CN106456758A - 用于预防或治疗慢性肺同种异体移植机能障碍和特发性肺纤维化的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
所述发明提供了用于在肺移植后减少肺同种异体移植机能障碍的组合物和方法,以及用于治疗特征在于对象的组织中异常的成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积的重度肺纤维化的组合物和方法。所述方法包括向有需要的对象施用包括抗体组分和MK2抑制剂组分的组合物,所述抗体组分包括治疗量的抗CD44抗体;并且所述MK2抑制剂组分包括治疗量的氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的MK2抑制剂(MK2i)多肽,或在功能上等价于其治疗结构域的选自氨基酸序列KALARQLAVA(SEQ ID NO:8)的多肽、氨基酸序列KALARQLGVA(SEQ ID NO:9)的多肽和氨基酸序列KALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的多肽的至少一个肽,或其功能等价物,和药学上可接受的载体。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求美国临时申请61/953,438(2014年3月14日提交)的优先权的权益,其内容通过引用以其整体并入。
政府资助的声明
所述发明利用来自给予Moerae Matrix,LLC的小企业创新研究(Small BusinessInnovation Research)(SBIR)和来自授予Noble博士的NHLBI PO1的政府支持完成。政府在本发明中具有某些权利。
发明领域
本发明在细胞和分子生物学、多肽、和治疗使用方法的领域中。
背景技术
1.创伤愈合和纤维化的机制
术语“创伤愈合”指的是身体将任何其组织的创伤,尤其是由物理手段造成并且具有连续性中断的那些,修复的过程。
创伤愈合反应通常描述为具有三个不同的阶段,损伤、炎症和修复。一般而言,身体利用炎性反应响应损伤,所述炎性反应对维持生物体的健康和完整性是至关重要的。然而,如果它出错,则它可以导致组织破坏。
I阶段:损伤
由包括但不限于自身免疫或过敏反应、环境微粒、感染或机械伤害的因素造成的损伤通常导致正常组织架构的破裂,起始愈合反应。受损上皮和内皮细胞必须被替换以分别地维持屏障功能与完整性和阻止失血。对内皮细胞的急性伤害导致释放炎性介质和开始抗纤维蛋白溶解凝结级联,利用富含血小板和纤维蛋白的凝块暂时地填塞受损脉管。例如,与慢性阻塞性肺病(COPD)和对照患者相比,来自特发性肺纤维化(IPF)患者的肺匀浆、上皮细胞或支气管肺泡灌洗液包含更高水平的血小板-分化因子、X-盒-结合蛋白-1,这表明凝块形成反应被连续地激活。此外,凝血酶(将纤维蛋白原转化为纤维蛋白所需的丝氨酸蛋白酶)也容易在多种肺纤维变性条件的肺和肺泡内空间内检测到,这进一步确认凝血途径的激活。凝血酶还可以直接地活化成纤维细胞,所述活化增加增殖并促进成纤维细胞分化为产胶原成肌纤维细胞。对气道上皮(具体地,肺泡肺细胞)的伤害可以诱发类似的抗纤维蛋白溶解级联,并且导致间质性水肿、急性炎症的区域和上皮从基底膜分离。
血小板募集、脱粒和凝块形成迅速地发展为具有增加的渗透性的血管收缩阶段,其允许外渗(白细胞从毛细血管移动至环绕毛细血管的组织)和直接募集白血球至损伤位点。基底膜(其形成在实质组织的上皮和内皮下方的细胞外基质)妨碍直接接近受损组织。为了破裂此物理屏障,锌依赖性肽链内切酶,也称为基质金属蛋白酶(MMP),裂解一种或多种细胞外基质构分,允许细胞外渗进入和离开受损位点。具体地,MMP-2(明胶酶A,N型胶原酶)和MMP-9(明胶酶B,IV型胶原酶)裂解N型胶原和明胶(基底膜的两种重要的构分)。最近的研究已经发现MMP-2和MMP-9是上调的,这强调组织破坏和再生过程在纤维变性条件中是常见的。MMP的活性受多种机制控制,包括转录调节、酶原调节,和特定的MMP的组织抑制剂。MMP和多种抑制机制之间的平衡可以调节炎症和确定在愈合反应期间沉积的胶原的净量。
使用变应性气道炎症的模型和利用MMP-2-/-、MMP-9-/-和MMP-2-/-MMP-9-/-双基因敲除小鼠重构的先前的研究显示MMP-2和MMP-9对炎性细胞成功地退出和清除出发炎组织并进入气腔是需要的。在不存在这些MMP的情况下,细胞被截留在肺的实质内,并且不能够移动进入气腔,其导致致命的窒息。
II阶段:炎症
一旦已经实现接近组织伤害的位点,趋化因子梯度募集炎性细胞。在急性损伤的位点处观察到嗜中性粒细胞、嗜酸性细胞、淋巴细胞和巨噬细胞,以及细胞碎片和被吞噬细胞清除的坏死的区域。
提供炎性细胞因子和趋化因子的嗜酸性细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞的早期募集可以有助于局部的TGF-β和IL-13积聚。在最初损伤和炎性细胞的波动之后,炎性细胞的晚期募集可以在清除细胞碎片方面和控制过量的细胞增殖方面帮助吞噬作用,其一起可以有助于正常的愈合。晚期炎症可以起抗纤维变性的作用并且对成功地消除(resolution)创伤愈合反应可以是需要的。例如,除抑制局部的趋化因子产生和TGF-β的IL-10分泌性调节T细胞之外,还富含帮助成纤维细胞清除的吞噬性巨噬细胞的晚期炎性谱(profile)可以阻止过量的成纤维细胞活化。
损伤或病原体的性质通常决定随后发生的炎性反应的特性。例如,外源性刺激如病原体相关分子模式(PAMP)被病原体识别受体,比如toll样受体和NOD样受体(炎性和凋亡反应的调节中具有各种功能的胞质蛋白)识别,并且影响先天细胞对入侵病原体的应答。内源性危险信号还可以影响局部的先天细胞并协调地安排炎性级联。
炎性反应的性质显著地影响驻留组织细胞和随后发生的炎性细胞。炎性细胞自身还通过分泌趋化因子、细胞因子和生长因子传播进一步的炎症。许多细胞因子参与整个创伤愈合和纤维变性反应,其中特定的基因的组在多种条件中活化。例如,哮喘患者中的慢性变应性气道疾病一般地与升高的2型辅助T细胞(Th2)相关细胞因子谱(包括但不限于,白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-6(IL-6)、白介素-13(IL-13)、和白介素-9(IL-9))相关联,而慢性阻塞性肺病和纤维变性肺病(比如特发性肺纤维化)患者更频繁地呈现促炎细胞因子谱(包括但不限于,白介素-1α(IL-1α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、转化生长因子β(TGF-β)、和血小板源生长因子(PDGF))。已经显示这些细胞因子中的每个展示显著的促纤维变性活性,通过成纤维细胞、巨噬细胞和成肌纤维细胞的募集、活化和增殖来发挥作用。
