CN106478458B - 基于四苯基乙烯和马来腈的希夫碱化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于四苯基乙烯和马来腈的希夫碱化合物及其制备方法和应用，相对于常见的马来腈类Salen型荧光探针结构，此类探针结构具有优异的红色荧光行为和出色的固态(聚集态)效率，并实现对细胞内特定结构的选择性识别与成像，并对阴、阳离子和pH值具有较好的响应能力，使其在生物、医疗、健康和监测领域，具有极其广阔的应用前景。

Description

基于四苯基乙烯和马来腈的希夫碱化合物及其制备方法和 应用

技术领域

本发明涉及分析和检测技术领域，更具体地说，涉及一种基于四苯基乙烯和马来腈的希夫碱化合物及其制备方法和应用。

背景技术

随着国家经济的快速发展和人民生活水平的不断提高，个人身体健康的实时监测、疾病的预防和治疗逐渐成为人们更加关注的民生问题。相对于传统的体外化学检验的延迟性和放射线在线检测的危害性，荧光在线显像技术以其高效、绿色、实时性强的优势渐渐走入人们的视野，被广泛应用于细胞免疫学、微生物学、分子生物学、遗传学、神经生物学、病理学、肿瘤学、临床检验学、医学、植物学等方面的科研和民生等领域。

荧光显像技术的关键技术就是荧光物质作为标记探针(或染色剂)的选择。理想的探针分子通过物理或化学作用，特异性吸附在特定的细胞和组织上，在低能量光学辐照下实现二维或三维的成像，通过与荧光颜色、强度和分布情况来判断细胞或组织的健康情况。与普通的化学染色相比，荧光染色的灵敏度要高出100-1000倍，而且通过适当的功能修饰即可实现对活体的在线分析。但是，由于大部分荧光探针的荧光发射峰位位于深蓝光、天蓝光、绿光、黄光和橙光范围内(430-590nm)，而这部分光谱与哺乳动物体内血红蛋白的吸收波段相重合；而采用常规能量过高的紫外光，如UV-light(290-400nm)，对活体的细胞和组织损伤过大，难于长期用于日常生理检查；采用人体无损的红外光线(＞800nm)探伤，这部分恰好容易被体内的水和脂质所吸收，都很难达到理想的分辨率。所以，留给人们可以应用于活体在线荧光检测的荧光探针范围只集中在活体吸收能力较差的590-800nm的红光范围内，但是由于大于600nm的光会有部分散射消耗，常规的CCD检测器对此波段不敏感，所以，制备“高效率”的“红光”探针染料是能否将荧光现象技术推向常规化、低成本的“无损”活体成像与诊断的关键。

目前的荧光探针(染料)是以人工合成的芳香环类化合物为主，较大的π电子离域范围可以实现探针分子对光辐射能量的高效吸收，进而通过弛豫、辐射跃迁得到长波长荧光，这个吸收光和发射光间的能量差值被称作斯托克斯位移。斯托克斯位移越小，说明它的吸收光和发射光的能量越接近，非辐射跃迁的比例较小，材料的量子产率可能较高，但化合物通常表现为严重的自吸收现象，干扰成像效果；当斯托克斯位移大时，分子的自吸收现象明显削弱，但是非辐射跃迁比例变大，所得的探针材料往往对光的利用率不高。另外，大部分荧光生色团的芳香环结构多为疏水基元，虽然可通过引入亲水的极性基团使其具有较好的水溶性，但事实上荧光分子在生物介质中仍然是以聚集形式存在的(如胶束、纳米粒子等形式)。由于大部分有机化合物从溶液单分子态到上述的凝聚态时，都会出现典型的荧光猝灭现象(ACQ)，导致荧光探针染料表现为在脂溶性介质中为高效率的荧光发射，而在生理缓冲溶液(或体内的水介质体系)很难区分探针分子和背景发光，给目标生物大分子上的定位带来很大难度。2001年，唐本忠院士基于其发现的1-甲基-1，2，3，4，5-五苯基噻咯(MPPS)在乙腈溶液中不发光，而在聚集后而产生强烈的荧光的“反常”现象，提出“聚集诱导发光(AIE)”的新观念，通过“分子内旋转受限(RIR)”的工作机理是很好的解释了这种现象产生的，而且已得到诸多实验结果和理论计算的支持，发展了一个贴有“中国牌”的、具有自主知识产权的材料和理论体系。AIE类材料解决了传统的芳香环荧光生色团在水溶性溶剂中聚集猝灭荧光问题，在生理缓冲溶液或水介质中能够实现高亮度的荧光成像和示踪，与背景中的不发光或弱发光单分子实现高分辨率的区分，很好的定位在目标生物大分子。这种AIE荧光探针的“点亮(light-up)”模式为高灵敏度、对比度的生物研究提供了可能，在生物学、医学等领域具有划时代的意义。

