CN106478499B - 增强植物抗逆性的小分子化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种增强植物抗逆性的化合物及其制法和用途。具体地，本发明公开了一种式I化合物、或其盐、或其光学异构体、或其外消旋体、或其溶剂化物、或其前体，并且本发明化合物为ABA的替代物，能够显著提高植物的抗逆性，因此具有极其广泛的应用前景。

Description

增强植物抗逆性的小分子化合物
技术领域
本发明涉及植物学领域，具体地，涉及增强植物抗逆性的化合物及其制法和用途。
背景技术
脱落酸(Abscisic Acid，ABA)是平衡植物内源激素和有关生长活性物质代谢的关键因子，具有促进植物平衡吸收水、肥和协调体内代谢的能力，可有效调控植物的根/冠和营养生长与生殖生长，对提高农作物的品质、产量具有重要作用。通过施用ABA，在提高农产品品质等许多方面有着重要的生理活性作用和应用价值。此外，外源ABA能引起叶片气孔的迅速关闭，抑制蒸腾作用，可用于花的保鲜，或在作物幼苗移植栽培的运输过程中防止萎蔫。ABA还能控制花芽分化，调节花期，在花卉园艺上有很大的应用价值。
ABA可以改善作物在低温、干旱、春寒、盐渍等不良生长环境中的生长。因此，ABA具有广泛应用，可用于草坪、农田、园林，尤其是可用于西部地区等缺水地区，对于发展中国农业产业具有重大意义。
然而，天然活性的(+)-ABA不稳定且人工合成难度较大，生产成本很高。因此，ABA一直未被广泛应用于农业生产，各国科学家都在开发天然ABA的替代物。
目前虽然已经开发了一些ABA的替代物，然而这些替代物的活性尚不能令人满意，农业生产上的应用价值低。此外，一些替代物的环境友好性较差。
因此，本领域迫切需要开发环境友好的且可有效提高植物抗逆性的化合物。
发明内容
本发明的目的是提供一种环境友好的且可有效提高植物抗逆性的化合物及其制法和用途。
本发明第一方面提供了式I化合物、或其盐、或其光学异构体、或其外消旋体、或其溶剂化物、或其前体，
式中，
R1为H、卤素、C1-C3烷基、或C1-C3卤代烷基；
R2为H、卤素、C1-C3烷基、或C1-C3卤代烷基；
R3为H、卤素、C1-C3烷基、或C1-C3卤代烷基；
R4为H、卤素、C1-C3烷基、或C1-C3卤代烷基；
R5为卤素、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基或SF5；
R6为H、C1-C3烷基、或C1-C3卤代烷基；
R7为C1-C7烷基、C2-C7链烯基、C2-C7链炔基、C3-C7环烷基、或-R8-O-R9,其中，R8为C1-C2亚烷基而R9为H、C1-C3烷基；
R0为H、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、或卤素；
m为1或2；
表示单键或双键；
附加条件是，R1、R2、R3、R4中有1-4个为卤素。
在另一优选例中，所述的化合物具有式Ia、Ib或Ic结构：
或
式中，R0，R1-R6，m的定义如上所述。
在另一优选例中，R1、R2、R3、R4中有2-4个为卤素。
在另一优选例中，R1、R2、R3、R4中有3或4个为卤素。
在另一优选例中，R1、R2、R3、R4中有4个为卤素。
在另一优选例中，所述的卤素包括F、Cl、Br或I。
在另一优选例中，所述的卤素包括F或Cl。
在另一优选例中，所述的卤素为F。
在另一优选例中，R1、R2、R3、R4中有2-4个为F。
在另一优选例中，R1、R2、R3、R4中有3或4个为F。
在另一优选例中，R1、R2、R3、R4中有4个为F。
在另一优选例中，R1和/或R3为F。
在另一优选例中，R2和/或R4为F。
在另一优选例中，R5为甲基、Cl、三氟甲基、或SF5。
在另一优选例中，R6为H。
在另一优选例中，R7为C3烷基、或C3链烯基。
在另一优选例中，R7为正丙基、或-CH2-CH＝CH2。
在另一优选例中，当m＝2时，R0相同或不同。
在另一优选例中，R0为H、或甲基。
在另一优选例中，所述的化合物选自下组：
本发明第二方面提供了第一方面所述的式I化合物、或其盐、或其光学异构体、或其外消旋体、或其溶剂化物、或其前体的用途，用于制备农用制剂或组合物，所述农用制剂或组合物用于(i)增强植物抗逆性；(ii)植物保鲜处理(如鲜花保鲜)；和/或(iii)果实着色处理(如葡萄着色)。
在另一优选例中，所述农用制剂或组合物用于一种或多种以下用途：
(i)促进ABA受体PYL蛋白与PP2C蛋白磷酸酶的相互作用；
(ii)减弱叶片的蒸腾作用；
(iii)抑制种子萌发。
在另一优选例中，所述抗逆性为ABA相关的非生物胁迫抗逆性。
在另一优选例中，所述抗逆性选自下组：抗旱性、耐冷性、耐盐碱、耐渗透压、耐热性、或其组合。
在另一优选例中，所述植物为含有PYR/PYL家族ABA受体的植物。
在另一优选例中，所述植物包括苔藓、蕨类、裸子植物、单子叶植物和双子叶植物。
在另一优选例中，所述的植物包括农业植物、园艺植物、林业植物。
在另一优选例中，所述的植物包括木本植物、草本植物。
在另一优选例中，所述的植物包括完整的植株、器官(如根、茎、叶、枝、花、果实、种子)、组织(如愈伤组织)、或细胞。
在另一优选例中，所述的植物选自下组：禾本科、菊科、百合科、十字花科、蔷薇科、豆科、茶科、梧桐科、松科、胡桃科、胡椒科、木兰科、杜鹃花科、猕猴桃科、葡萄科、秋海棠科、凤梨科、银杏科、八角茴香科、姜科、石榴科、夹竹桃科、小檗科、芸香科、茄科、柏科、冬青科、棕榈科植物、或其组合。
在另一优选例中，所述植物选自下组：拟南芥、烟草、棉花、生菜、水稻、小麦、玉米、花生、高粱、燕麦、黑麦、甘蔗、大豆、马铃薯、荞麦、胡椒、葡萄、梨、苹果、香蕉、人参、番茄、辣椒、茄子、花椰菜、大白菜、油菜、黄瓜、西瓜、洋葱、向日葵、百合、玫瑰、菊花、牡丹、康乃馨、樟树、梧桐、松树、或其组合。
本发明第三方面提供了一种农用制剂，所述农用制剂包括：
(i)本发明第一方面所述的式I化合物、或其盐、或其光学异构体、或其外消旋体、或其溶剂化物、或其前体；和
(ii)农业上可接受的载体。
在另一优选例中，组分(i)在农用制剂中的含量为0.1-1000μM，较佳地，1-200μM，更佳地，5-100μM。
在另一优选例中，所述农用制剂中，含有0.0001-99wt％，较佳地0.1-90wt％的组分(i)，以农用制剂的总重量计。
在另一优选例中，所述农用制剂还包括额外的抗旱剂(如抗旱种衣剂、抗旱保水剂、或抗旱喷洒剂)或其他农用活性成分。
在另一优选例中，所述的农用活性成分选自下组：杀真菌剂、除草剂、杀虫剂、杀线虫剂、杀昆虫剂、植物激活剂、增效剂、植物生长调节剂、杀螨剂。
在另一优选例中，所述农用制剂还包括表面活性剂(如阳离子型、阴离子型、两性、或非离子型表面活性剂)。
在另一优选例中，所述农用制剂的剂型选自下组：溶液剂、乳剂、混悬剂、粉剂、泡沫剂、糊剂、颗粒剂、气雾剂、或其组合。
本发明第四方面提供了一种增强植物抗逆性的方法，给所述植物施用本发明第一方面所述的式I化合物、或其盐、或其光学异构体、或其外消旋体、或其溶剂化物、或其前体或施用本发明第三方面所述的农用制剂。
在另一优选例中，所述施用选自下组：喷洒或灌溉。
在另一优选例中，所述施用的剂量为2-100g/公顷，较佳地，4-80g/公顷，更佳地，6-60g/公顷。
在另一优选例中，所述施用的剂量为1-5000微克/株，较佳地，10-2500微克/株，更佳地，20-1000微克/株。
本发明第五方面提供了一种式I化合物或其盐的制法，包括步骤：
(a)在惰性溶剂中，将式Ia-6化合物与式Ia-4化合物进行反应，从而形成式I化合物；
上述各式中，R0、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、m和如上定义。
在另一优选例中，所述反应在缚酸剂的存在下进行。
在另一优选例中，所述缚酸剂选自下组：碳酸钾、三乙胺、吡啶或其组合。
在另一优选例中，所述惰性溶剂选自下组：DMF、DCM、乙腈或其组合。
在另一优选例中，所述反应温度为0-150℃(或回流温度)，较佳地，20-60℃，更佳地，25-40℃。
在另一优选例中，所述反应时间为0.1-72小时，更佳地，1-24小时，更佳地，2-20小时。
本发明第六方面提供了一种植物保鲜处理方法，包括步骤：
将待保鲜的植物与本发明第一方面所述的式I化合物、或其盐、或其光学异构体、或其外消旋体、或其溶剂化物、或其前体进行接触，从而对植物保鲜。
在另一优选例中，所述的植物包括完整的植株、或植物器官(如根、茎、叶、枝、花、果实)。
在另一优选例中，所述的植物保鲜处理包括鲜花保鲜。
本发明第七方面提供了一种果实着色处理方法，包括步骤：
将待着色的果实与本发明第一方面所述的式I化合物、或其盐、或其光学异构体、或其外消旋体、或其溶剂化物、或其前体进行接触，从而对果实着色。
在另一优选例中，所述的果实包括葡萄。
本发明第八方面提供了一种本发明第一方面所述的式I化合物、或其盐、或其光学异构体、或其外消旋体、或其溶剂化物、或其前体的用途，其特征在于，用于制备(i)ABA受体的激动剂；和/或(ii)种子萌发抑制剂。
在另一优选例中，所述的激动剂促进ABA受体PYL蛋白与PP2C蛋白磷酸酶的相互作用。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示本发明的两种AMX化合物0604c和0918可以结合于拟南芥PYR/PYL受体(PYR1、PYL1、PYL2和PYL7)-HAB1复合物,进而抑制蛋白磷酸酶HAB1的活性。在1μM浓度下，抑制效果均显著优于ABA。
图2显示了六种AMX化合物(0604c、0918、1125A、1125B、1127和1103B)以及ABA的拟南芥PYR/PYL受体激动剂的剂量响应曲线。AMX化合物可以促进蛋白磷酸酶HAB1与四种拟南芥PYR/PYL受体(PYR1、PYL1、PYL2和PYL7)的相互作用，且该作用存在剂量依赖效应。
图3显示三种AMX化合物(0925、1020A和1020B)和ABA的PYR/PYL受体激动剂的剂量响应曲线。AMX化合物可促进蛋白磷酸酶HAB1与三种PYR/PYL受体(PYR1、PYL1和PYL2)的相互作用，且该相互作用存在剂量依赖效应。
图4a至4i分别显示ABA(a)、现有ABA类似物(b)或本发明多个AMX化合物(c至i)与PYL2-HAB1复合体口袋结构内多个氨基酸残基相互作用的二维结构。图中显示了水分子、氮原子、氧原子和卤素原子，虚线代表氢键，其上的数字则表示两个原子/分子之间的距离(单位是埃，)。结果显示，与现有的ABA或其类似物相比，本发明的AMX化合物与PYL2口袋结构内的氨基酸残基形成更多氢键，这使得AMX与PYL2-HAB1复合体的结合更加紧密。
