度约20-25％的蒿素C成分。
3.被分离的蜂胶蒿素C(artepillin C)成分液体通入该吸附管柱内，进行本发明第五步骤得到纯化蜂胶中的蒿素C(artepillin C)成分含量，如图中步骤4的HPLC图谱显示，蜂胶纯化液中含纯度约90-95％的蒿素C(artepillin C)成分。
综上所述，本发明所提供的制备、分离与纯化蜂胶中蒿素C(artepillin C)活性成分的方法，其利用超临界二氧化碳当为溶剂，并配合层析与吸附技术，可大量分离与纯化蜂胶中蒿素C(artepillin C)的活性成分，且能保持蒿素C(artepillin C)活性成分的生物活性，不需经繁复的溶剂去除与浓缩、分离程序，且无溶剂残留等安全疑虑，制作成本低，甚为环保、安全，甚具实用价值；缘是，本发明确实符合发明专利的要件，因此依法提出申请。
Claims (4)
1.一种制备、分离与纯化蜂胶中蒿素C活性成分的方法，其特征在于，步骤至少包含有：
萃取：将蜂胶与乙醇以1:5-10(W/V)的比例混合，再以离心方式去除蜂胶乙醇混合液中的杂质，以获得蜂胶乙醇萃取液；
除蜡：在温度40-60℃与压力3000-4000psi、超临界二氧化碳流速6-9L/hr与蜂胶乙醇萃取液流速1-3L/hr的超临界流体操作条件下，将超临界二氧化碳流体与蜂胶乙醇萃取液通入一层析管柱进行分离，使蜂胶乙醇萃取液在该层析管柱中分离出蜡质与蒿素C、类黄酮成分，并自该层析管柱的底部去除蜂胶的蜡质成分，自该层析管柱的顶部取出蒿素C与类黄酮成分；
分离蒿素C与类黄酮成分：在温度40-60℃与压力2000-3000psi、超临界二氧化碳流速6-9L/hr的超临界流体操作条件下，将超临界二氧化碳流体与前述蜂胶中蒿素C、类黄酮成分通入一吸附管柱内进行分离，使蒿素C成分被该吸附管柱吸附，而在该吸附管柱的底部收集类黄酮成分；
静置：将该吸附管柱静置1-2小时；及
纯化蒿素C成分：在温度40-60℃与压力2000-3000psi、40-60％乙醇流速1-3L/hr的操作条件下，将乙醇通入该吸附管柱进行纯化，用以在该吸附管柱的底部脱附被吸附的蒿素C成分，在该吸附管柱的顶部收集被纯化的蒿素C成分。
2.如权利要求1所述制备、分离与纯化蜂胶中蒿素C活性成分的方法，其特征在于，备取1-2Kg的蜂胶，以1:5-10(W/V)的比例与乙醇混合产生10-20L蜂胶乙醇混合液。
3.如权利要求1所述制备、分离与纯化蜂胶中蒿素C活性成分的方法，其特征在于，所述层析管柱内为内径36mm、高度1000mm的不锈钢槽体，其内充填有不锈钢单体片，所述单体片为Pro-Pak protruded metal、saddles、rings、structured packing或knitted packing金属。
4.如权利要求1所述制备、分离与纯化蜂胶中蒿素C活性成分的方法，其特征在于，所述吸附管柱内为内径36mm、高度1000mm的不锈钢槽体，其内充填有吸附剂，所述吸附剂为硅胶、聚酰胺或树脂这些可吸附蒿素C成分的材料。
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