III阶段:组织修复和收缩
创伤愈合的闭合阶段由以下构成:由富含纤维蛋白(聚合以形成“网状物”的纤维状蛋白质,所述网状物形成创伤位点上方的凝块)的支架形成引导的精心安排的细胞重组、创伤收缩、闭合和再上皮化(re-epithelialization)。阐明涉及此阶段的创伤修复的过程的绝大部分研究来自真皮创伤研究和体外系统。
成肌纤维细胞源胶原和平滑肌肌动蛋白(α-SMA),与形成纤维蛋白支架的巨噬细胞、血小板、和成纤维细胞源纤连蛋白一起形成临时性细胞外基质。共同地,这些结构一般地称为肉芽组织。从特发性肺纤维化患者分离的原代成纤维细胞或肺泡巨噬细胞比对照成纤维细胞产生显著更多的纤连蛋白和α-SMA,其指示提高的成纤维细胞活化的状态。已经报道了经历类固醇治疗的IPF患者具有与不治疗的IPF患者相似的升高水平的巨噬细胞源纤连蛋白。因而,类似于类固醇抗性IL-13-介导的成肌纤维细胞分化,巨噬细胞源纤连蛋白释放还似乎耐受类固醇治疗,这提供了类固醇治疗为什么可能无效的另一种原因。根据动物模型,纤连蛋白似乎对肺纤维化的发展是需要的,因为与它们的野生型对应物(counterpart)相比,具有纤连蛋白的额外(extra)III型结构域(EDA)的特定缺失的小鼠在博来霉素施用之后发展出显著更少的纤维化。
除纤连蛋白以外,临时性细胞外基质由糖蛋白(比如PDGF)、糖葡胺聚糖(比如透明质酸)、蛋白多糖和弹性蛋白构成。生长因子和TGF-β-活化的成纤维细胞沿着细胞外基质网络迁移并修复创伤。在皮肤创伤内,TGF-β还诱导收缩反应,调节胶原纤维的取向。如上面讨论的,成纤维细胞至成肌纤维细胞分化还产生应力纤维和新表达的α-SMA,其二者均赋予成肌纤维细胞内的高收缩活性。特定位点处的成肌纤维细胞至细胞外基质的附着称为“纤维联结(fibronexus)”或“超成熟黏着斑”,将创伤拉在一起,减小在收缩阶段期间的病变大小。细胞外基质铺设的程度和活化的成肌纤维细胞的数量决定胶原沉积量。为此,基质金属蛋白酶(MMP)对金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP)和胶原对胶原酶的平衡在整个反应期间变化,从促合成(pro-synthesis)和增加的胶原沉积朝向受控的平衡移动,而没有胶原的净增加。对于成功的创伤愈合,当成纤维细胞经历凋亡,炎症开始消退,并且肉芽组织退缩时,通常发生此平衡,留下富含胶原的病变。炎性细胞,并且尤其是α-SMA-阳性成肌纤维细胞的移除对终止胶原沉积是必不可少的。有趣地,在特发性肺纤维化患者中,成纤维细胞的移除可以被延迟,其中细胞耐受凋亡信号,尽管观察到升高水平的促凋亡和FAS-信号传导分子。此对凋亡的相对抗性可以潜在地是此纤维变性疾病的病因。然而,多种研究还已经在特发性肺纤维化中观察到增加比率的胶原分泌成纤维细胞和上皮细胞凋亡,这表明有另一种平衡需要监测成纤维细胞凋亡和成纤维细胞增殖。根据皮肤研究,创伤位点的再上皮化重建屏障功能并允许包被的细胞重组。使用在胶原基质上方生长的人或大鼠上皮细胞,或体内气管创伤的多种体外和体内模型,已经用于鉴定细胞迁移、增殖、和细胞扩散的显著阶段。迅速的和动态的运动性和增殖,以及上皮从裸露区域的边缘的整复发生在初始创伤的数小时内。此外,上皮细胞的滑片(sliding sheet)可以在损伤区域上方迁移,帮助创伤覆盖。已经显示多种因子调节再上皮化,包括血清源转化生长因子α(TGF-α)、和基质金属蛋白酶-7(MMP-7)(其自身由TIMP-1调节)。
共同地,炎症的程度、血管发生、和细胞外基质沉积量均有助于纤维变性病变的最终发展。因而,干扰成纤维细胞活化、增殖或凋亡的治疗干预需要对创伤修复的全部阶段的彻底理解和领会。虽然这三个阶段通常顺序地呈现,但是在慢性或反复损伤期间,这些过程并行地作用,向调控机制提出显著的要求。(Wilson和Wynn,MucosalImmunol.,2009,3(2):103-121)。
2.作为病理学的纤维化
纤维化代表器官或组织中过量的纤维结缔组织的形成和发育,其由于导致疤痕的正常或异常/反应性创伤愈合反应而形成。纤维化的特征在于,例如,非限制性地,细胞外基质蛋白的异常沉积、成纤维细胞增殖的异常促进、成纤维细胞群分化为成肌纤维细胞群的异常诱导、成肌纤维细胞附着至细胞外基质的异常促进、或其组合。
促炎介质
越来越多的证据已经表明已知为细胞因子的多肽介质,包括多种淋巴因子、白介素和趋化因子,对纤维化中的胶原沉积是重要的刺激。由驻留组织细胞和募集的炎性细胞释放,细胞因子被认为刺激成纤维细胞增殖和细胞外基质蛋白(包括胶原)的增加的合成。例如,特发性肺纤维化的发病机理中的早期特征是肺泡上皮和/或毛细血管细胞损伤。这促进募集循环免疫细胞进入肺,比如单核细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞和嗜酸性细胞。然后,这些效应细胞与驻留肺细胞,比如巨噬细胞、肺泡上皮和内皮细胞起释放细胞因子,其刺激靶细胞(通常地,成纤维细胞)以复制和合成增加量的胶原。还可以抑制细胞外基质蛋白的断裂,从而有助于纤维变性过程。(Coker和Laurent,Eur RespirJ,1998,;11:1218-1221)
众多细胞因子已经涉及纤维化的发病机理,非限制性地包括,转化生长因子-β(TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血小板源生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、内皮素-1(ET-1)和白介素(白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)和白介素-17(IL-17))。趋化因子白血球化学引诱物,包括调节活化正常T-细胞表达和分泌的因子(factor Regulated upon Activation inNormal T-cells,Expressed and Secreted)(RANTES),也被认为发挥重要的作用。升高水平的促炎细胞因子,比如白介素8(IL-8),以及相关的下游细胞粘附分子(CAM)比如细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和血管细胞粘附分子-1(VCAM-1),基质金属蛋白酶比如基质金属蛋白酶-7(MMP-7),和信号传导分子比如S100钙结合蛋白A12(S100A12,又称为钙粒蛋白C),在周围血中已经发现与死亡率、无肺移植存活、和患有特发性肺纤维化的患者中的疾病进展相关联(Richards等,Am JRespir Crit CareMed,2012,185:67-76)。