图5显示用本发明不同AMX化合物处理6小时后，野生型拟南芥体内受ABA诱导的胁迫相关基因的转录水平变化。DMSO和ABA处理分别为阴性和阳性对照组。
图6显示1μM浓度下，不同AMX化合物和ABA对于Col-0和pyr1；pyl1；pyl4三突变体种子萌发的影响。每个培养皿的左半边播种Col-0，右半边播种pyr1；pyl1；pyl4三突变体。照片为pyr1；pyl1；pyl4三突变体种子萌发4天后(播种6天后)拍摄。DMSO处理为对照组。
图7a和7b显示本发明AMX化合物处理显著降低了拟南芥叶面的蒸腾速率，导致叶面温度升高。
图7a显示了5μM AMX化合物和ABA处理后，叶面温度较DMSO处理显著增加。其中0918和1127在处理四天后仍能显著抑制叶面蒸腾作用。
图7b显示了AMX化合物对于叶面蒸腾作用的抑制效应存在浓度依赖效应，相同浓度下抑制效果排序为1127>0918>1125A。
图8显示土壤干旱实验结果。短日照环境中生长3周的野生型拟南芥植物(Col-0)停止浇水并喷施相应浓度的化合物。DMSO作为负对照。其中，图8a显示了首次喷施化合物当天和17天后的植物生长状况，实验中使用的化合物浓度为10μM；图8b显示了首次喷施化合物当天，18和20天后的植物生长状况，实验中使用的化合物浓度为5μM；图8c显示了首次喷施化合物当天和14天后的植物生长状况，实验中使用的化合物浓度为10μM。
图9显示三种AMX化合物(0604c,0918和1127)以及ABA的大豆PYR/PYL受体激动剂剂量响应曲线。AMX化合物可以促进拟南芥蛋白磷酸酶HAB1与二种大豆PYR/PYL受体(GmPYL3和GmPYL6)的相互作用，且该相互作用存在剂量依赖效应。
图10显示了50μM AMX化合物1127处理3天后仍能显著降低拟南芥叶面的蒸腾速率，导致叶面温度升高。
图11显示了大豆和玉米的土壤干旱实验结果。大豆实验中，选取生长一致的大豆植株，在干旱一周后复水，照片显示了复水一个月后的整体生长状况。实验中各测试化合物浓度为50μM。玉米实验方法同大豆实验。实验中化合物0918浓度为50μM。复水后经AMX处理的大豆和玉米的存活率均要显著高于对照组。
图12显示了AMX化合物1127的水悬浮剂处理后的葡萄果皮花色苷含量显著高于清水对照组。花色苷含量与葡萄果皮上色成正相关。
图13显示了本发明化合物0720B可以结合于拟南芥PYR/PYL受体(PYR1、PYL1、PYL2和PYL7)-HAB1复合物，进而抑制蛋白磷酸酶HAB1的活性。在1μM浓度下，抑制效果均显著优于ABA。
图14显示了本发明化合物0720B和ABA的拟南芥PYR/PYL受体激动剂的剂量响应曲线。0720B化合物可以促进蛋白磷酸酶HAB1与两种拟南芥PYR/PYL受体(PYR1和PYL2)的相互作用，且该作用存在剂量依赖效应。
图15显示了AMX化合物(0720B)处理显著降低了大豆叶面的蒸腾速率，导致叶面温度升高。播种16天后的大豆植株停止浇水，同时喷施相应化合物，与对照组(DMSO)相比，喷施10/20/50μM的化合物0720B可显著降低大豆叶面的蒸腾速率，且抑制效果优于喷施50μMABA。
图16显示了AMX化合物(0720B)处理显著降低了棉花叶面的蒸腾速率，导致叶面温度升高。播种23天后的棉花植株停止浇水，同时喷施50μM的化合物0720B，与对照组(DMSO)相比，50μM的化合物0720B均可显著降低棉花叶面的蒸腾速率，且抑制效果优于50μM ABA。
图17显示了大豆的土壤干旱实验结果。图15中的大豆在干旱11天后复水，照片显示了复水一天后的大豆生长状况。经10/20/50μM的化合物0720B处理的大豆长势要显著优于对照组(DMSO)或50μM ABA处理的大豆。
图18显示了棉花的土壤干旱实验结果。照片显示了图16中的棉花在干旱10天后的生长状况。经50μM化合物0720B处理的棉花长势要显著优于对照组(DMSO)或50μM ABA处理的棉花。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一类具有高脱落酸(ABA)活性的ABA替代物(本发明化合物)。本发明化合物具有明显高于现有ABA类似物的活性，能够显著增强植物的多种抗逆性(如抗旱、耐冷等)。此外，本发明化合物制法简便，且具有优异的环境友好性和作用迅速等优点，因此，具有广泛的应用前景。在此基础上完成了本发明。
实验表明，本发明化合物(简称为AMX化合物)不仅活性优于脱落酸(AbscisicAcid，ABA)以及现有的ABA类似物(如4-甲基-氮-(1,2,3,4-四氢-2-羰基-1-丙基-6-喹啉基)-苯甲基磺酰胺(4-methyl-N-(1,2,3,4-tetrahydro-2-oxo-1-propyl-6-quinolinyl)-benzene methanesulfonamide))，而且可结合于多个不同PYL受体，可显著增强各种不同植物的抗逆性。
基团定义
如本文所用，术语“C1-C7烷基”是指具有1-7个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、或类似基团。
如本文所用，术语“C2-C7链烯基”指具有2-7个碳原子的直链或支链的烯基，例如乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、或类似基团。
如本文所用，术语“C2-C7链炔基”是指具有2-7个碳原子的直链或支链的炔基，例如乙炔基、丙炔基、或类似基团。
如本文所用，术语“C1-C3烷基”是指具有1-3个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、或类似基团。
如本文所用，术语“C1-C3卤代烷基”是指氢被1个或1个以上的卤素取代的具有1-3个碳原子的直链或支链烷基，例如，卤代甲基、卤代乙基、卤代丙基、卤代异丙基、或类似基团。
如本文所用，术语“C3-C7环烷基”指具有3-7个碳原子的环状烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、或类似基团。
如本文所用，术语“卤素”是指氟、氯、溴、或碘，优选氟和氯。
如本文所用，术语“卤代的”指被相同或不同的一个或多个上述卤原子取代的基团，可以部分卤代或全部卤代，例如三氟甲基、五氟乙基、七氟异丙基、或类似基团。
本发明的化合物可以含有一个或多个不对称中心，并因此以消旋体、外消旋混合物、单一对映体、非对映异构体化合物和单一非对映体的形式出现。可以存在的不对称中心，取决于分子上各种取代基的性质。每个这种不对称中心将独立地产生两个旋光异构体，并且所有可能的旋光异构体和非对映体混合物和纯或部分纯的化合物包括在本发明的范围之内。本发明包括化合物的所有异构形式。
式I化合物及其制备方法
如本文所用，术语“本发明化合物”、“AMX化合物”、"化合物AMX"、“本发明ABA替代物”、“式I化合物”可互换使用，均指具有式I所示结构的化合物。此外，所述术语还包括式I化合物的盐、光学异构体、外消旋体、溶剂化物(如水合物)、和/或前体，
其中，R0、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、m、的定义如前所述。
下面更具体地描述本发明式I化合物的制备方法，但这些具体方法不对本发明构成任何限制。本发明化合物还可以任选将在本说明书中描述的或本领域已知的各种合成方法组合起来而方便的制得，这样的组合可由本发明所属领域的技术人员容易的进行。通常，在本发明的制备方法中，各反应大多在惰性溶剂中，在0℃至150℃(或回流温度)(较佳地，20-60℃，或25－40℃)下，反应一段时间(如0.1-72小时，较佳地2－20小时)。
较佳地，本发明式I化合物可以通过以下方案及实施例中所述的示例性方法以及本领域技术人员所用的相关公开文献操作完成。
典型地，本发明的式Ia和/或Ib化合物的制备方法可包括(但不限于)如下流程。
方案I(以R6＝H且R7＝丙基为例)
(1)制备6-氨基-1-丙基-喹啉酮
步骤1：在碱(如碳酸钾，氢化钠)存在下，在惰性溶剂(如DMF)中，首先将式Ia-1化合物与卤代烷在一定温度(如25-40℃)下进行反应一段时间，形成式Ia-2化合物。
步骤2：在酸(如硫酸)存在下，式Ia-2化合物与硝酸钾在一定温度(如0-20℃)下进行反应一段时间，形成式Ia-3化合物。
步骤3：在惰性溶剂(如甲醇)中，以钯碳作催化剂，在一定温度(如10-40℃)下，将式Ia-3化合物进行还原反应，形成式Ia-4化合物。
(2)制备对甲基卤代苄磺酰氯
步骤4：在惰性溶剂(如乙醇、乙腈)中，式Ia-5化合物(如对甲基苄溴或对甲基苄氯)与硫脲反应，形成反应产物。然后，在酸(如浓盐酸)存在下，在惰性溶剂(如乙腈)中，将所述反应产物和亚氯酸钠在一定温度(如0-20℃)下进行反应一段时间，形成式Ia-6化合物。
(3)制备式Ia/Ib化合物
步骤5：在惰性溶剂(如DMF)中，在缚酸剂(如碳酸钾)存在下，式Ia-6化合物与式Ia-4化合物在一定温度(如25-40℃)下进行反应一段时间，从而得到式Ia/Ib化合物。
方案I中，X2为离去基团，为氯、溴、碘。其它各取代基和基团如说明书中所定义。表示单键或双键。
本发明的式Ic化合物的制备方法可包括(但不限于)如下流程：
方案II(以m＝1，R6为H，R7＝丙基且R0为甲基为例)
(1)制备6-氨基-4-甲基-1-丙基-2(1H)-喹啉酮
步骤1：在催化剂(如钯碳，二氧化铂)存在下，在惰性溶剂(如乙酸，乙酸乙酯)中，在一定温度下(如50-80℃)下Ia-7进行氢化反应一段时间，形成式Ia-8化合物。
步骤2：在碱(如碳酸钾，氢化钠)存在下，在惰性溶剂(如DMF)中，首先将式Ia-8化合物与卤代烷在一定温度(如25-40℃)下进行反应一段时间，形成式Ia-9化合物。
步骤3：在酸(如硫酸)存在下，将式Ia-9化合物与硝酸钾在一定温度(如0-20℃)下进行反应一段时间，形成式Ia-10化合物。
步骤4：在惰性溶剂(如甲醇)中，以钯碳作催化剂，在一定温度(如10-40℃)下，将式Ia-10化合物进行还原反应，形成式Ia-11化合物。
(2)制备对甲基卤代苄磺酰氯
步骤5：在惰性溶剂(如乙醇、乙腈)中，式Ia-5化合物(如对甲基苄溴或对甲基苄氯)与硫脲反应，形成反应产物。然后，在酸(如浓盐酸)存在下，在惰性溶剂(如乙腈)中，将所述反应产物和亚氯酸钠在一定温度(如0-20℃)下进行反应一段时间，形成式Ia-6化合物。
(3)制备式Ic化合物
步骤6：在惰性溶剂(如DMF)中，在缚酸剂(如碳酸钾)存在下，式Ia-6化合物与式Ia-11化合物在一定温度(如25-40℃)下进行反应一段时间，从而得到式Ic化合物。
方案II中，X2为离去基团，为氯、溴、碘。其它各取代基和基团如说明书中所定义。
农用制剂