基于二氨基马来腈的Salen型希夫碱衍生物结构为常见的金属络合物配体，通过多齿螯合效应可以得到稳定的金属配合物，其在烯烃聚合等领域具有广泛的应用。由于邻位双氰基结构具有显著的吸电子作用，加之希夫碱构成的共轭体系，使此类Salen结构具有相对较长的荧光发射行为，通过取代基结构的调节，能够在良溶剂体系下实现单分子黄色、橙色和红色的荧光。基于此，近些年来马来腈类Salen结构在荧光探针领域的应用也逐步受到关注，特别是在金属传感和深红光材料的制备方面。但是，由于分子内受体结构(邻位双氰基)的吸电子能力过强，导致分子内电荷转移发光过程在整个辐射跃迁中占有比例过大，材料的荧光效率整体不高，加之受到ACQ效应的影响，使其固体或水系环境下几乎观测不到荧光，很难满足生物体系中基本检测条件的要求。因此，如何实现马来腈类Salen结构的“红光”与“效率”间平衡，依然是该领域的一个挑战。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于四苯基乙烯和马来腈的希夫碱化合物及其制备方法和应用，解决了现有技术中的基于四苯基乙烯和马来腈的希夫碱化合物的荧光效率低而无法实现作为红色荧光探针应用的问题。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：一种基于四苯基乙烯和马来腈的希夫碱化合物，所述希夫碱化合物结构式如下：

其中，Ar表示芳香基团或其衍生结构，R₁、R₂和R₃分别表示连接在四苯乙烯基苯环结构上的任意取代位置的取代基结构，且R₁、R₂和R₃分别选自氢、烷基、羟基、烷氧基、硝基、氰基、氨基、巯基、卤素原子、苯基、甲苯基、萘基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、吡喃基、喹啉基、吲哚基、羧酸或羧酸衍生物、咔唑基或苯胺基及相应的衍生结构中的一种。优选地，烷基和烷氧基的碳原子数分别为1～12。

在本发明的希夫碱化合物中，Ar为四苯乙烯基或其衍生物结构，其结构式如下：

其中，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅和R₆分别位于四苯乙烯基中心烯烃的烯键的邻位、间位或对位，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅和R₆分别选自氢、烷基、羟基、烷氧基、硝基、氰基、氨基、巯基、卤素原子、苯基、甲苯基、萘基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、吡喃基、喹啉基、吲哚基、羧酸或羧酸衍生物、咔唑基或苯胺基及相应的衍生结构中的一种。优选地，烷基和烷氧基的碳原子数分别为1～12。需要说明的是，Ar为四苯乙烯基或其衍生物结构时，可以使本发明的希夫碱化合物构成双边对称结构，即R₄＝R₁，R₅＝R₂，R₆＝R₃；也可以构成非对称结构，即R₄≠R₁，R₅≠R₂，R₆≠R₃，当构成非对称结构时，优选的结构如下：

优选地，在本发明的希夫碱化合物中，R₄＝R₁，R₅＝R₂，R₆＝R₃，其结构式具体如下：

其中，R₁、R₂和R₃分别位于四苯乙烯基中心烯烃的烯键的邻位、间位或对位，R₁、R₂和R₃分别选自氢、烷基、羟基、烷氧基、硝基、氰基、氨基、巯基、卤素原子、苯基、甲苯基、萘基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、吡喃基、喹啉基、吲哚基、羧酸或羧酸衍生物、咔唑基或苯胺基及相应的衍生结构中的一种。优选地，烷基和烷氧基的碳原子数分别为1～12。其中，R₁、R₂和R₃可以不全为氢时，其优选的结构如下：