TGF-β蛋白家族对细胞外基质沉积具有强有力的刺激作用,并且实际上已经用于通过基因转移构建纤维化的诱导动物模型。体外研究显示TGF-β作为潜在前体分泌,促进成纤维细胞前胶原基因表达和蛋白质合成。数据表明其它哺乳动物同种型TGF-β2和TGF-β3也刺激人肺成纤维细胞胶原合成和减少体外断裂。在肺纤维化的动物模型中,增强的TGF-β1基因表达与增加的胶原基因表达和蛋白质沉积在时间上和空间上相关。TGF-β1抗体减少鼠博来霉素诱导的肺纤维化中的胶原沉积,并且人纤维变性肺组织显示增强的TGF-β1基因和蛋白质表达。
TNF-α可以刺激体外成纤维细胞复制和胶原合成,并且在小鼠中,肺TNF-α基因表达在施用博来霉素后上升。可溶性TNF-α受体减少鼠模型中的肺纤维化,并且转基因小鼠中肺TNF-α的过表达特征在于肺纤维化。在患有IPF或石棉沉着病(由石棉纤维的吸入和滞留引起的影响肺的实质组织的慢性炎性和纤维变性医疗状况)的患者中,与对照相比,支气管肺泡灌洗液源巨噬细胞释放增加量的TNF-α。
内皮素(ET-1)还满足原纤维变性(profibrotic)细胞因子的标准。此分子促进成纤维细胞增殖和趋化性并刺激前胶原产生。在患有肺纤维化的患者的肺中呈现,并且最近的报道表明当施用至实验动物时,ET-1受体拮抗物波生坦改善肺纤维化。
未受遏制的成肌纤维细胞增殖/活化和纤维变性病灶形成
成纤维细胞分化为成肌纤维细胞已经长期被认为是许多状况中的重要事件,包括创伤修复和纤维化。例如,已经报道了成肌纤维细胞在活跃纤维化的区域中出现,并且是肺纤维化中细胞外基质(ECM)蛋白产生和沉积的原因。(Liu,T.等,Am JRespir CellMolBiol,2007,37:507-517)。
特发性肺纤维化的成因的一个假设表明仍未确定的刺激产生急性肺损伤的反复发作。这些损伤位点处的创伤愈合最终导致纤维化,以及失去肺功能。成纤维细胞病灶,特发性肺纤维化的特征病变,以间充质细胞的活跃复制和新鲜细胞外基质的丰富沉积为特征。这样的病灶是典型的肺泡上皮细胞损伤,伴有腔内血浆渗出和远端气腔的萎陷。正常地与创伤愈合相关联的介质,比如转化生长因子-β1(TGF-β1)和结缔组织生长因子,也在这些位点处表达。此局部急性肺损伤和创伤修复的驱动力是未知的。
3.纤维化发挥作用的疾病或状况
纤维化已经涉及大量异质性疾病或状况,包括但不限于,间质性肺病,比如特发性肺纤维化、急性肺损伤(ALI)、辐射诱发的纤维化、和移植排斥。
3.1.特发性肺纤维化(IPF)
特发性肺纤维化(IPF,又称为隐原性纤维性肺泡炎CFA,或特发性纤维性间质性肺炎)被限定为主要在老年人中发生的不确定病因的慢性、进行性纤维性间质性肺炎的特定形式,被限于肺,并且与常见的间质性肺炎(UIP)的放射学和组织学模式相关联(Raghu G.等,Am J Respir Crit Care Med.,183(6):788-824,2011;Thannickal,V.等,Proc AmThorac Soc.,3(4):350-356,2006)。其可以特征在于肺间质中纤维变性组织的异常和过量沉积。在高分辨率计算机断层摄影术(HRCT)图像上,UIP特征在于存在通常与牵拉性支气管扩张症(traction bronchiectasis)相关联的网状混浊。随着IPF进展,蜂窝样变得更显著(Neininger A.等,JBiol Chem.,277(5):3065-8,2002)。肺功能测试通常揭示一氧化碳的限制性损害和减小的弥散量(Thomas,T.等,J Neurochem.,105(5):2039-52,2008)。研究已经报道了在患有特发性肺纤维化(IPF)的患者中释放的TNF-α和IL-6的显著增加(Zhang,Y,等J.Immunol.150(9):4188-4196,1993),其已经归因于IL-1β的表达水平(Kolb,M.,等J.Clin.Invest,107(12):1529-1536,2001)。IPF症状呼吸急促和咳嗽的发病通常是隐伏的但逐步地进展,在诊断后五年内70%的患者发生死亡。此糟糕的预后类似于由乳腺癌引起的年死亡数(Raghu G.等,Am J Respir Crit Care Med.,183(6):788-824,2011)。
在美国,IPF困扰几乎130,000名患者,以及全世界每年大约50,000名新患者和每年几乎40,000例死亡(Raghu G.等,Am J Respir Crit Care Med.,183(6):788-824,2011)。虽然这些数据是显著的,但是最近的研究报道IPF可能比先前认为的更流行5-10倍,可能由于增加的流行率或增强的诊断能力(Thannickal,V.等,ProcAm Thorac Soc.,3(4):350-356,2006)。肺移植被认为是用于IPF的确定性疗法,但是肺移植之后的五年存活小于50%。因此,即使是肺移植也不能被认为是对IPF的“治愈(cure)”。除对患者的身体和情绪影响以外,IPF的治疗和护理极度昂贵,每年对每100,000名患者具有在$28亿美元的范围内的国家医疗保健成本。
此外,先前的研究已经表明叠加的环境损伤在特发性肺纤维化的发病机理中可以是重要的。在大多数报道的病例系列中,多至75%患有特发性肺纤维化的索引患者(indexpatient)是现或曾吸烟者。在大规模流行病学研究中,吸烟已经与特发性肺纤维化强烈地相关联。此外,特发性肺纤维化的许多炎性特征相比管理至潜在的肺病更强烈地关联至吸烟状态。因而,吸烟可以是特发性肺纤维化的独立风险因子。潜伏性病毒感染,尤其是疱疹病毒家族的那些,也已经被报道与特发性肺纤维化相关联。
由于不存在用于IPF的已知的有效治疗,包括肺移植,对开发新型疗法仍存在关键的需要。存在当前正在研究的各种治疗途径,包括可以减慢或抑制身体产生疤痕或纤维变性组织的能力的抗纤维变性疗法和增加肺中用于气体交换的组织面积的肺血管舒张剂。除肺移植以外,潜在的IPF治疗已经包括皮质类固醇、硫唑嘌呤、环磷酰胺、抗凝剂、和N-乙酰半胱氨酸(Raghu G.等,Am JRespir Crit CareMed.,183(6):788-824,2011)。此外,常规地采用支持疗法比如氧气疗法和肺康复。然而,这些中没有一种已经明确地影响IPF患者的长期存活,其进一步强调IPF中治疗选择的未满足的医疗需要。作为实例,不管混合临床计划结果,InterMune的口服小分子(吡非尼酮)接受欧洲和日本批准用于患有IPF的患者。因而成为具体地指示用于IPF的治疗的第一种药物;由于可疑的试验结果和药物副作用,药物的实用性在美国审查时被怀疑,并且基于那时提交的数据没有收到FDA批准。因此,大规模的3期临床试验在进行中以测定其功效,从而支持在美国的新药申请。