可将本发明的活性物质(式I化合物、或其盐、或其光学异构体、或其外消旋体、或其溶剂化物、或其前体)以常规的方法制备成农用制剂，例如溶液剂、乳剂、混悬剂、粉剂、泡沫剂、糊剂、颗粒剂、气雾剂、用活性物质浸渍的天然的和合成的材料、在多聚物中的微胶囊、用于种子的包衣剂。
这些制剂可用已知的方法生产，例如，将活性化合物与扩充剂混合，这些扩充剂就是液体的或液化气的或固体的稀释剂或载体，并可任意选用表面活性剂即乳化剂和/或分散剂和/或泡沫形成剂。例如在用水作扩充剂时，有机溶剂也可用作助剂。
用液体溶剂作稀释剂或载体时，基本上是合适的，如：芳香烃类，例如二甲苯，甲苯或烷基萘；氯化的芳香或氯化的脂肪烃类，例如氯苯，氯乙烯或二氯甲烷；脂肪烃类，例如环己烷或石蜡，例如矿物油馏分；醇类，例如乙醇或乙二醇以及它们的醚和脂类；酮类，例如丙酮，甲乙酮，甲基异丁基酮或环已酮；或不常用的极性溶剂，例如二甲基甲酰胺和二甲基亚砜，以及水。
就液化气的稀释剂或载体说，指的是在常温常压下将成为气体的液体，例如气溶胶推进剂，如卤化的烃类以及丁烷，丙烷，氮气和二氧化碳。
固体载体可用研磨的天然矿物质，例如高岭土，粘土，滑石，石英，活性白土，蒙脱土，或硅藻土，和研磨合成的矿物质，例如高度分散的硅酸，氧化铝和硅酸盐。供颗粒用的固体载体是碾碎的和分级的天然锆石，例如方解石，大理石，浮石，海泡石和白云石，以及无机和有机粗粉合成的颗粒，和有机材料例如锯木屑，椰子壳，玉米棒子和烟草梗的颗粒等。
非离子的和阴离子的乳化列可用作乳化剂和/或泡沫形成剂。例如聚氧乙烯-脂肪酸酯类，聚氧乙烯-脂肪醇醚类，例如烷芳基聚乙二醇醚类，烷基磺酸酯类，烷基硫酸酯类，芳基磺酸酯类以及白蛋白水解产物。分散剂包括，例如木质素亚硫酸盐废液和甲基纤维素。
在制剂中可以用粘合剂，例如羧甲基纤维素和以粉末，颗粒或乳液形式的天然和合成的多聚物，例如阿拉伯胶，聚乙烯基醇和聚乙烯醋酸酯。
可以用着色剂例如无机染料，如氧化铁，氧化钻和普鲁士蓝；有机染料，如有机染料，如偶氮染料或金属钛菁染料；和用痕量营养剂，如铁，猛，硼，铜，钴，铝和锌的盐等。
在本发明中，所述“农用制剂”通常是农用植物生长调节剂，其含有式I化合物或其盐、其光学异构体、外消旋体、溶剂化物或前体作为增强植物抗逆性(如抗旱性)的活性成分；以及农业上可接受的载体。
如本文所用，所述“农业上可接受的载体”是用于将本发明的式I化合物或其盐、光学异构体、外消旋体、溶剂化物或前体传送给植物的农药学上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。适用于本发明的农业上可接受的载体选自下组：水、缓冲液、DMSO、表面活性剂如Tween-20、或其组合。任何本领域技术人员已知的农业上可接受的载体均可用于本发明中。
本发明的农用制剂可与其他抗旱剂制成一种混合物存在于它们的商品制剂中或从这些制剂制备的使用剂型中，这些其他的抗旱剂包括(并不限于)：抗旱种衣剂、抗旱保水剂、或抗旱喷洒剂等。
此外，本发明的农用制剂也可与增效剂制成一种混合物存在于它们的商品制剂中或从这些制剂制备的使用剂型中，这些增效剂是提高活性化合物作用的化合物，由于活性化合物本身有活性，也可不必加增效剂。
本发明所述的农用制剂的剂型可以是多种多样的，只要能够使活性成分有效地到达植物体内的剂型都是可以的，从易于制备和施用的立场看，优选的农用制剂是一种喷雾剂或溶液制剂。
本发明所述的农用制剂通常含有占所述农用制剂总重量的0.0001-99wt％，较佳地0.1-90wt％的本发明化合物。商品制剂或使用剂型中的本发明化合物的浓度可在广阔的范围内变动。商品制剂或使用剂型中的本发明化合物的浓度可从0.0000001-100％(g/v)，最好在0.0001与1％(g/v)之间。
增强植物抗逆性的方法
本发明提供了一种增强植物抗逆性(如抗旱性)的方法，包括步骤：给植物施用式I化合物或其盐、其光学异构体、外消旋体、溶剂化物或前体、或其相应的的农用制剂。
施用可采用已知的各种方法，例如，通过在植物叶片、繁殖材料上喷洒、喷雾、喷粉或播撒该化合物或含有该化合物的农用制剂，或以其他方式使植物接触该化合物或含有该化合物的农用制剂，如果是种子，则通过涂布、包裹或以其他方式处理种子。另一种在种植前直接处理植物或种子的方法，还可将本发明的农用制剂引入土壤或其他待播种种子的培养基。在一些实施方案中，还可以使用载体，所述载体可以是如上所述的固态、液态。
在一优选实施方式中，还可以通过喷洒(如飞机喷洒)或灌溉将该化合物或含有该化合物的农用制剂递送给所述植物。
其他应用
本发明的化合物可以用作植物保鲜剂，所述植物包括(但不限于)：鲜花、园艺植物等，尤其对鲜花(如非洲菊)有着非常显著的保鲜效果。
本发明的化合物还可以用作果实着色剂，其中，所述果实包括(但不限于)葡萄。
本发明的主要优点包括：
首次开发了一类具有高脱落酸(ABA)活性的ABA替代物(本发明化合物)。本发明化合物具有明显高于现有ABA类似物的活性，能够显著增强植物的多种抗逆性(如抗旱、耐冷等)。此外，本发明化合物制法简便，且具有优异的环境友好性，因此，具有广泛的应用前景。在此基础上完成了本发明。
实验表明，本发明化合物(简称为AMX化合物)不仅活性优于脱落酸(AbscisicAcid，ABA)以及现有的ABA类似物(如4-甲基-氮-(1,2,3,4-四氢-2-羰基-1-丙基-6-喹啉基)-苯甲基磺酰胺(4-methyl-N-(1,2,3,4-tetrahydro-2-oxo-1-propyl-6-quinolinyl)-benzene methanesulfonamide))，而且可结合于多个不同PYL受体，可显著增强各种不同植物的抗逆性。
(1)本发明首次合成了天然脱落酸(Abscisic Acid，ABA)的高活性的替代物AMX化合物。本发明的AMX化合物能够显著增强植物多种抗逆性(如抗旱、耐冷)。并且，光学异构体或外消旋体的本发明化合物均具有高活性。
(2)本发明的AMX化合物的活性显著优于脱落酸(Abscisic Acid，ABA)以及现有的ABA类似物。
(3)本发明化合物AMX对于多个PYR/PYL受体蛋白与PP2C蛋白磷酸酶HAB1的相互作用均有促进作用，且对PYR1、PYL1、PYL2、PYL7的促进作用尤为显著。
(4)本发明化合物更容易被植物吸收，且作用迅速。
(5)本发明化合物对环境友好，对哺乳动物无害。
(6)本发明化合物的合成方法简单、成本低廉。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
材料和通用方法
材料
实验中使用的模式植物均为常规的或市售的品种，其中拟南芥(Arabidopsisthaliana)包括：哥伦比亚(Col-0)生态型和基于Col-0生态型的ABA合成突变体aba2-1和ABA受体PYL三突变体pyr1；pyl1；pyl4；大豆品种为Williams 82，棉花品种为陆地棉R15，玉米品种为丹玉402。
化合物AM1：现有的ABA类似物，化学名称为4-甲基-氮-(1,2,3,4-四氢-2-羰基-1-丙基-6-喹啉基)-苯甲基磺酰胺(4-methyl-N-(1,2,3,4-tetrahydro-2-oxo-1-propyl-6-quinolinyl)-benzene methanesulfonamide)。
AMX化合物：本发明所述的各化合物(如0604c等)见实施例1-17。
植物生长
拟南芥生长温度为22℃，生长在植物生长培养基上的植物(如种子萌发实验和基因表达分析)的光周期为长日照(24小时光照)，生长在土壤中的植物(如叶面蒸腾实验和土壤干旱实验)的光周期为短日照(8小时光照/16小时黑暗)，光强为75μmol·m–2·s–1。
大豆生长温度为26℃，光周期为16小时光照/8小时黑暗。玉米的生长温度为27℃，光周期为11小时光照/13小时黑暗；棉花生长温度为26℃，光周期为14小时光照/10小时黑暗，光强均为400μmol·m-2·s-1。
如无特殊指明，实验中使用的植物生长培养基均为含1％(w/v)蔗糖和0.6％(w/v)琼脂的1/2MS(Murashige and Skoog)固体培养基。
蛋白表达纯化
带6×His和SUMO双标签序列的拟南芥基因PYL1(氨基酸序列36-211)，PYL2(氨基酸序列14-188)和带Biotin标签序列的拟南芥基因HAB1(氨基酸序列172-511)的重组质粒的构建方法详见“A gate-latch-lock mechanism for hormone signalling by abscisicacid receptors”(Nature,Vol 462,2009)，带6×His和SUMO双标签序列的其他拟南芥PYL基因，包括PYR1，PYL3，PYL4，PYL5，PYL6，PYL7，PYL8，PYL9和PYL10(以上9个基因均为全基因编码序列)，以及大豆PYL基因(包括GmPYL3和GmPYL6)的重组质粒的构建方法与PYL1/PYL2相同。
将上述重组质粒转入感受态细胞大肠杆菌BL21(DE3)，接种到含有Amp抗性的200ml LB液体培养基，37℃200rpm培养过夜；按1:50-1:100接种至2L含有Amp抗性的LB液体培养基中进行扩大培养，37℃200rpm培养3-4小时，16℃低温培养至OD600＝0.8-1.0左右。带6×His和SUMO双标签序列的PYR1/PYL1/PYL2/PYL7的重组质粒用100μM IPTG诱导过夜，而带Biotin标签序列的HAB1重组质粒要用100μM IPTG和40μM biotin同时进行诱导。
将诱导16小时后的菌液在低速大容量离心机中离心收集菌体，4℃以4000rpm转速离心20min。每2L菌液用50ml提取缓冲液(含20mM Tris，pH 8.0，200mM NaCl和10％(v/v)甘油)重悬菌体，然后在4℃进行1000Pa压力破碎3-5次。破碎后的细胞进行超速离心，16000rpm离心30min，重复2次，收集上清液过亲和层析柱。
对于带6×His和SUMO双标签序列的PYR/PYL蛋白，选择50ml亲和层析Ni柱(50mlNi-NTA column，购自GE公司)；先用10％缓冲液B(含20mM Tris，pH 8.0，200mM NaCl，500mMimidazole和10％甘油)平衡600ml，再用200ml 50％缓冲液B洗脱，最后用100ml100％缓冲液B洗脱；用于晶体解析的蛋白与ulp1酶以1000：1的摩尔比混合进行酶切透析过夜；酶切后的蛋白再过一次亲和层析Ni柱；收集液用洗脱溶液(含25mM Tris，pH 8.0，200mM ammoniumacetate，1mM dithiotreitol和1mM EDTA)过HiLoad 26/60Superdex200凝胶过滤柱(购自GE公司)进一步分离纯化蛋白。