其中，A₁-A₈分别为氢、烷基、羟基、烷氧基、硝基、氰基、氨基、巯基、卤素原子、苯基、甲苯基、萘基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、吡喃基、喹啉基、吲哚基、羧酸或羧酸衍生物、咔唑基或苯胺基及相应的衍生结构中的一种，进一步地，其中烷基和烷氧基的碳原子数分别优选为1～12。

进一步优选地，在本发明的希夫碱化合物中，R₁、R₂和R₃分别为氢，其结构式具体如下：

在本发明的希夫碱化合物中，Ar为苯环或苯环衍生物，R₁、R₂和R₃分别位于四苯乙烯基中心烯烃的烯键的邻位、间位或对位，其结构式具体如下：

其中，B₁、B₂、B₃和B₄分别选自氢、烷基、羟基、烷氧基、硝基、氰基、氨基、巯基、卤素原子、苯基、甲苯基、萘基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、吡喃基、喹啉基、吲哚基、羧酸或羧酸衍生物、咔唑基或苯胺基中的一种或相应衍生物，进一步优选地，其中烷基和烷氧基的碳原子数分别优选为1～12。其优选地结构如下：

在本发明的希夫碱化合物中，Ar为萘环、蒽环、菲环或三者衍生物，R₁、R₂和R₃分别位于四苯乙烯基中心烯烃的烯键的邻位、间位或对位，其结构式具体如下：

其中，C₁-C₈分别选自氢、烷基、羟基、烷氧基、硝基、氰基、氨基、巯基、卤素原子、苯基、甲苯基、萘基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡啶基、吡喃基、喹啉基、吲哚基、羧酸或羧酸衍生物、咔唑基或苯胺基中的一种或相应衍生物，进一步优选地，其中烷基和烷氧基的碳原子数分别优选为1～12。

在本发明的希夫碱化合物中，Ar为呋喃、噻吩、吡咯、吡啶、吡喃、喹啉(含异喹啉)、吲哚、咔唑、苯胺基或其衍生物，其优选地结构如下：

需要说明的是，上述所有结构式中，其中R₁-R₆、A₁-A₈、B₁-B₄和C₁-C₈优选结构可以选自下图中所示29种中的一种或氢原子：

在本发明中，上述的基于四苯基乙烯和马来腈的希夫碱化合物的制备方法如下：

S1、通过各种耦联、取代和缩合反应得到四苯乙烯基水杨醛衍生物结构：

该S1步骤制备四苯乙烯基水杨醛衍生物为现有技术，这里不再进行详细赘述；

S2、将四苯乙烯基水杨醛与二氨基马来腈在第一反应溶剂中加热至20℃～150℃，反应1小时～24小时后冷却至室温，处理掉大部分溶剂后析出黄色晶体或粉末，进行重结晶后得到氨基中间体，产率＞80％，纯度＞85％；其中重结晶溶剂，优选四氢呋喃、乙醇、甲苯、DMF等，最优选乙醇；

S3、将氨基中间体与对应的芳基水杨醛结构在第二反应溶剂中加热至20℃～150℃，反应1小时～24小时后冷却至室温，处理掉大部分溶剂后析出黄色或红色晶体或粉末，通过柱层析或重结晶后得到希夫碱化合物；其中重结晶溶剂优选四氢呋喃、乙醇、甲苯、DMF等，最优选乙醇；

需要说明的是，当化合物为对称结构时，即均为同种四苯乙烯基衍生物结构，可通过调节步骤S2中反应底物的摩尔分数比来实现。

在本发明的希夫碱化合物的制备方法中，在步骤S2中，第一反应溶剂优选选自甲醇、乙醇、乙酸、四氢呋喃、甲苯、苯、氯仿、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺或N-甲基吡咯烷酮、或其二者、三者的混合体系溶剂，最优选乙醇及其与其他溶剂的混合体系；