组织病理学上,IPF可以描述为成纤维细胞病灶中活化的成肌纤维细胞(或间充质细胞)的积聚(Thannickal,V.等,Proc Am Thorac Soc.,3(4):350-356,2006)。成肌纤维细胞的受损的凋亡可以导致以组织纤维化告终的持续的和失调的修复过程。可以说,炎症还在IPF中发挥关键的作用,可能通过成纤维细胞的周期性急性刺激。这些发现指向用于治疗干预的潜在目标。
3.1.1.特发性肺纤维化(IPF)的发病机理
虽然不完全地理解致病机制,当前接受的范例提出在对肺泡上皮的损伤之后,接着发生引发与正常的组织修复相关联的应答的促炎和纤维增殖介质的爆发。出于不清楚的原因,这些修复过程总是不消退并且随后发生进行性纤维化。(Selman M,等,Ann InternMed,134(2):136-151,2001;Noble,P.和Homer R.,Clin Chest Med,25(4):749-58,2004;Strieter,R.,Chest,128(5Suppl1):526S-532S,2005)。
3.1.2.肺纤维化的博来霉素小鼠模型
虽然存在大量动物模型并且可以是有用的(例如,TGF-β腺病毒转导模型或辐射诱导的纤维化模型),但是博来霉素模型是现今使用的详细记录和最佳表征的鼠模型以证明炎症后/纤维变性前/纤维预防阶段中特定药物或蛋白激酶抑制剂的功效(Vittal,R.等,JPharmacol Exp Ther.,321(1):35-44,2007;Vittal,R.等,Am JPathol.,166(2):367-75,2005;Hecker L.等,Nat Med.,15(9):1077-81,2009)。
抗生素博来霉素最初从轮丝链霉菌分离(Umezawa,H.等,Cancer 20:891-895,1967)。此抗生素随后被发现针对鳞状细胞癌和皮肤肿瘤有效(Umezawa,H.,FedProc,33:2296-2302,1974);然而,其作为抗肿瘤剂的有效性受限于导致纤维化的剂量依赖性肺毒性(Muggia,F.等,Cancer Treat Rev,10:221-243,1983)。经由气管内途径递送博来霉素(通常1.25-4U/kg,其取决于来源)具有优势,药物的单次注射在啮齿动物中产生肺损伤和由此导致的纤维化(Phan,S.等,Am Rev Respir Dis 121:501-506,1980;Snider,G.等,Am RevRespir Dis.117:289-297,1978;Thrall,R.等,Am JPathol,95:117-130,1979)。气管内递送药物至啮齿动物导致最初对肺泡上皮细胞的直接伤害。第一周内,此事件之后接着发生嗜中性粒细胞和淋巴细胞全肺泡炎的发展(Janick-Buckner,D.等,ToxicolApplPharmacol.,100(3):465-73,1989)。随后,肺泡炎性细胞被清除,注意到成纤维细胞增殖,并且细胞外基质被合成(Schrier D.等,Am Rev Respir Dis.,127(1):63-6,1983)。此模型中纤维化的发展可以在第14天前在生物化学上和组织学上看到,而且最大应答通常在第21-28天左右显著(Izbicki G.等,Int JExp Pathol.,83(3):111-9,2002;Phan,S.等,Chest.,83(5Suppl):44S-45S,1983)。然而,超过第28天,对博来霉素的应答是更可变的。原始报道表明气管内递送的博来霉素可以诱导进展或持续60-90天的纤维化(Thrall R.等,Am JPathol.,95(1):117-30,1979;Goldstein R.,等,Am Rev Respir Dis.,120(1):67-73,1979;Starcher B.等,Am RevRespirDis.,117(2):299-305,1978);然而,其它报道证明了在此时期后开始消退的自限性反应(Thrall R.等,Am J Pathol.,95(1):117-30,1979;Phan,S.等,Chest,83(5Suppl):44S-45S,1983;Lawson W.等,Am JPathol.2005;167(5):1267-1277)。虽然此模型的消除性质不模拟人疾病,但是模型的此方面提供了在这些后期的时间点处研究纤维变性消退的机会。
3.2.急性肺损伤(ALI)
急性肺损伤(ALI)和其更严重的形式,急性呼吸窘迫综合征(ARDS),是由急性肺水肿和炎症引起的急性呼吸衰竭的综合征。ALI/ARDS是由包括脓毒症(肺源性和非肺源性)、肺炎(细菌性、病毒性和真菌性)、胃和口咽内容物的吸入、严重创伤、和多种其它临床障碍(包括重度急性胰腺炎、药物过量、和血液产物)的各种临床障碍在全部年龄的患者中发展的急性呼吸衰竭的原因(Ware,L.和Matthay,M.,N Engl JMed,342:1334-1349,2000)。大多数患者需要利用正压力辅助通气。主要的生理学异常是重度动脉低氧血症以及继发于肺死腔分数急剧增加的分钟通气量的显著增加。患有ALI/ARDS的患者发展出由流体外渗进入肺的间质和气腔隔室造成的富含蛋白质的肺水肿,所述流体的外渗继发于增加的屏障的渗透性。另外的病理学变化指示涉及肺水肿的机制是复杂的,并且水肿只是ALI/ARDS中的病理生理学事件之一。一个生理学结果是导致增加的呼吸功的肺顺应性的显著降低(NucktonT.等,N Engl J Med,346:1281-1286,2002),这是需要辅助通气支持大多数患者的原因之一。
已经表明机械通气(MV),用于ALI的支柱治疗,通过在呼吸系统的多种组成上实施引起通气机相关肺损伤(VALI)的机械应力潜在地导致且恶化渗透性(Fan,E.等,JAMA,294:2889-2896,2005;MacIntyre N.,Chest,128:561S-567,2005)。最近的试验证明了与高潮气量(HVT)相比,以低潮气量(LVT)通气的患者中显著改善的存活(The Acute RespiratoryDistress Syndrome N.Ventilation with Lower Tidal Volumes as ComparedwithTraditional Tidal Volumes for Acute Lung Injury and the Acute RespiratoryDistress Syndrome.N Engl J Med;342:1301-1308,2000)。不同于在较低的潮气量下通气,其假定施加更低的机械应力,对于VALI几乎不存在病理生理学的机械学理解,并且没有定向疗法。