对于带Biotin标签序列的HAB1蛋白，过50ml MBP亲和层析柱(购自GE公司)；先用10％缓冲液C(含20mM Tris，pH 8.0，200mM NaCl，10mM Maltose和10％甘油)平衡600ml，再用200ml 50％缓冲液C洗脱，最后用100ml 100％缓冲液C洗脱；收集液用洗脱溶液(含20mMTris，pH 8.0，200mM NaCl和10％甘油)过HiLoad 26/60Superdex200凝胶过滤柱进一步分离纯化蛋白。
蛋白晶体解析
结晶前，将酶切后的PYL2和HAB1蛋白与化合物按1:1:5的摩尔比混合，浓缩到6mg/ml用于点晶体。采用悬滴法进行点晶体；用于结晶的孔缓冲液(well buffer)包含0.1MSuccinic acid和15％PEG3350、或0.2M丙二酸二钠(Di-sodium malonate)和20％PEG3350、或0.2M柠檬酸三钠(Tri-sodium Citrate)和20％PEG 3350、或0.2M甲酸镁(Magnesium formate)和20％PEG 3350。一天后可看到晶体出现，约3-4天可长到100-120μm。晶体用X射线衍射并收集衍射数据，再根据相关PYR/PYL受体结构模型来解析复合物结构。
AlphaScreen实验
采用AlphaScreen试剂盒(购自Perkin Elmer)，方法如下：150μl实验体系中含1:10稀释的10×buffer(50mM MOPS，pH 7.4，50mM NaF，50mM CHAPS，0.1mg/ml bovine serumalbumin)，各100nM带Biotin标签序列的HAB1和带6×His和SUMO双标签序列的PYR1/PYL1/PYL2/PYL7/GmPYL3/GmPYL6蛋白，相应浓度的(+)-ABA/AM1/AMX，5ug/ml供体珠(donorbeads)和受体珠(acceptor beads)(购自Perkin Elmer)，室温下避光孵育1.5小时后，置于Envision Plate Reader(购自Perkin Elmer)中按设定的AlphaScreen程序进行读数。
HAB1磷酸酶活性检测
反应体系中含50mM咪唑，pH 7.2，5mM MgCl2，0.1％β-巯基乙醇，0.5μg·ml-1BSA，100nM带Biotin标签序列的HAB1蛋白，500nM带6×His-SUMO双标签序列的PYL受体蛋白及相应浓度的(+)-ABA/AM1/AMX，室温孵育30分钟，随后加入含11个氨基酸的磷酸化多肽作为底物继续反应30分钟，该磷酸化多肽为SnRK2.6蛋白激酶的170-180位氨基酸(序列HSQPKpSTVGTP)，购自金斯瑞，其中175位的磷酸化丝氨酸，为已知的HAB1脱磷酸化靶位点。30分钟后加入显色试剂(购自BioVision)，用酶标仪(购自Molecular Device)读取650nm波长的吸收值。
基因表达分析
取全植株或叶子，用常规方法进行RNA抽提、经逆转录后进行荧光定量PCR。每种处理取3个生物学重复并进行两次实验重复，ACT7基因被用作内参。
种子萌发和土壤干旱实验
(1)种子萌发
拟南芥Col-0生态型和PYL受体三缺失突变体(pyr1；pyl1；pyl4)的种子用NaClO消毒后置于4℃春化3天，然后播种在含1μM(+)-ABA/AM1/0604c/0918/1127等多种AMX化合物或0.05％DMSO(对照)的1/2MS固体培养基上。每个6cm直径的培养基上同时播种两个株系，每个株系播种15粒种子，每种化合物设4个重复。培养基置于22℃长日照培养，5天后拍照。
(2)植物叶面蒸腾实验
拟南芥叶面蒸腾实验使用ABA合成突变体aba2-1。在环境胁迫条件下，该突变体中的内源ABA含量并不增加，仅为同样条件下野生型拟南芥Col-0中的1/40，因此使用该突变体可以排除内源ABA对于蒸腾实验的影响。持续浇水三周后的植物一次性喷施含0.05％tween-20和相应浓度的DMSO(对照)/(+)-ABA/0918/1127化合物，使用量为1.2ml/盆，喷施前和喷施后每天在相同时间段使用FLIR A655sc红外热像仪成像。用于0604c，0918和1127的大豆叶面蒸腾实验使用Williams 82生态型在26℃长日照培养，3组3叶后一次性喷施，含0.05％tween-20和50μM的DMSO(对照)/(+)-ABA/0604c/0918/1127化合物，使用量为4ml/盆，喷施前和喷施后每天在相同时间段使用FLIR A655sc红外热像仪成像。
用于0720B实验的大豆和棉花叶面蒸腾实验在26℃长日照进行，分别在播种16天和23天后喷施含0.1％tween-20和相应浓度的(+)-ABA/0720B化合物或0.1％Tween-20和0.05％DMSO(对照)的溶液，使用量为4ml/盆，喷施前和喷施后每天在相同时间段使用FLIRA655sc红外热像仪成像。
(3)土壤干旱实验
拟南芥Col-0生态型种子用NaClO消毒后置于4℃春化3天后播种在1/2MS固体培养基上，生长6天后选取长势良好且大小一致的幼苗移入装满土的8×7×6cm3的花盆中。每个花盆装有相同重量的土并移入相同数目的植物(六株)以减少实验误差，所有的花盆均置于22℃短日照培养，两周后停止浇水进行干旱处理，期间每周向叶面喷洒一次含0.02％tween-20和相应浓度的(+)-ABA/AM1/0604c/0918/1127或0.02％tween-20和0.05％DMSO(对照)的溶液，喷施量为2ml溶液/盆，干旱过程中每天变换花盆位置以减少环境因素引起的误差，整个干旱期间总计喷施两次溶液，定期拍照记录。约三周后恢复浇水。
用于0918和1127的大豆和玉米的土壤干旱实验与拟南芥类似，每盆只包含一株植物，所有的大豆植株均在26℃长日照培养，3组3叶后停止浇水，选择长势一致的植株进行干旱处理，玉米则在小喇叭口期停止浇水进行干旱处理。干旱处理期间每三天向叶面喷洒一次含0.05％tween-20和50μM(+)-ABA/0918/1127或0.05％tween-20和0.05％DMSO(对照)的溶液，喷施量为4ml/盆，同时变换花盆位置。一周后恢复浇水。
用于进行0720B相关叶面蒸腾实验的大豆和棉花同时用于土壤干旱实验，每个花盆只包含一株植物并装有相同重量的土以减少实验误差。所有的大豆植株均在26℃长日照培养，播种16天后停止浇水，选择长势一致的植株进行干旱处理。干旱开始时向叶面喷施一次含0.1％Tween-20和相应浓度的(+)-ABA/0720B或0.1％Tween-20和0.05％DMSO(对照)的溶液，此后每3天喷施一次，喷施量为4ml/盆，同时变换花盆位置，干旱11天后复水并在复水一天后拍照。棉花干旱实验与大豆类似，播种23天后停止浇水，选择长势一致的植株进行干旱处理。干旱开始时向叶面喷施一次含0.1％Tween-20和50μM(+)-ABA/0720B或0.1％Tween-20和0.05％DMSO(对照)的溶液，此后每4天喷施一次，喷施量为4ml/盆，同时变换花盆位置，干旱10天后拍照。
鲜花保鲜实验
市售云南百合品种“西伯利亚”二年生花苞，每支5个花苞，每支留10片叶，每瓶1支进行试验；分别将花枝插入10ppm(22.5μM)的AMX化合物1127水悬浮剂和自来水中，处理前和处理20天后记录花朵状况。
葡萄着色实验
实验使用的葡萄为市售品种巨峰。根据天气情况，在葡萄转色期，选取大小、长势均匀一致的果穗，分别用6％AMX化合物1127水悬浮剂2000mg/L、1000mg/L、500mg/L、100mg/L浸泡果穗10秒钟，清水浸泡作为对照。实验各处理重复10次，每个果穗为一次重复。成熟采收后取样，样品采集时分别从每个果穗的上、中、下3个部位的向光面、背光面两个方向进行采样，每穗采果6粒。带回实验室-20℃下保存备用。
用直径10mm的打孔器于葡萄果粒的赤道处上下均匀取30片果皮，混匀称其重量，进行果皮花色苷的测定。将果皮加入5ml含1％甲酸的甲醇溶液中，25℃下避光摇床萃取30min，然后用8000×g低温离心10min，收集上清液，残渣重复提取4次，合并上清液，30℃旋转蒸发除去甲酸和甲醇，然后用甲酸乙醇的水溶液(甲酸：乙醇：水＝2:10:88)溶解复溶，定容至5ml。用pH示差法测定花色苷的含量(以矢车菊苏-3-葡萄糖苷当量计算)，每个处理重复三次，花色苷含量(mg/g)X＝ΔA×F×M/ε×m，其中ΔA为吸光值；F为稀释倍数；M为矢车菊素-3-葡萄糖苷的相对分子质量449.2，ε为矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数26900；m为样品质量。
AMX毒理实验
AMX毒理实验包括：1)细菌回复突变实验来检测受试物是否具有诱发突变的作用，2)体外微核实验检测受试物是否在非代谢活化系统条件(-S9)具有诱导中国仓鼠肺细胞(CHL)微核率升高的作用和3)通过SD大鼠单次经口灌胃受试物最大耐受量实验来初步估测毒性作用的靶器官和可能的毒作用机理。实验中使用的受试物为AMX化合物1127。
细菌回复突变实验使用菌株为TA98和TA100两种鼠伤寒沙门氏菌株，实验在非代谢活化系统条件(-S9)下采用标准平板掺入法进行实验，共设定5g/皿、15g/皿、50g/皿、150g/皿、500g/皿、1500g/皿和5000g/皿7个剂量以及阴性对照和阳性对照。
体外微核实验中使用CHL细胞首先进行IC50测定实验，根据IC50测定结果设定体外微核实验给药剂量，共设定1μg/mL、20μg/mL、30μg/mL和40μg/mL4个给药剂量，同时设定阴性对照和阳性对照，在-S9条件下作用CHL细胞24h后进行制片，通过计数每个剂量500个细胞中的单核细胞、双核细胞和多核细胞数来计算该剂量的胞质分裂阻滞增殖指数(cytokinesis-block proliferation index，CBPI)和细胞毒性。
SD大鼠单次经口灌胃受试物最大耐受量实验选用8只SD大鼠，随机分为2组，每组4雌4雄。大鼠单次经口灌胃给药后，连续观察14天，于第15天解剖。对下列指标进行了评价：临床观察、体重和病理学(肉眼形态学)检查。
实施例1 化合物0604c的制备
1.1制备1-丙基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮
将1.47g(10mmol)3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮加入到20ml无水DMF，分批加入0.48g(60％in oil，12mmol)氢化钠，加毕搅拌0.5小时；滴加2.04g(12mmol)碘丙烷，室温反应16小时；冰浴下加入饱合氯化铵溶液淬灭反应，加入乙酸乙酯萃取。用饱和氯化钠水溶液洗涤，在加入无水硫酸钠干燥有机相。减压蒸去溶剂和过量的碘丙烷，得到油状1-丙基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮，未经纯化直接用于下一步。