在步骤S2中，加热至温度优选为45℃～90℃；反应时间优选为6小时～12小时；

在步骤S3中，第二反应溶剂优选选自甲醇、乙醇、乙酸、四氢呋喃、甲苯、苯、氯仿、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺或N-甲基吡咯烷酮、或其二者、三者的混合体系溶剂，最优选乙醇及其与其他溶剂的混合体系；

在步骤S3中，加热至温度优选为30℃～90℃；反应时间优先为6小时～12小时。

上述的基于四苯基乙烯和马来腈的希夫碱化合物可以作为红色荧光探针的应用，即可以用于制备红色荧光探针(即红色荧光染色剂)。

实施本发明的基于四苯基乙烯和马来腈的希夫碱化合物及其制备方法和应用，具有以下有益效果：本发明提出一类新型的、基于四苯基乙烯和马来腈结构的、Salen型希夫碱荧光探针类材料。通过引入四苯基乙烯基元，有效的遏制化合物在固态下效率的损失，实现其在胶束、纳米粒子等形式下高的荧光量子产率；在链接方式上，采用取代基团(水杨醛结构)与希夫碱结构(-C＝N-)处在间位链接的位置，能够有效地遏制由于过强的共轭效应导致的强的分子内电荷诱导行为，有效地降低分子内跃迁偶极，进而限制电荷转移过程在整个辐射跃迁中的比例，改善化合物的激发态结构；三苯基乙烯结构与水杨醛结构中的酚羟基处在对位，能够有效地通过电子效应调节酚氧负离子的电荷密度，从而实现对探针分子内激发态质子转移(ESIPT)行为和金属配合能力的调节；对称或非对称的双水杨醛结构所构筑的双重ESIPT态，能够有效地拓展荧光光谱的向长波长方向移动；这种类多齿的螯合结构也更有利于对阴、阳离子的选择性识别。相对于常见的马来腈类Salen型荧光探针结构，此类探针结构具有优异的红色荧光行为和出色的固态(聚集态)效率，并实现对细胞内特定结构的选择性识别与成像，并对阴、阳离子和pH值具有较好的响应能力，使其在生物、医疗、健康和监测领域，具有极其广阔的应用前景。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1为TPE-DMNS在不同极性下的荧光光谱；

图2A为TPE-DMNS在不同水含量下的荧光光谱；

图2B为TPE-DMNS在不同水含量下的荧光强度变化曲线；

图3A为TPE-DMNS在不同pH值下的荧光光谱；

图3B为TPE-DMNS在不同pH下的荧光强度变化曲线；

图4A为TPE-DMNS在不同金属离子溶液中的荧光光谱；

图4B为TPE-DMNS对不同金属离子及干扰离子实验；

图5A为TPE-DMNS在不同阴离子溶液中的荧光光谱；

图5B为TPE-DMNS对不同阴离子及干扰离子实验；

图6为TPE-DMNS在不同浓度下对细胞荧光染色实验；

图7为TPE-DMNS双光子成像实验。

具体实施方式

为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现对照附图详细说明本发明的具体实施方式。

下面结合附图和实施例，对本发明的基于四苯基乙烯和马来腈的希夫碱化合物及其制备方法和应用作进一步说明：

本发明提出基于四苯基乙烯和马来腈结构的、Salen型希夫碱化合物作为新型的荧光探针类材料，其结构式如下：

Ar可以和四苯乙烯基或其衍生物结构相同，构成双边对称结构；也可以不相同，构成非对称结构。该类化合物通过四苯乙烯基水杨醛衍生结构与二氨基马来腈缩合后，再进一步与水杨醛衍生物发生缩合，得到一类新型的Salen型希夫碱探针结构。四苯乙烯结构的引入，使探针赋予了显著聚集诱导发光性质；通过希夫碱共轭体系与氰基形成CT态结构，导致荧光光谱移向红光区域；希夫碱中邻位羟基与N原子上的孤对电子形成分子内氢键，利用激发态下的分子内质子转移(ESIPT)过程，实现固态荧光光谱的进一步红移；这些都将有利于其在聚集态下实现高效率的红色荧光。同时，该类红色探针能够对金属离子、阴离子、pH值变化做出特异性响应，并且被细胞吞噬，实现对细胞内的特定结构选择性荧光染色，进一步拓展了其在双光子成像和活体检测中的应用价值。