已经表明高潮气量(HVT)机械通气(MV)导致p38MAP激酶的磷酸化、MK2的活化和HSPB1的磷酸化,这个引起肌动蛋白从HSPB1离解并且聚合以形成应力纤维的过程,其最终导致穿细胞间隙和增加的血管渗透性。此外,显示抑制p38MAP激酶或其下游效应子MK2阻止HSPB1的磷酸化并通过废除肌动蛋白应力纤维形成和细胞骨架重排保护免受血管渗透性,这表明靶向抑制MK2可能是用于治疗急性肺损伤的潜在的治疗策略(Damarla,M.等,PLoSONE,4(2):E4600,2009)。
而且,研究已经表明肺纤维化还可以由ALI造成。ALI可以完全消除或进展至纤维性肺泡炎,伴随持续的血液中的低氧(低氧血症)和减小的肺每次呼吸膨胀的能力(减小的肺顺应性)。表明虽然损伤诱发的肺纤维化的病因不同于特发性肺纤维化,但是两种疾病共享共同的病理学机制,即,使成纤维细胞浸润入肺的气腔(Tager等.,Nat.Med.14:45-54,2008;Ley,K.和Zarbock,A.,Nat.Med.14:20-21;2008)。
3.3.辐射诱发的纤维化
纤维化是通过放射治疗的两种癌症治疗和事故性辐照的常见后遗症。放射治疗之后的纤维变性病变已经在许多组织中描述,包括皮肤(Bentzen,S.等,Radiother.Oncol.15:261-214,1989;Brocheriou,C.,等,Br.J.Radiol.Suppl.19:101-108,1986)、肺(Lopez Cardozo,B.等,Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.,11:907-914,1985)、心(Fajardo,L.和Stewart,J.,Lab.Invest.,29:244-257,1973)、和肝(Ingold,J.等,Am.J.Roentgenol.,93:200-208,1965)。
在肺(晚期应答组织)中,可以发生两种辐射毒性综合征,辐射性肺炎和肺纤维化。肺炎在完成放射治疗2-3个月后显现。病理学上,肺炎特征在于间质性水肿,存在间质性和肺泡炎性细胞,并且II型肺细胞的数目增加(Gross,N.等,Radiat.Res.,III:143-50,1981;Guerry-Force,M.等,Radiat.Res.114:138-53,1988)。在肺炎中,对组织的主要伤害最可能由实质细胞的耗竭造成(Hendry,J.,Radiat.Oncol.Vol.4,2:123-132,1994;Rosiello,R.等,Am.Rev.Respir.Dis.,148:1671-1676,1993;Travis,E.和Terry,N.,Front.Radiat.Ther.Oncol.,23:41-59,1989)。
纤维变性反应具有以下特点:增加的间质性胶原沉积、血管壁的增厚和血管闭塞(Vergava,J.等,Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.2:723-732,1987)。纤维变性病变的组织学检查已经揭示了纤维变性组织包含浸润性炎性细胞、成纤维细胞、和更大量的多种细胞外基质组分。在纤维变性组织中,已经描述了间质性胶原、纤连蛋白和蛋白多糖的增强的合成和沉积(Maasiha,P.等,Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.20:973-980,1991),并且这已经解释为成纤维细胞细胞系统的辐射诱发的调节的结果(Remy,J.等,Radiat.Res.125:14-19,1991)。
辐射诱发的纤维化,尤其是肺的纤维化,表明是由于从事纤维变性反应的多种细胞系统之间的细胞和分子事件的相互影响。辐照能够单独地诱导成纤维细胞/纤维细胞细胞系统的过早的终末分化过程,其导致有丝分裂期后的纤维细胞的增强的积聚,这特征在于间质性胶原的合成的数倍增加。与此同时,伴随的实质细胞类型,比如肺泡巨噬细胞和肺泡II型肺细胞的辐照诱导特定的细胞因子如TGF-β1的立即合成,其然后变更实质细胞与成纤维细胞细胞系统的相互作用。TGF-β1,作为负责纤维变性反应的主要的细胞因子之一,经由祖成纤维细胞细胞类型的扩展以及祖成纤维细胞过早地终末分化为有丝分裂期后的纤维细胞诱导成纤维细胞增殖。由于干扰祖成纤维细胞和有丝分裂期后的纤维细胞的均衡细胞类型比率,这导致有丝分裂期后的纤维细胞的积聚。提出辐照之后的病理生理学组织应答由改变的细胞因子和生长因子介导的多细胞细胞系统的相互作用造成,其导致干扰间质性成纤维细胞/纤维细胞细胞系统的均衡细胞类型比率。(Rodemann,H.和Bamberg,M.,Radiotherapy and Oncology,35,83-90,1995)。
3.4.移植排斥
移植是将细胞、组织或器官从一个位点转移至另一个位点的行为。可以利用来自供体的器官(例如,肾、肝、心、肺或胰腺)的移植矫正器官系统的机能障碍。然而,免疫系统仍然是对作为常规医疗的移植的最强大的屏障,并且这样的器官的排斥通常对应于移植器官中的纤维变性表型。免疫系统已经发展出精密和有效的机制以对抗外来物(foreignagent)。这些机制还参与移植器官的排斥,所述移植器官被宿主的免疫系统识别为外源的。
对移植的免疫反应程度部分地取决于移植器官和宿主之间的遗传差异的程度。异种移植,其是不同物种的成员之间的移植,具有最大差异并且引起最大的免疫反应,经历迅速的排斥。自体移植物,其是从身体的一部分至另一部分的移植物(例如,皮肤移植物),不是外源组织,并且因此不引起排斥。同系移植,其是遗传上相同的个体(例如,同卵双胞胎)之间的移植,也不经历排斥。
同种异体移植是遗传上不同的相同物种的成员之间的移植。这是移植的最常见形式。同种异体移植经历排斥的程度部分地取决于供体和宿主之间的相似性或组织相容性的程度。
应答的程度和类型还随着移植的类型改变。一些位点,比如眼和脑,是免疫特殊的(即,它们具有最小的或不具有免疫系统细胞,并且可以耐受甚至不匹配的移植物)。皮肤移植物不被初始地血管化,并且所以不显现排斥直到血液供给发展。肺、心、肾和肝是高度血管器官并且在宿主中通常导致强烈的细胞介导的应答,其需要免疫抑制疗法。