1.2制备6-硝基-1-丙基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮
在冰水浴下将10ml浓硫酸加入到1.89g(10mmol)1-丙基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮中，并剧烈搅拌0.5小时；用滴液漏斗缓慢滴加硝酸钾/硫酸溶液(1.01g KNO3/10ml H2SO4)，维持反应温度低于5℃，并反应2小时；倾倒反应液入冰水中搅拌0.5h。过滤并用大量的水洗涤滤饼。用乙醇对粗品进行重结晶。得淡黄色固体1.65g，收率70％。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.16-7.05(m,3H),3.95(t,2H),3.00(t,2H),2.71(t,2H),1.72-1.63(m,2H),0.98(t,3H)ppm。
1.3制备6-氨基-1-丙基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮
将1.18g(5mmol)6-硝基-1-丙基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮加入到50ml甲醇中，再加入催化剂量钯碳。反应体系用氢气真空置换三次。室温搅拌8小时。反应液通过加入硅藻土的玻璃砂漏斗，滤去催化剂。浓缩滤液得6-氨基-1-丙基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮，未经纯化直接用于下一步。
1.4制备3-氟-4-甲基苄磺酰氯
取2.02g(10mmol)3-氟-4-甲基苄溴和0.76g(10mmol)硫脲溶于50ml无水乙醇中，然后慢慢加热至回流。反应4-6小时。减压蒸去溶剂。加入30ml乙腈和10ml浓盐酸。控制温度低于20℃，在剧烈搅拌下分批加入5.4g(60mmol)亚氯酸钠。在15-20℃下反应8-16小时。加入冰水终止反应。乙酸乙酯萃取。浓缩萃取液得2.03g白色固体。3-氟-4-甲基苄磺酰氯未经纯化直接用于下一步。
1.5制备0604c
将1.02g(5mmol)6-氨基-1-丙基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮和1.33g(6mmol)3-氟-4-甲基苄磺酰氯加入到30ml DMF中，再加入2.01g(15mmol)碳酸钾为缚酸剂。使反应保持在室温搅拌16小时。反应结束加入冰水，乙酸乙酯萃取。无水硫酸钠干燥。浓缩有机相。粗品用硅胶柱层析得到标题化合物，为淡黄色固体1.38g，收率71％。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.58-6.90(m,6H),4.25(s,2H),3.85(t),2.83(t,2H),2.60(t,2H),2.22(s,3H),1.69-1.60(m,2H),0.95(t,3H)ppm。
实施例2 化合物1125A的制备
2-氟-4-甲基苄磺酰氯的制备方法同实施例1的步骤1.4，不同点在于，用2-氟-4-甲基苄溴代替3-氟-4-甲基苄溴。
将1.02g(5mmol)6-氨基-1-丙基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮和1.33g(6mmol)2-氟-4-甲基苄磺酰氯加入到30ml DMF中，再加入2.01g(15mmol)碳酸钾为缚酸剂。使反应保持在室温搅拌16小时。反应结束加入冰水，乙酸乙酯萃取。无水硫酸钠干燥。浓缩有机相。粗品用硅胶柱层析得到标题化合物，为淡黄色固体1.15g，收率60％。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.34-6.91(m,6H),4.36(s,2H),3.89(t,2H),2.87(t,2H),2.65(t,2H),2.34(s,3H),1.71-1.63(m,2H),0.98(t,3H)ppm。
实施例3 化合物1125B的制备
3，5-二氟-4-甲基苄磺酰氯的制备方法同实施例1的步骤1.4，不同点在于，用3，5-二氟-4-甲基苄溴代替3-氟-4-甲基苄溴。
将1.02g(5mmol)6-氨基-1-丙基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮和1.44g(6mmol)3，5-二氟4-甲基苄磺酰氯加入到30ml DMF中，再加入2.01g(15mmol)碳酸钾为缚酸剂。使反应保持在室温搅拌16小时。反应结束加入冰水，乙酸乙酯萃取。无水硫酸钠干燥。浓缩有机相。粗品用硅胶柱层析得到标题化合物0.98g，为淡黄色固体，收率48％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.75(s,1H),7.09-6.96(m,5H),4.49(s,2H),3.80(t,2H),2.80(t,2H),2.53(t,2H),2.13(s,3H),1.60-1.49(m,2H),0.88(t,3H)ppm。
实施例4 化合物0918的制备
2，3-二氟-4-甲基苄磺酰氯的制备方法同实施例1的步骤1.4，不同点在于，用2，3-二氟-4-甲基苄溴代替3-氟-4-甲基苄溴。
将1.02g(5mmol)6-氨基-1-丙基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮和1.44g(6mmol)2，3-二氟-4-甲基苄磺酰氯加入到30ml DMF中，再加入2.01g(15mmol)碳酸钾为缚酸剂。使反应保持在室温搅拌16小时。反应结束加入冰水，乙酸乙酯萃取。无水硫酸钠干燥。浓缩有机相。粗品用硅胶柱层析得到淡黄色固体1.12g，收率55％。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.09-6.79(m,5H),4.42(s,2H),3.89(t,2H),2.87(t,2H),2.65(t,2H),2.29(s,3H),1.73-1.63(m,2H),0.98(t,3H)ppm。
实施例5 化合物1127的制备
2，3，5，6-四氟-4-甲基苄磺酰氯的制备方法同实施例1的步骤1.4，不同点在于，用2，3，5，6-四氟-4-甲基苄溴代替3-氟-4-甲基苄溴。
将1.02g(5mmol)6-氨基-1-丙基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮和1.66g(6mmol)2，3，5，6-四氟-4-甲基苄磺酰氯加入到30ml DMF中，再加入2.01g(15mmol)碳酸钾为缚酸剂。使反应保持在室温搅拌16小时。反应结束加入冰水，乙酸乙酯萃取。无水硫酸钠干燥。浓缩有机相。粗品用硅胶柱层析得到标题化合物，为淡黄色固体1.56g，收率70％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.07(s,1H),7.08-7.05(m,3H),4.58(s,2H),3.81(t,2H),2.80(t,2H),2.53(t,2H),2.25(s,3H),1.57-1.48(m,2H),0.88(t,3H)ppm。
实施例6 化合物1020A的制备
3-氟-4-三氟甲基苄磺酰氯的制备方法同实施例1的步骤1.4，不同点在于，用3-氟-4-三氟甲基苄溴代替3-氟-4-甲基苄溴。
将1.02g(5mmol)6-氨基-1-丙基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮和1.65g(6mmol)3-氟-4-三氟甲基苄磺酰氯加入到30ml DMF中，再加入2.01g(15mmol)碳酸钾为缚酸剂。使反应保持在室温搅拌16小时。反应结束加入冰水，乙酸乙酯萃取。无水硫酸钠干燥。浓缩有机相。粗品用硅胶柱层析得到标题化合物，淡黄色固体0.85g，收率39％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.02(s,1H),7.79-6.99(m,6H),4.63(s,2H),3.80(t,2H),2.78(t,2H),2.48(t,2H),1.56-1.47(m,2H),0.87(t,3H)ppm。
实施例7 化合物1020B的制备
2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄磺酰氯的制备方法同实施例1的步骤1.4，不同点在于，用2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄溴代替3-氟-4-甲基苄溴。
将1.02g(5mmol)6-氨基-1-丙基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮和1.98g(6mmol)2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄磺酰氯加入到30ml DMF中，再加入2.01g(15mmol)碳酸钾为缚酸剂。使反应保持在室温搅拌16小时。反应结束加入冰水，乙酸乙酯萃取。无水硫酸钠干燥。浓缩有机相。粗品用硅胶柱层析得到标题化合物，为黄色固体0.85g，收率35％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.17(s,1H),7.07-7.05(m,3H),4.74(s,2H),3.78(t,2H),2.79(t,2H),2.48(t,2H),1.56-1.49(m,2H),0.86(t,3H)ppm。
实施例8 化合物1103B的制备
3-氯-4-甲基苄磺酰氯的制备方法同实施例1的步骤1.4，不同点在于，用3-氯-4-甲基苄溴代替3-氟-4-甲基苄溴。
将1.02g(5mmol)6-氨基-1-丙基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮和1.43g(6mmol)3-氯-4-甲基苄磺酰氯加入到30ml DMF中，再加入2.01g(15mmol)碳酸钾为缚酸剂。使反应保持在室温搅拌16小时。反应结束加入冰水，乙酸乙酯萃取。无水硫酸钠干燥。浓缩有机相。粗品用硅胶柱层析得到标题化合物，为黄色固体0.96g，收率42％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.17(s,1H),7.41-6.96(m,6H),4.41(s,2H),3.81(t,2H),2.78(t,2H),2.23(t,2H),1.99(s,3H),1.56-1.50(m,2H),0.87(t,3H)ppm。
实施例9 化合物0925的制备