制备方法如下：

(1)

通过各种耦联、取代和缩合等反应得到四苯乙烯基水杨醛衍生物结构。该第一步反应为现有技术，这里不再进行详细描述。

(2)

将上述四苯乙烯基水杨醛衍生物采用适当的溶剂和温度制备重要的中间体产物-氨基中间体。

具体操作：将适量的四苯乙烯基水杨醛与二氨基马来腈在适量溶剂中加热至适当温度，反应一段时间后冷却至室温，处理掉大部分溶剂后析出黄色晶体或粉末，重结晶后即得到氨基中间体，产率＞80％，纯度＞85％。其中，反应溶剂优选甲醇、乙醇、乙酸、四氢呋喃、甲苯、苯、氯仿、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，N，N-二甲基乙酰胺(DMAC)和N-甲基吡咯烷酮(NMP)等或二者、三者的混合体系，最优选乙醇及其与其他溶剂的混合体系；温度优选20℃至150℃，其中最优选为45℃至90℃；反应时间优选1小时至24小时，其中最优选6小时至12小时；重结晶溶剂，优选四氢呋喃、乙醇、甲苯、DMF等，最优选乙醇。

(3)

将上述氨基中间体与对应的芳基水杨醛结构反应制备目标化合物。

具体操作：将适量的氨基中间体与对应的芳基水杨醛结构在适量溶剂中加热至适当温度，反应一段时间后冷却至室温，处理掉大部分溶剂后析出黄色或红色晶体或粉末，柱层析或重结晶后即得到目标产物。其中，反应溶剂优选甲醇、乙醇、乙酸、四氢呋喃、甲苯、苯、氯仿、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，N，N-二甲基乙酰胺(DMAC)和N-甲基吡咯烷酮(NMP)等或二者、三者的混合体系，最优选乙醇及其与其他溶剂的混合体系；温度优选20℃至150℃，其中最优选为30℃至90℃；反应时间优选1小时至24小时，其中最优选6小时至12小时；重结晶溶剂，优选四氢呋喃、乙醇、甲苯、DMF等，最优选乙醇。

当化合物为对称结构时，即均为同种四苯乙烯基衍生物结构，可通过调节(2)中反应底物的摩尔分数比来实现。

实施例1：双四苯基乙烯马来腈合成(TPE-DMNS)

将1g四苯乙烯基水杨醛与适量二氨基马来腈水合肼在25ml下回流4h(加入乙酸作为催化剂)，冷却后减压除去乙醇后萃取，有机相干燥后采用柱分离，得到淡黄绿色固体0.8g，即为TPE-DMNS结构。MALDI-TOF(m/z)：[M+]calcd.C₅₈H₄₀N₄O₂，824.3151；found，824.4532.Anal Calc.for C₂₀H₁₄N₂O：C，84.44；H，4.89；N，6.79；O，3.88.Found：C，84.64；H，4.84；N，6.74；O，3.86.

实施例2：TPE-DMNS的ESIPT(分子内质子转移)性质研究

如图1所示为TPE-DMNS在不同极性下的荧光光谱，随着极性的变化，TPE-DMNS的醇式发射(432nm附近)和酮式发射(615nm附近)的比例发生明显变化，为典型的ESIPT发射。

实施例3：TPE-DMNS的聚集诱导发光性质(AIE)性质研究

对于ESIPT分子，聚集态多为酮式发射，所以检测了该处的聚集发光现象。如图2A和2B所示，向TPE-DMNS的四氢呋喃溶剂中(溶解单分子态)不断加入一定比例的水，TPE-DMNS由于溶解度问题慢慢聚集成纳米颗粒，醇式荧光强度逐渐下降，酮式强度增加，二者比例随着含水量的增加而上升，说明TPE-DMNS具有AIE性质。相对于其他类型的马来腈的Salen型希夫碱结构，TPE-DMNS展现了ESIPT和AIE性质，具有荧光探针的潜质。