缩窄性细支气管炎(CB),也称为肺移植患者闭塞性细支气管炎,是主要在膜性和呼吸性细支气管的壁和相邻组织中发生并导致它们的腔变窄的炎症和纤维化。CB见于各种场景(setting),最经常作为肺与心-肺移植(影响34%至39%的患者,通常在移植后的头2年)和骨髓移植的并发症,但是也在类风湿性关节炎中,在吸入毒剂比如二氧化氮后,在摄取某些药物比如青霉胺和摄取东亚蔬菜守宫木(Sauropus androgynous)后,并且作为儿童中腺病毒、A型流感、麻疹和肺炎支原体感染的罕见并发症。在肺移植中,CB是其后导致死亡的单个最重要的因素。在一个研究中,总死亡率是25%。然而,同时,无症状并且由经支气管活组织检查单独诊断的87%的患者具有疾病的消退或稳定。FEV1从基线的降低可以用于临床支持移植患者中的CB;术语闭塞性细支气管炎综合征用于表示此临床机能障碍,并且已经为其建立分级系统,其现在在文献中广泛地使用。肺移植中CB的发展的显著风险因子包括同种异体抗原依赖性和非依赖性机制。在前者组中,为晚期急性排斥和A位置处的HLA错配;在后者中,为由移植手术和巨细胞病毒感染造成的对气道的局部缺血/再灌注损伤(Schlesinger C.等,Curr Opin Pulm.Med.,4(5):288-93,1998)。
排斥的机制
对移植器官的免疫反应由细胞(淋巴细胞介导的)和体液(抗体介导的)机制二者组成。虽然也涉及其它细胞类型,但是T细胞是移植物排斥的中心。排斥反应由致敏阶段和效应物阶段组成。
致敏阶段
在此阶段中,CD4和CD8 T细胞经由它们的T-细胞受体识别在外源移植物的细胞上表达的同种异体抗原。抗原的识别需要两个信号;第一个通过T细胞受体与MHC分子呈递的抗原的相互作用提供,第二个由T细胞/APC表面上的共刺激受体/配体相互作用提供。在众多的共刺激途径中,T细胞表面上的CD28与其APC表面配体B7-1或B7-2(一般分别已知为CD80或CD86)的相互作用已经研究最多(Clarkson,M.和Sayegh,M.,Transplantation;80(5):555-563,2005)。此外,细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA4)还结合至这些配体并且提供抑制剂信号。其它共刺激分子包括CD40和其配体CD40L(CD154)。典型地,MHC分子的螺旋形成肽结合沟并且被源自正常细胞蛋白质的肽占据。胸腺或中枢耐受机制(克隆缺失)和外周耐受机制(例如,无反应性)确保这些自体肽MHC复合物不被T细胞识别,从而预防自身免疫反应。
效应物阶段
同种异体抗原依赖性和非依赖性因素有助于效应物机制。最初,非免疫性“损伤反应”(缺血)诱导非特异性炎性反应。正因如此,随着粘附分子、II类MHC、趋化因子和细胞因子的表达上调,T细胞的抗原呈递增加。其还促进完整的可溶性MHC分子脱落,实施MHC分钟可以活化间接的同种异体识别途径。在活化后,CD4阳性T细胞起始巨噬细胞介导的迟发型超敏反应(DTH)应答并且向B细胞提供帮助用于抗体产生。
多种T细胞和T细胞源细胞因子比如IL-2和IFN-γ在移植后不久上调。稍后,表达β-趋化因子如RANTES(在活化后调节,正常的T细胞表达和分泌)、IP-10和MCP-1,并且这促进同种异体移植的强烈的巨噬细胞浸润。IL-6、TNF-α、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和生长因子也在此过程中发挥作用。生长因子,包括TGF-β和内皮素,引起平滑肌增殖、内膜增厚、间质性纤维化、和在肾的情况下的肾小球硬化症。
由T细胞源细胞因子活化的内皮细胞和巨噬细胞表达II类MHC、粘附分子和共刺激分子。这些可以呈递抗原并且从而募集更多的T细胞,其放大排斥过程。通过递送“致死一击(lethal hit)”,或者可选地,通过诱导凋亡,CD8阳性T细胞介导细胞介导的细胞毒性反应。
此外,新兴研究已经表明器官移植的慢性移植排斥涉及纤维变性过程。例如,显示慢性肺同种异体移植排斥由相对缺乏的同种异体移植物内皮细胞源HIF-1α介导,导致移植器官的纤维变性重构(Wilkes,D.,JClinInvest.,121(6):2155-2157,2011;Jiang,X.等,JClinInvest.,121(6):2336-2349,2011)。
3.5.慢性阻塞性肺病(COPD)
慢性阻塞性肺病(COPD)是由慢性和相对不可逆的呼气气流机能障碍(由于慢性阻塞性支气管炎、气肿和/或慢性哮喘的一些组合),代表的肺病的集体描述。COPD由一系列环境和遗传风险因子造成,包括促成该疾病的抽烟。
COPD的流行在全世界增加,并且COPD已经成为美国的第四大死亡原因。在美国,尽管最近数十年中吸烟降低,但是与COPD相关联的流行率和死亡率增加并且预计仍继续增加数年。此外,COPD是昂贵的,并且急性发作,其在患有中度或更严重的COPD的患者中大致上一年发生一次,构成最昂贵的组成。
在COPD中,气流阻塞可以在肺的两个非常不同的病例生理学过程中的任一个的基础上发生:1)实质的炎症,其导致肺实质的蛋白质水解和肺弹性的失去(气肿);和2)小气道的炎症、结疤和变窄(“小气道疾病”)。在个体患者中,这些过程中的一个,其可以受控于不同的遗传因素,可以占优势,尽管二者通常共存。最后,这些过程二者均产生相似模式的功能损害:减少的呼气流、充气过度和气体交换的异常。
在COPD的早期阶段,在COPD患者的肺中发现下列症状:1)通过破坏气溶胶使气道上皮破裂,2)炎性粘液性渗出物的积聚,3)通过炎性免疫细胞浸润气道壁,4)气道重构/气道壁增厚和侵占腔空间,和5)对气流的增加的阻力。在此早期阶段期间,平滑肌收缩和高反应性也增加阻力,但是增加的阻力通过支气管扩张药缓解。
在晚期阶段,COPD患者在环绕气道壁的上皮下和外膜(aventitial)隔室中特征性地发展纤维结缔组织的沉积。这样的细支气管周纤维化通过限制随肺膨胀发生的气道管径的扩大有助于固定的气道闭塞。
3.5.1.慢性支气管炎
慢性支气管炎限定为在连续两年的至少三个月内存在慢性咳嗽和痰产生,而不存在认为引起痰产生的其它疾病。在慢性支气管炎中,在流行病学上,支气管上皮变得慢性发炎,具有粘液腺体肥大和增加数目的杯状细胞。纤毛也被毁坏,并且粘液纤毛活动梯(escalator)的效率被极大地损害。粘液粘性和粘液产生增加,导致难以喀痰。粘液的淤积导致增加的对感染的易感性。
在显微镜上,存在炎性细胞对气道壁的浸润。炎症之后是增厚壁并且还导致气道变窄的结疤和重构。随着慢性支气管炎进展,存在鳞状化生(气道内部衬里组织中的异常变化)和纤维化(进一步增厚气道壁和使其结疤)。这些变化的结果是气流的限制。随时间的反复感染和炎症导致对气道壁的不可逆性结构伤害并且导致结疤,并具有较小的外周气道的变窄和畸变。
3.5.2.气肿
按照其病理学特征限定气肿,特征在于在末端细支气管远端的末端气腔的异常扩张,以及它们的壁的毁坏和肺弹性的失去。如果气肿的区域的直径大于1cm,则由于膨胀过度可以发展出大疱(大于1cm宽的疱)。异常气腔的分布允许两种主要模式的气肿的分类:全腺泡性(全小叶性)气肿,其导致膨胀,并且毁坏整个腺泡,特别是肺的下半部。腺泡中央性(小叶中央性)气肿涉及围绕呼吸细支气管的伤害,其影响肺的上叶和下叶的上部。气肿的某些形式另外已知与纤维化相关联。