2-氟-4-氯苄磺酰氯的制备方法同实施例1的步骤1.4，不同点在于，用2-氟-4-氯苄溴代替3-氟-4-甲基苄溴。
将1.02g(5mmol)6-氨基-1-丙基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮和1.45g(6mmol)2-氟-4-氯苄磺酰氯加入到30ml DMF中，再加入2.01g(15mmol)碳酸钾为缚酸剂。使反应保持在室温搅拌16小时。反应结束加入冰水，乙酸乙酯萃取。无水硫酸钠干燥。浓缩有机相。粗品用硅胶柱层析得到标题化合物，为黄色固体0.83g，收率40％。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.63-6.90(m,6H),4.39(s,2H),3.87(t,2H),2.87(t,2H),2.61(t,2H),1.71-1.61(m,2H),0.96(t,3H)ppm。
实施例10 化合物0703B的制备
6-氨基-1-丙基-2(1H)-喹啉酮的制备方法同实施例1的步骤1.1，1.2，1.3，不同点在于：用2-羟基喹啉代替3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮。
将1.02g(5mmol)6-氨基-1-丙基-2(1H)-喹啉酮和1.33g(6mmol)3-氟-4-甲基苄磺酰氯加入到30ml DMF中，再加入2.01g(15mmol)碳酸钾为缚酸剂。使反应保持在室温搅拌16小时。反应结束加入冰水，乙酸乙酯萃取。无水硫酸钠干燥。浓缩有机相。粗品用硅胶柱层析得到标题化合物，为淡黄色固体1.44g，收率75％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.00(s,1H),7.81-6.59(m,8H),4.47(s,2H),4.17(t,2H),2.28(s,3H),1.66-1.57(m,2H),0.96(t,3H)ppm。
实施例11 化合物0717的制备
将1.01g(5mmol)6-氨基-1-丙基-2(1H)-喹啉酮和1.66g(6mmol)2，3，5，6-四氟-4-甲基苄磺酰氯加入到30ml DMF中，再加入2.01g(15mmol)碳酸钾为缚酸剂。使反应保持在室温搅拌16小时。反应结束加入冰水，乙酸乙酯萃取。无水硫酸钠干燥。浓缩有机相。粗品用硅胶柱层析得到标题化合物，为黄色固体1.35g，收率64％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.29(s,1H),7.86-6.60(m,5H),4.64(s,2H),4.15(t,2H),2.19(s,3H),1.69-1.57(m,2H),0.96(t,3H)ppm。
实施例12 化合物0707的制备
将1.01g(5mmol)6-氨基-1-丙基-2(1H)-喹啉酮和1.33g(6mmol)2-氟-4-甲基苄磺酰氯加入到30ml DMF中，再加入2.01g(15mmol)碳酸钾为缚酸剂。使反应保持在室温搅拌16小时。反应结束加入冰水，乙酸乙酯萃取。无水硫酸钠干燥。浓缩有机相。粗品用硅胶柱层析得到标题化合物(1.23g)，收率64％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.90(s,1H),7.91-6.59(m,8H),4.49(s,2H),4.16(t,2H),2.18(s,3H),1.67-1.55(m,2H),0.95(t,3H)ppm。
实施例13 化合物0714的制备
将1.02g(5mmol)6-氨基-1-丙基-2(1H)-喹啉酮和1.44g(6mmol)2，3-二氟-4-甲基苄磺酰氯加入到30ml DMF中，再加入2.01g(15mmol)碳酸钾为缚酸剂。使反应保持在室温搅拌16小时。反应结束加入冰水，乙酸乙酯萃取。无水硫酸钠干燥。浓缩有机相。粗品用硅胶柱层析得到标题化合物(1.45g)，为黄色固体，收率71％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.07(s,1H),7.87-6.61(m,8H),4.55(s,2H),4.15(t,2H),2.57(s,3H),1.67-1.58(m,2H),0.95(t,3H)ppm。
实施例14 化合物130925AMX的制备
6-氨基-1-烯丙基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮的制备方法同实施例1的步骤1.1，1.2和1.3，不同点在于：用3-溴丙烯代替3-碘丙烷。
将1.01g(5mmol)6-氨基-1-烯丙基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮和1.23g(6mmol)4-甲基苄磺酰氯加入到30mL DMF中，再加入2.01g(15mmol)碳酸钾为缚酸剂。使反应保持在室温搅拌16小时。反应结束加入冰水，乙酸乙酯萃取。无水硫酸钠干燥。浓缩有机相。粗品用硅胶柱层析得到化合物130925，为淡黄色固体1.36g，收率73％。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.22-6.93(m,7H),5.91-5.83(m，1H),5.25-5.13(dd,2H),4.54(s,2H),4.27(d,2H),2.89(t,2H),2.68(t,2H),2.32(s,3H)ppm。
类似地，重复上述步骤，用3-氟-4-甲基苄磺酰氯替代4-甲基苄磺酰氯，制得AMX化合物，即为130925AMX。
实施例15 化合物140228AMX的制备
6-氨基-4-甲基-1-丙基-2(1H)-喹啉酮的制备方法同实施例1的步骤1.1，1.2和1.3，不同点在于：用2-羟基-4-甲基喹啉代替3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮。
将1.08g(5mmol)6-氨基-4-甲基-1-丙基-2(1H)-喹啉酮和1.23g(6mmol)4-甲基苄磺酰氯加入到30ml DMF中，再加入2.01g(15mmol)碳酸钾为缚酸剂。使反应保持在室温搅拌16小时。反应结束加入冰水，乙酸乙酯萃取。无水硫酸钠干燥。浓缩有机相。粗品用硅胶柱层析得到化合物140228，为淡黄色固体1.15g，收率62％。
类似地，重复上述步骤，用3-氟-4-甲基苄磺酰氯替代4-甲基苄磺酰氯，制得AMX化合物，即为140228AMX。
实施例16 化合物0720B的制备
16.1制备4-甲基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮
将3.0g 4-甲基喹啉酮加入到200mL乙酸中，氮气氛围下加入300mg钯碳，用氢气置换三次。升温到70℃，反应12小时；玻璃砂漏斗加入硅藻土真空抽滤，滤液减压浓缩，得到2.7g淡黄色固体。收率为90％。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.11(s，1H),6.84-7.20(m，4H),3.04(m，1H),2.59(dd，1H)，2.22(dd，1H)，1.17(d，3H)ppm。
16.2制备4-甲基-1-丙基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮
将2.0g 4-甲基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮加入到80mL N，N-二甲基甲酰胺中，在冰水浴下搅拌分批加入1.05当量氢化钠，加完搅拌0.5小时；滴加1.1当量的碘丙烷，撤去冰水浴，反应12小时；加入饱和氯化铵溶液淬灭反应，加入乙酸乙酯萃取反应，合并有机相，用饱和氯化钠水溶液洗涤，在加入无水硫酸钠干燥有机相。减压蒸去溶剂和过量的碘丙烷，得到淡黄色油状液体2.2g。粗品未经过进一步纯化，粗收率为88％。
16.3制备4-甲基-6-硝基-1-丙基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮
在冰水浴下将20mL硫酸加入到盛有2.0g 4-甲基-1-丙基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮烧瓶中，并剧烈搅拌0.5小时；用滴液漏斗缓慢滴加1.1当量硝酸钾的硫酸溶液，维持冰水浴温度并反应1-2小时；倾倒反应液倒冰水中搅拌0.5小时。过滤并用大量的水洗涤滤饼。用乙醇对粗品进行重结晶。得1.8g 4-甲基-6-硝基-1-丙基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮，收率为77％。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.22-7,32(m,3H)，3.93(m,2H)，3.26(m,1H)，2.76(dd,1H)，2.44(dd,1H)，1.64(m,2H)，1.22(d,3H),0.89(t，3H)ppm。
16.4制备16-氨基-4-甲基-1-丙基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮
将1.8g 4-甲基-6-硝基-1-丙基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮加入到甲醇中，再加入钯碳作为催化剂。反应体系用氢气置换三次。室温搅拌8小时。反应液通过加入硅藻土的玻璃砂漏斗，滤去固体。浓缩滤液得1.4g 6-氨基-4-甲基-1-丙基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮。未进一步纯化直接进行下一步，收率为90％。
16.5制备2，3，5，6-四氟-4-甲基苄磺酰氯
取2，3，5，6-四氟-4-甲基苄氯和1当量的硫脲溶于乙醇中，然后慢慢加热至回流。反应4-6小时后浓缩反应液。加入乙腈和浓盐酸。控制温度5-10℃下，在剧烈搅拌下分批加入1.5当量的亚氯酸钠。在15-20℃下反应8-16小时。加入冰水终止反应。乙酸乙酯萃取三次。浓缩萃取液得2，3，5，6-四氟-4-甲基苄磺酰氯。未进一步纯化直接进行下一步。
16.6制备化合物0720B