实施例4：TPE-DMNS的pH稳定性及性质研究

如图3A和3B所示为TPE-DMNS在不同缓冲溶液下的荧光光谱，通过对比发现，该荧光探针在pH值为1-11的体系下保持了较好的荧光行为，当pH为12或13时，由于TPE-DMNS中的邻位羟基与碱性环境发生了中和行为而生成了对应盐，分子由聚集态变为的单分子态，从而失去了高效率的红色荧光的行为。

实施例5：TPE-DMNS的对金属离子的响应性研究

如图4A和4B所示为TPE-DMNS在乙腈溶液中对不同金属离子的选择实验结果，通过对比发现，该荧光探针对铜离子存在特异性响应，其在435nm附近的荧光强度明显升高，而在615nm处的响应明显降低；通过干扰实验结果，可以看出，其他离子存在时对铜离子的检测没有影响。

实施例6：TPE-DMNS的对金属离子的响应性研究

如图5A和5B所示为TPE-DMNS在乙腈溶液中对不同阴离子的选择实验结果，通过对比发现，该荧光探针对硫酸根离子存在特异性性响应，其在600nm附近的响应随着硫酸根的加入明显降低；通过干扰实验结果，可以看出，醋酸根能够实现对已经淬灭荧光的恢复，其在生物阴离子检测方面存在应用价值。

实施例7：TPE-DMNS的对细胞的选择性染色

将TPE-DMNS以一定浓度溶液DMSO溶液后滴入细胞培养液中，选择Hela细胞作为研究对象，培养一段时间后采用荧光显微镜对其极性观察，如图6所示，发现TPE-DMNS可以顺利的透过细胞壁，并定向的在细胞质处富集，从而显示出深红色荧光(610nm附近)。通过浓度实验比较发现，提高探针浓度可以明显提高亮度和成像效果，这与目前商用的ACQ型探针结构形成鲜明对比，说明该类材料可能提供更高的分辨能力。(激发光源405nm，荧光收集范围560-660nm)。

实施例8：TPE-DMNS的对细胞的选择性染色的双光子成像

将上述较好的实验对象尝试采用采用更长的红外光源激发，拓展其在双光子成像领域的应用。如图7所示，实验结果显示，TPE-DMNS在980nm光源的激发下可以实现对细胞质的成像，暗示其在活体成像中的应用价值。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进或变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种基于四苯基乙烯和马来腈的希夫碱化合物，其特征在于，所述希夫碱化合物结构式如下：

2.一种权利要求1所述的基于四苯基乙烯和马来腈的希夫碱化合物的制备方法，其特征在于，

S1、通过各种耦联、取代和缩合反应得到四苯乙烯基水杨醛衍生物结构：

S2、将四苯乙烯基水杨醛与二氨基马来腈在第一反应溶剂中加热至20℃～150℃，反应1小时～24小时后冷却至室温，处理掉大部分溶剂后析出黄色晶体或粉末，进行重结晶后得到氨基中间体；

S3、将氨基中间体与对应的芳基水杨醛结构在第二反应溶剂中加热至20℃～150℃，反应1小时～24小时后冷却至室温，处理掉大部分溶剂后析出黄色或红色晶体或粉末，通过柱层析或重结晶后得到希夫碱化合物

其中，Ar为四苯乙烯基；R₁、R₂和R₃分别为氢。

3.根据权利要求2所述的希夫碱化合物的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，第一反应溶剂选自甲醇、乙醇、乙酸、四氢呋喃、甲苯、苯、氯仿、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺或N-甲基吡咯烷酮、或其二者、三者的混合体系溶剂；

在步骤S2中，加热至温度为45℃～90℃；反应时间为6小时～12小时；

在步骤S3中，第二反应溶剂选自甲醇、乙醇、乙酸、四氢呋喃、甲苯、苯、氯仿、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺或N-甲基吡咯烷酮、或其二者、三者的混合体系溶剂；

在步骤S3中，加热至温度为30℃～90℃；反应时间为6小时～12小时。

4.一种权利要求1所述的基于四苯基乙烯和马来腈的希夫碱化合物作为红色荧光探针的应用。