气肿的破坏过程主要与吸烟相关联。香烟烟雾是刺激物并且导致气道和肺泡的低度炎症。已知香烟包含超过4,000种毒性化学品,其影响肺内的抗蛋白酶和蛋白酶之间的平衡,引起永久的伤害。炎性细胞(巨噬细胞和嗜中性粒细胞)产生被称为弹性酶的蛋白水解酶,其破坏弹性蛋白,肺组织的重要组分。
肺的肺泡或气囊包含弹性组织,其支持和维持肺内气道的效能。肺泡壁的毁坏允许通过放松帮助保持气道开放的牵绳(guy rope)使小气道变窄。在正常吸气期间,膈向下移动同时胸腔(rib cage)向外移动,并且空气通过产生的负压吸入肺内。在呼气时,随着胸腔和膈放松,肺实质的弹性回位向上和向外推动空气。在肺实质破坏的情况下,其导致松软的肺和失去肺泡牵绳,发生小气道塌陷和空气积存,导致肺充气过度。充气过度使膈变平,其导致不太有效的收缩和减小的肺泡效率,其进而导致进一步的空气积存。所述机制随着时间导致重度气流阻塞,其导致不充分的允许肺在下一次吸气之前完全地放气的呼气。
3.5.3慢性哮喘
哮喘限定为气道的慢性炎性状况,其导致普遍的和广泛的气道阻塞,所述气道阻塞是自发地可逆或利用治疗可逆的。在患有慢性哮喘的一些患者中,特别是如果哮喘因为其还没有被诊断或者处置不当而未被治疗,或如果其特别严重,则该疾病进展,导致不可逆性气道阻塞。患有哮喘的儿童具有发展不可逆性哮喘的十分之一的几率,而成年型哮喘患者的风险是四分之一。研究也已经发现在儿童和成人中,如果它们的哮喘没有被适当地治疗,特别是使用皮质类固醇疗法,则该哮喘可能导致肺功能的不可逆的恶化。
哮喘中的气道炎症随着时间可以通过增加的平滑肌、表面上皮的破裂、增加的胶原沉积和基底膜的增厚导致气道的重构。
3.6其它类型的纤维化
其它类型的纤维化非限制性地包括胰腺和肺的囊性纤维化、注射纤维化(injection fibrosis)、心内膜心肌纤维化、纵隔纤维化、骨髓纤维化、腹膜后纤维化、和肾原性系统性纤维化。
囊性纤维化(CF、mucovidosis、粘液粘稠病(mucovisidosis))是遗传性常染色体隐形障碍。它是美国最常见的致死性遗传障碍之一,影响大约30,000名个体,并且在白种人群体中最流行,每3,300名新生儿中出现一例。涉及囊性纤维化的基因,在1989年被鉴定,编码称为囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)的蛋白质。CFTR正常地由遍及身体的外分泌上皮细胞表达,并且调节氯根离子、碳酸氢盐离子和谷胱甘肽进出细胞的运动。在囊性纤维化患者中,CFTR基因的突变导致CFTR蛋白功能的改变或完全失去,其导致外分泌分泌物的克分子渗透压浓度、pH和氧化还原性质的缺失。在肺中,CF自身通过存在堵塞气道的厚粘液分泌物显现。在其它外分泌器官比如汗腺中,CF自身可以不通过阻塞性表型显现,而是通过分泌物中异常的盐组成显现(因此临床汗液克分子渗透压浓度测试检测CF患者)。囊性纤维化患者疾病和死亡的主要原因是进行性肺病。阻塞气道通道的CF粘液的厚度被认为由分泌物的克分子渗透压浓度的异常,以及由存在大量源自炎性细胞的亚类称为嗜中性粒细胞的DNA、肌动蛋白、蛋白酶和促氧化酶(prooxidative enzyme)造成。实际上,CF肺病特征在于对病毒和细菌病原体二者的早期极度活跃的嗜中性粒细胞介导的炎性反应。CF肺的高炎性(hyperinflammatory)综合征具有多种基础在其中促炎趋化因子,主要是IL-8,和抗炎性细胞因子,主要是IL-10,之间的不平衡已经被报道起主要的作用。参见Chmiel等,Clin RevAllergyImmunol.3(1):5-27(2002)。研究已经报道了囊性纤维化患者的支气管肺泡灌洗液中的TNF-a、IL-6和IL-1β的水平比在健康对照支气管肺泡灌洗液中高(Bondfield,T.L.等Am.J.Resp.Crit.Care Med.152(1):2111-2118,1995)。
注射纤维化(IF)是肌肉内注射的并发症,其通常发生在婴儿和儿童的四头肌、三头肌和臀肌中,其中对象不能完全地弯曲受影响的肌肉。其通常是无痛的,但是是进展的。研究已经报道了糖蛋白骨桥蛋白(OPN)在组织重构中起作用(Liaw,L.等,J.Clin.Invest.101(7):1469-1478,1998),并且此促炎介质诱导人单核细胞中IL-1β上调和伴随增强的TNF-α和IL-6的产生(Naldini,A.等,J.Immunol.177:4267-4270,2006;Weber,G.F.和Cantor,H.Cytokine Growth Factor Reviews.7(3):241-248,1996)。
心内膜心肌病(嗜酸性细胞增多综合征(HS))是特征在于血液中持续升高的嗜酸性细胞计数(1500个嗜酸性细胞/mm3)的疾病过程。HS同时影响很多器官。研究已经报道了IL-1β、IL-6和TNF-α在病毒诱导的心肌炎患者中以高水平表达(Satoh,M.,等,VirchowsArchiv.427(5):503-509,1996)。症状可以包括心肌病、皮肤病变、血栓栓塞疾病、肺病、神经病、肝脾肿大(肝脏和脾脏同时增大)和减小的心室大小。治疗可以包括利用皮质类固醇减小嗜酸性细胞水平。
纵隔纤维化(MF)特征在于集中在淋巴结上的浸润性钙化纤维化,其封阻大脉管和气道。MF是组织胞浆菌病的晚期并发症。纤维化的鼠模型中的研究已经报道了IL-10和TNF-α显著地升高(Ebrahimi,B,等Am.J.Pathol.158:2117-2125,2001)。
骨髓纤维化(髓样化生、慢性特发性骨髓纤维化、原发性骨髓纤维化)是其中骨髓经历纤维化的骨髓的障碍。骨髓纤维化导致进行性骨髓衰竭。平均存活是五年,并且死因包括感染、出血、器官衰竭、门静脉高血压和白血病转化。已经报道了TNF-α和IL-6水平在病毒诱导的骨髓纤维化的动物模型中升高(Bousse-Kerdiles,M.,等Ann.Hematol.78:434-444,1999)。
腹膜后纤维化(奥蒙德病)是特征为腹膜后腔中的纤维组织增殖的疾病。腹膜后腔是包含肾、主动脉、肾道(renal tract)、和其它结构的身体隔室(body compartment)。已经报道了IL-1、IL-6和TNF-α在腹膜后纤维化的发病机理中具有关键作用(Demko,T.等,J.Am.Soc.Nephrol.8:684-688,1997)。腹膜后纤维化的症状可以包括但不限于:下背疼痛、肾衰竭、高血压和深静脉血栓形成。
肾原性系统性纤维化(NSF、肾原性纤维化皮肤病)涉及皮肤、关节、眼睛和内部器官的纤维化。NSF可能与暴露于钆相关联。患者发展出大面积的硬化皮肤并且具有纤维变性的结节和斑块。还可以出现伴随限制运动范围的屈曲挛缩。NSF显示了真皮成纤维细胞和树突细胞的增殖、增厚的胶原束、增加的弹性纤维和粘蛋白的沉积物。一些报道已经表明促炎状态提供了引起肾原性系统性纤维化的诱病因素(Saxena,S.等,Int.Urol.Nephrol.40:715-724,2008),并且TNF-α的水平在肾原性系统性纤维化的动物模型中升高(Steger-Hartmann,T.,等Exper.Tox.Pathol.61(6):537-552,2009)。