将1.0g 6-氨基-4-甲基-1-丙基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮和1当量的2，3，5，6-四氟-4-甲基苄磺酰氯加入到DMF中，再加入3当量碳酸钾为缚酸剂。使反应保持在室温搅拌16小时。反应结束加入冰水，乙酸乙酯萃取。无水硫酸钠干燥。浓缩有机相。粗品用硅胶柱层析得1.5g化合物0720B，收率为70％。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.10(s,1H)，7.06-7.12(m,3H),4.59(s,2H),3.80(m,2H)，2.93(m,1H),2.61(dd,1H),2.31(dd,1H)，2.23(s,3H),1.60(m,2H)，1.11(d,3H),0.98(t，3H)ppm。
实施例17 化合物0825A的制备
17.1制备3-甲基-N-苯基-丁烯酰胺
将4.9g苯胺加入到100mL氯仿中，加入3摩尔当量的三乙胺。搅拌状态下滴加1.1摩尔当量的3-甲基丁烯酰氯，冰浴控温小于5摄氏度。滴加完毕，移去冰浴，缓慢升温至回流，反应2小时；减压蒸干得到8.2g 3-甲基-N-苯基-丁烯酰胺。收率为89％。
17.2制备4,4-二甲基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮
将7.0g 3-甲基-N-苯基-丁烯酰胺加入到50mL甲苯中，加入18g无水三氯化铝。缓慢升温至80℃。反应2.5小时；减压蒸干，硅胶柱层析纯化得到4.7g淡黄色固体。收率为67％1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.12(s,1H),6.86-7.29(m,4H),2.34(s,2H)，1.82(s，6H)ppm。
17.3制备4,4-二甲基-1-丙基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮
将4.0g 4,4-二甲基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮加入到80mL N，N-二甲基甲酰胺中，在冰水浴下搅拌分批加入1.05当量氢化钠，加完搅拌0.5小时；滴加1.1当量的碘丙烷，撤去冰水浴，反应12小时；加入饱和氯化铵溶液淬灭反应，加入乙酸乙酯萃取反应。合并有机相，用饱和氯化钠水溶液洗涤，在加入无水硫酸钠干燥有机相。减压蒸去溶剂和过量的碘丙烷，得到4.4g淡黄色油状液体。收率为89％。
17.4制备4,4-二甲基-6-硝基-1-丙基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮
在冰浴下将20mL硫酸加入到4.0g 4，4-二甲基-1-丙基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮烧瓶中，并剧烈搅拌0.5小时；用滴液漏斗缓慢滴加1.1当量的硝酸钾硫酸溶液，维持冰水浴温度并反应1-2小时；倾倒反应液倒冰水中搅拌0.5小时。过滤,并用大量的水洗涤滤饼。红外灯下干燥。用乙醇对粗品进行重结晶。得3.6g 4,4-二甲基-6-硝基-1-丙基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮，收率为77％
17.5制备6-氨基-4,4-二甲基-1-丙基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮
将4.0g 4,4-二甲基-6-硝基-1-丙基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮加入到50mL甲醇中，再加入300mg钯碳作为催化剂。反应体系用氢气置换三次。室温搅拌8小时。反应液通过加入硅藻土的玻璃砂漏斗，滤去固体。浓缩滤液得3.1g 6-氨基-4，4-二甲基-1-丙基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮。未进一步纯化直接进行下一步，收率为89％。
17.6制备0825A
将1.0g 6-氨基-4，4-二甲基-1-丙基-3,4-二氢-2(1H)-喹啉酮和1当量的2，3，5，6-四氟-4-甲基苄磺酰氯加入到DMF中，加入3当量碳酸钾为缚酸剂。使反应保持在室温搅拌16小时。反应结束加入冰水，乙酸乙酯萃取。无水硫酸钠干燥。浓缩有机相。粗品经硅胶柱层析纯化得1.9淡黄色化合物0825A，收率为78％。
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ10.07(s,1H),7.09-7.18(m,3H),4.58(s,2H),3.87(t,2H)，2.41(s,2H),2.23(s,3H),1.61(m,2H),1.20(s,6H),0.91(t，3H)ppm。
实施例18 AMX化合物(化合物0604c、化合物0918和化合物1127)体外实验的活性测试
18.1 体外生化实验和PP2C蛋白磷酸酶活性测试
体外生化实验表明，本发明的AMX化合物作为一系列广谱高效的PYL受体激动剂，与多个PYL受体具有高亲和性的结合能力，同时促进PYL受体结合并抑制PP2C蛋白磷酸酶活性。
以SnRK2.6磷酸化多肽为底物的HAB1蛋白磷酸酶活性实验表明，AMX可促进PYL2受体可与PP2C蛋白磷酸酶(HAB1)结合，从而抑制HAB1对于SnRK2.6磷酸化多肽的去磷酸化作用，且在相同浓度下其效果显著优于ABA。
其中化合物0604c和化合物0918的PYR/PYL受体结合能力广谱性实验表明，在1μM浓度下，其可与PYR1/PYL1/PYL2/PYL3/PYL4/PYL5/PYL7/PYL10结合，其中与PYR1/PYL1/PYL2/PYL7的结合能力显著高于ABA(图1)，上述结果表明，AMX是一种广谱高效的PYL受体激动剂。
18.2 AlphaScreen实验
用AlphaScreen技术检测AMX对于PYL受体和PP2C蛋白磷酸酶(HAB1)结合的促进能力。
实验结果表明，对于PYR1/PYL1/PYL2/PYL7，AMX显著优于ABA的PYL受体亲和性和结合能力(图2和图3)。在多个AMX化合物存在的条件下，上述四种PYL受体与HAB1均具有显著优于ABA和现有ABA类似物的亲和性，并且AMX的EC50值较ABA要小1-2个数量级，且四种PYL受体与HAB1的结合能力存在AMX的剂量依赖效应(图2和图3)。
此外，使用大豆GmPYL3(拟南芥PYL1的同源基因)和GmPYL6(拟南芥PYL2的同源基因)与拟南芥AtHAB1的实验表明，化合物0604c、化合物0918和化合物1127与大豆GmPYL蛋白同样具有显著高于ABA的亲和性(图9)。
上述结果表明，AMX化合物(如化合物0604c、化合物0918和化合物1127)是一系列比ABA等现有化合物更为高效的PYL受体激动剂。
实施例19 AMX化合物(化合物0720B和0825A)体外实验的活性测试
19.1 体外生化实验和PP2C蛋白磷酸酶活性测试
体外生化实验表明，本发明的化合物0720B和0825A作为高效的PYL受体激动剂，与多个PYL受体具有高亲和性的结合能力，同时促进PYL受体结合并抑制PP2C蛋白磷酸酶活性。
以SnRK2.6磷酸化多肽为底物的HAB1蛋白磷酸酶活性实验表明，化合物0720B和0825A均可促进PYL2受体可与PP2C蛋白磷酸酶(HAB1)结合，从而抑制HAB1对于SnRK2.6磷酸化多肽的去磷酸化作用，且在同浓度下的效果显著优于同浓度的ABA(表1)。
化合物0720B的PYR/PYL受体结合能力广谱性实验表明，在1μM浓度下，其与PYR1/PYL1/PYL2/PYL7的结合能力显著高于ABA(图13)，上述结果表明，化合物0720B是一种广谱高效的PYL受体激动剂。
19.2 AlphaScreen实验
用AlphaScreen技术检测化合物0720B对于PYL受体和PP2C蛋白磷酸酶(HAB1)结合的促进能力。
实验结果表明，对于拟南芥PYL2受体和PYR1受体，化合物0720B显著优于ABA的PYL受体亲和性和结合能力(图2)，且0720B的EC50值较ABA要小1-2个数量级(表1)，表明这两种PYL受体与HAB1的结合能力存在0720B的剂量依赖效应(图14)。
上述结果表明，AMX化合物(如化合物0720B和0825A)是比ABA等现有化合物更为高效的PYL受体激动剂。
实施例20 AMX化合物(0604c、1125A、1125B、0918、1127)的生理活性测试
20.1 对拟南芥种子萌发的抑制效果
结果如图6所示。播种6天后，1μM对照化合物AM1、化合物0604c、化合物0918、化合物1127和ABA同样能够抑制Col-0生态型种子的萌发，而无法抑制PYR/PYL三突变体pyr1；pyl1；pyl4种子的萌发。
结果表明，AMX化合物的萌发抑制效应是因为其激活了植物内在的ABA信号通路，而非对植物种子产生了毒性。其中两种AMX化合物(化合物0918和化合物1127)对Col-0生态型种子萌发的抑制效果显著优于对照化合物。
20.2 拟南芥叶面蒸腾作用
本实验中，利用红外摄像机观察记录叶面的温度变化，从而反映出植物的蒸腾作用强弱。
拟南芥叶面蒸腾实验结果如图7a所示。5μM对照化合物ABA、对照化合物AM1和多种AMX化合物喷施拟南芥两天后，叶面温度均高于DMSO对照组，意味着化合物处理的植物蒸腾作用减弱；喷施4天后，化合物0918和化合物1127处理过的植物叶面温度仍要高于对照组，其余化合物处理过的植物叶面温度则已降至DMSO对照组水平。浓度梯度实验则显示AMX化合物对于蒸腾作用的抑制存在剂量效应(图7b)，其效果与使用化合物的浓度以及化合物中卤素原子的数量均呈正相关。
对大豆进行的叶面蒸腾抑制实验表明，喷施50μM的化合物1127的植株，每株的用量是0.2μmol，三天后其叶面温度仍显著高于喷施DMSO的对照组。结果表明，此时大豆叶面的蒸腾效应仍受到抑制，而喷施相同浓度ABA的植株叶面温度已与对照组无异(图10)。这表明化合物1127在大豆中也存在与拟南芥同样的抑制叶面蒸腾作用的效果。
20.3 拟南芥的抗旱性
为了进一步探索AMX对于植株抗旱性的影响，在土壤中生长两周的拟南芥Col-0生态型停止给水，干旱期间每周向叶面喷洒一次含相应浓度的(+)-ABA/AM1/AMX或0.05％DMSO(对照)的溶液，共喷施两次，溶液中同时添加了0.02％(v/v)的表面活性剂Tween-20以增强喷剂对于叶片表皮的穿透作用。经过17天的干旱处理后，喷施DMSO的对照组和喷施10μM ABA和AM1的植物均已旱死，而喷施10μM 0604c的植物仍能存活(图8a)；浓度降至5μM后，喷施化合物0918、化合物1125b和化合物1127的植株在干旱18天后仍然存活，而喷施DMSO的对照组ABA的植株均已旱死，其中喷施化合物1127的植株在干旱20天后仍然保持良好的长势(图8b)。
利用结构相似的化合物(如化合物0604c、化合物0918和化合物1127)进行的实验表明，植物的抗旱性强弱与喷施化合物的卤素原子个数呈正相关，干旱2周后，卤素原子多的化合物(如化合物0918和化合物1127)处理后的植物较相同浓度下卤素原子少的化合物(如化合物0604c)处理后的植物有更强的抗旱性(图8c)。
20.4 大豆和玉米的抗旱性
大豆在3组3叶期，玉米在小喇叭口期开始干旱，选取相同大小的植株进行土壤干旱实验，期间每隔两天喷施一次含50μM的各测试化合物AMX或各对照化合物的水溶液，溶液中同样添加了0.05％(v/v)的表面活性剂Tween-20。经过一周的干旱处理后复水，喷施50μM的化合物0918和化合物1127的大豆在复水一月后长势明显优于喷施DMSO的对照组和喷施50μM ABA的株系，其中喷施化合物0918与喷施ABA的株系存活率相当，而喷施化合物1127的株系存活率要高于上述两者(图11)。喷施化合物0918的玉米在复水后大部分存活，而喷施DMSO的对照组玉米在复水后亦无法复原(图11)。
上述结果表明，本发明的化合物可以显著提高单子叶(玉米)和双子叶(大豆)农作物的抗旱性。
本发明所述化合物活性(通过促进PYR/PYL受体与HAB1蛋白磷酸酶的结合从而抑制后者磷酸酶活的能力)的具体数据见表1。
实施例21 AMX化合物(化合物0720B)的抗旱活性测试
21.1 对大豆和棉花叶面蒸腾作用的抑制
本实验中，利用红外摄像机观察记录叶面的温度变化，从而反映出植物的蒸腾作用强弱。
大豆和棉花的叶面蒸腾实验结果如图15和图16所示，对大豆进行的叶面蒸腾抑制实验表明，分别喷施10/20/50μM 0720B化合物的植株，在喷施一天后其叶面温度均显著高于喷施DMSO的对照组和喷施50μM ABA的植株，这意味着化合物处理的植物的蒸腾作用要弱于后者。其中喷施20或50μM 0720B化合物的植株其叶面温度在喷施两天后仍显著高于喷施DMSO的对照组，表明此时大豆叶面的蒸腾效应仍受到抑制，而此时喷施50μM ABA的植株叶面温度已与对照组无异(图15)。对棉花进行的叶面蒸腾抑制实验则表明，喷施50μM0720B化合物的植株，两天后其叶面温度仍显著高于喷施DMSO的对照组，而喷施50μM ABA的植株叶面温度此时已与对照组无异(图16)。
上述结果表明，0720B化合物对于大豆和棉花叶面蒸腾作用的抑制效果均显著优于ABA。
21.2 对大豆和棉花抗旱性的增强
分别播种16天的大豆和23天的棉花，选取相同大小的植株进行土壤干旱实验。大豆在开始干旱后每3天喷施含10/20/50μM的0720B或50μM的ABA水溶液，棉花则在开始干旱后每4天喷施一次含50μM的ABA/0720B化合物的水溶液，大豆和棉花干旱实验均使用含0.05％DMSO的水溶液作为对照组，上述溶液中均添加了0.1％(v/v)的表面活性剂Tween-20以增强喷剂对于叶片表皮的穿透作用。大豆在干旱11天后复水，喷施10/20/50μM 0720B化合物的大豆复水后长势均明显优于喷施DMSO的对照组以及喷施50μM ABA的植株(图17)。喷施50μM 0720B化合物的棉花在干旱10天后长势同样明显优于喷施DMSO的对照组以及喷施50μM ABA的植株(图18)。
本发明所述化合物活性(通过促进PYR/PYL受体与HAB1蛋白磷酸酶的结合从而抑制后者磷酸酶活的能力)的具体数据见表1。
表1式I化合物的代表化合物的活性列表
从表1可以看出，本发明的式I化合物的活性显著高于对照化合物(1、2)，并且，卤素原子的数量与化合物的活性成正比。
实施例22 PYL2-AMX-HAB1复合物的结构
采用通用方法中所述的蛋白晶体解析方法，检测了多个本发明AMX化合物所形成的PYL2-AMX-HAB1复合物晶体结构。对照为ABA和现有的ABA类似物，各复合物的二维结构局部示意图如图4所示。
从图4看出，AMX存在于PYL2的口袋结构中，ABA结构上的四个氧原子可通过多个水分子与PYL2口袋结构以及HAB1的多个氨基酸残基形成氢键(图4a)，AMX化合物磺酰氨基团上的氧原子和氮原子以及喹啉环上的氧原子同样可以形成氢键。此外，对二甲苯上的卤素取代基可通过空间位阻效应帮助磺酰氨基团上的氧原子和氮原子与更邻近的氨基酸残基形成氢键，或直接与PYL2口袋结构形成氢键，如化合物0918(图4d)、化合物1127(图4e)、化合物1020A(图4f)、化合物1020B(图4g)、和化合物1125A(图4h)上的氟原子。
值得注意的是，在对位存在甲基或卤素原子(如氯原子)的情况下，邻位的氟原子多形成氢键，间位的卤素原子则多利用空间位阻效应帮助磺酰氨基团上的氧原子和氮原子与更临近的氨基酸残基形成氢键；而当对位存在卤素代甲基的情况下，间位的氟原子也可形成氢键，如化合物1020A(图4f)。
此外，通过比较三组结构相似的化合物(化合物0604c(图4c)/化合物0918(图4d)/化合物1127(图4e)，化合物1020A(图4f)/化合物1020B(图4g)以及化合物1125A(图4h)/化合物1125B(图4i))，可以发现卤素原子的数量与氢键的数量也呈正相关性。与对照化合物相比，化合物AMX与PYL2口袋结构之间形成的氢键数量更多或结合更强，因此，AMX表现出更强的PYL受体亲和性。
实施例23 AMX可诱导ABA响应的胁迫相关基因的表达
本发明人分析了外源添加AMX对于植物基因表达的影响。
基因表达分析的结果表明，AMX可诱导ABA响应的胁迫相关基因的表达，且表达水平大多可以达到或高于相同浓度外源ABA所诱导的表达水平(图5)。10μM的化合物AMX处理后，10天大的野生型拟南芥(Col-0)苗期植株中，7个已知的受ABA诱导的与环境胁迫相关基因的表达量显著增加，其中用化合物0604c和化合物0717处理6小时后，多数基因的表达水平显著超过10μM ABA处理相同时间后的水平，而10μM AM1处理6小时后，上述基因的表达水平则低于10μM ABA处理相同时间后的水平。此外，化合物0604c和化合物0918处理一天后，相关基因的表达水平亦显著超过10μM ABA处理相同时间后的水平(图5)。
综上，结果表明，AMX对于多数环境胁迫相关基因的诱导效果要显著优于ABA和AM1。
实施例24 植物保鲜(鲜花保鲜)
结果表明，AMX化合物1127的水悬浮剂可显著延缓花苞凋谢和叶片枯萎的情况。自来水对照组放置20天后花朵全部凋谢，叶片全部枯萎，而AMX化合物1127的水悬浮剂处理组尚有60％花朵正常开放，没有叶片枯萎且有70％叶片保持绿色。
实施例25 葡萄着色
实验结果如图12所示。
结果表明，AMX化合物1127的水悬浮剂处理后的葡萄果皮花色苷含量显著高于清水对照组，因此，花色苷的含量与葡萄果皮上色成正相关。
实施例26 毒性实验
细菌回复突变实验的结果显示，AMX化合物1127在各剂量下对TA98和TA100菌株均未发现明显的细菌毒性。
体外微核实验的结果显示，AMX化合物1127在-S9条件下不具有诱导CHL细胞微核率升高的作用。
SD大鼠单次经口灌胃受试物最大耐受量实验结果显示，给药量为5000mg/kg组的雌雄大鼠在临床观察、体重和各组织/脏器的肉眼形态学观察方面均未见药物相关性改变，AMX化合物1127的最大耐受量(MTD)大于5000mg/kg。
这表明，本发明的AMX化合物具有很高的安全性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (16)

1.一种式I化合物、或其盐、或其光学异构体、或其外消旋体，
式中，
R1为卤素、C1-C3烷基、或C1-C3卤代烷基；
R2为卤素、C1-C3烷基、或C1-C3卤代烷基；
R3为卤素、C1-C3烷基、或C1-C3卤代烷基；
R4为卤素、C1-C3烷基、或C1-C3卤代烷基；
R5为卤素、C1-C3烷基或C1-C3卤代烷基；
R6为H或C1-C3烷基；
R7为C1-C7烷基、C2-C7链烯基、C2-C7链炔基；
R0为H、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、或卤素；
m为1或2；
表示单键或双键；
附加条件是，R1、R2、R3、R4中有3或4个为卤素。
2.如权利要求1所述的式I化合物、或其盐、或其光学异构体、或其外消旋体，其特征在于，所述的化合物具有式Ia、Ib或Ic结构：
式中，R0，R1-R6，m的定义如权利要求1中所述。
3.如权利要求1或2所述的式I化合物、或其盐、或其光学异构体、或其外消旋体，其特征在于，R1、R2、R3、R4中有4个为卤素。
4.如权利要求1所述的式I化合物、或其盐、或其光学异构体、或其外消旋体，其特征在于，R5为甲基、Cl或三氟甲基。
5.如权利要求1所述的式I化合物、或其盐、或其光学异构体、或其外消旋体，其特征在于，R7为C3烷基、或C3链烯基。
6.如权利要求1所述的式I化合物、或其盐、或其光学异构体、或其外消旋体，其特征在于，R0为H、或甲基。
7.如权利要求1所述的式I化合物、或其盐、或其光学异构体、或其外消旋体，其特征在于，所述的化合物选自下组：
8.一种权利要求1所述的式I化合物、或其盐、或其光学异构体、或其外消旋体的用途，其特征在于，用于制备农用制剂或组合物，所述农用制剂或组合物用于(i)增强植物抗逆性；(ii)植物保鲜处理；和/或(iii)果实着色处理。
9.一种农用制剂，其特征在于，所述农用制剂包括：
(i)权利要求1所述的式I化合物、或其盐、或其光学异构体、或其外消旋体；和
(ii)农业上可接受的载体。
10.一种增强植物抗逆性的方法，其特征在于，给所述植物施用权利要求1所述的式I化合物、或其盐、或其光学异构体、或其外消旋体或施用权利要求9所述的农用制剂。
11.一种式I化合物或其盐的制法，其特征在于，包括步骤：
(a)在惰性溶剂中，将式Ia-6化合物与式Ia-4化合物进行反应，从而形成式I化合物；
上述各式中，R0、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、m和如权利要求1中所定义。
12.一种植物保鲜处理方法，其特征在于，包括步骤：
将待保鲜的植物与权利要求1所述的式I化合物、或其盐、或其光学异构体、或其外消旋体进行接触，从而对植物保鲜。
13.一种果实着色处理方法，其特征在于，包括步骤：
将待着色的果实与权利要求1所述的式I化合物、或其盐、或其光学异构体、或其外消旋体进行接触，从而对果实着色。
14.一种权利要求1所述的式I化合物、或其盐、或其光学异构体、或其外消旋体的用途，其特征在于，用于制备(i)ABA受体的激动剂；和/或(ii)种子萌发抑制剂。
15.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述植物保鲜包括鲜花保鲜。
16.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述果实着色包括葡萄着色。
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