4.风险因子
4.1.主要风险因子
4.1.1.吸烟
虽然已经鉴定了纤维变性气道疾病的大量风险因子(其中的一些可能在它们的成因中起作用),烟草烟雾仍然是COPD的主要的和最重要的原因。吸的烟的数目越大,发展出纤维变性气道疾病的风险越大。发展出纤维变性气道疾病的压倒性多数的人是吸烟者,并且他们的肺功能比不吸烟者降低得更快。
最有效的干预是停止吸烟,优选地在早期阶段。戒烟的吸烟者将不会恢复失去的肺功能,但是减退速率可以回复至非吸烟者的减退速率。在早期阶段停止吸烟改善预后,而不管戒烟需要多少尝试。发展吸烟相关的纤维变性气道疾病的个体易感性不同。大约15%的吸烟者将发展出临床上显著的COPD,而大约50%将永远不发展出任何症状。肺功能的降低是逐步的,并且因为患者可以适应呼吸急促的症状,或可能未注意该症状,该疾病经常被延误诊断。研究已经显示取决于每天吸的香烟的数目,24-47%的吸烟者发展出气流阻塞。暴露于被动吸烟增加对该疾病的易感性。
4.1.2.α-1抗胰蛋白酶缺陷
此罕见的遗传状况导致肺中关键的抗蛋白酶保护系统之一的完全缺乏。其是影响1:4000的人口的隐形障碍。患有α-1抗胰蛋白酶缺陷的患者处于在早期年龄(20和40岁的年龄之间)发展出气肿的风险中,并且通常具有重度家族病史。患有该缺陷和气肿的患者从每个父母遗传一个异常基因;也就是说,父母是该基因的携带者。这样的父母将具有血液中正常水平一半的抗胰蛋白酶,其可以足够保护免于发展出气肿。同样地,α-1抗胰蛋白酶缺陷患者的全部儿童将携带一个异常基因,但是将不受影响。α-1抗胰蛋白酶缺陷的两种常见形式由编码α-1抗胰蛋白酶的基因中的点突变造成。
4.2.相关的风险因子
4.2.1.环境污染
存在有力的证据表明纤维变性气道疾病可以被空气污染恶化,但是当与吸烟相比时,污染在纤维变性气道疾病的病因中的作用很小。具有大量微粒物质、碳和二氧化硫的空气污染,其通过煤和石油化石燃料的燃烧产生,是纤维变性气道疾病的发展中重要的原因或辅因子。这些主要源自汽车废气排放,并且特别是归咎于光化学污染物比如臭氧。在发展中国家,特别是对女性而言,通风不良的家庭中来自燃烧用于烹饪和供暖的生物质燃料的室内空气污染可以是纤维变性气道疾病比如COPD的重要的风险因子。
4.2.2.职业因素
其中工作者暴露于煤、二氧化硅和阳离子的一些职业,比如矿工、纺织工人和水泥工,与纤维变性气道疾病的增加的风险相关联。自20世界50年代起,暴露于镉,一种重金属,和焊接烟气已经被认为是气肿的原因。
许多粉尘职业比暴露于气体或烟气更危险,并且与慢性支气管炎和多种形式的气道阻塞性疾病的发展相关联。船坞焊工和捻缝工以及在暴露于水泥粉尘的建筑业中工作的那些人也已知具有发展出纤维变性气道疾病的增加的风险。
4.2.3.儿童期呼吸感染
出生后第一年内的胸部感染,比如肺炎和细支气管炎,可以在以后的生活中易于发展出COPD。这可能是由于出生时直到早期成年期肺生长结束呼吸系统的不完全发育。如果发育中的肺被伤害,将不能达到最大的潜在肺功能,在早年产生COPD的症状。
4.3.其它风险因子
其它风险因子,其在成因中起作用和/或充当纤维变性气道疾病的早期症状,比如肺纤维组织形成,包括超敏感性肺炎(最通常由吸入被细菌、真菌或动物制品污染的粉尘造成)、一些典型的结缔组织疾病(比如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)和硬皮病)、涉及结缔组织(比如肉样瘤病和韦格纳肉芽肿病)的其它疾病、感染、某些药物(例如胺碘酮、博来霉素、白消安、甲氨蝶呤、和呋喃妥因)、和对胸部的放射疗法。
5.用于治疗纤维变性疾病或状况的当前的和新兴的治疗途径
当前正在用于治疗纤维变性疾病的治疗剂被公开在Datta等,British Journalof Pharmacology,163:141-172,2011中;其通过引用并入本文。这样的治疗剂的非限制性实例包括但不限于,纯化的牛V型胶原(例如,IW-001;ImmuneWorks;UnitedTherapeutics)、IL-13受体拮抗物(例如,QAX576;Novartis)、蛋白质酪氨酸激酶抑制剂(例如,伊马替尼(imatinib)Craig Daniels/Novartis)、内皮受体拮抗物(例如,ACT-064992(马西替坦(macitentan));Actelion)、双内皮素受体拮抗物(例如,波生坦Actelion)、前列环素类似物(吸入性伊洛前列素(例如,);Actelion)、抗CTGF单克隆抗体(例如,FG-3019)、内皮素受体拮抗物(A-选择性)(例如,安立生坦(ambrisentan)Gilead)、AB0024(Arresto)、赖氨酰氧化酶样2(LOXL2)单克隆抗体(例如,GS-6624(以前的AB0024);Gilead)、c-Jun N-末端激酶(JNK)抑制剂(例如,CC-930;Celgene)、吡非尼酮(例如,(InterMune),(Shionogi))、IFN-γ1b(例如,InterMune)、针对全部三种TGF-β同种型的全中和IgG4人抗体(例如,GC1008;Genzyme)、TGF-β活化抑制剂(例如,Stromedix(STX-100))、重组人正五聚蛋白-2蛋白(rhPTX-2)(例如,PRM151;Promedior)、双特异性IL4/IL13抗体(例如,SAR156597;Sanofi)、人源化单克隆抗体靶向整合蛋白αvβ6(BIBF 1120;Boehringer Ingelheim)、N-乙酰半胱氨酸(Zambon SpA)、西地那非TNF拮抗物(例如,依那西普(etanercept)Pfizer)、糖皮质激素(例如,强的松、布地奈德、莫米松糠酸酯、丙酸氟替卡松、和糠酸氟替卡松)、支气管扩张药(例如,白三烯改性剂(例如,孟鲁司特)、抗胆碱能支气管扩张药(例如,异丙托溴铵和噻托溴铵)、短效β2激动剂(例如,甲磺酸乙基异丙肾上腺素肾上腺素、舒喘灵/舒喘宁、和特布他林)、长效β2激动剂(例如,沙美特罗、福莫特罗、indecaterol)、和混合型支气管扩张药,其包括但不限于,(包含布地奈德和福莫特罗二者)、皮质类固醇(例如,强的松、布地奈德、莫米松糠酸酯)、甲基化黄嘌呤和其衍生物(例如,咖啡因、氨茶碱、IBMX、副黄嘌呤、己酮可可碱、可可碱、和茶碱)、嗜中性粒细胞弹性酶抑制剂(例如,ONO-5046、MR-889、L-694,458、CE-1037、GW-311616和TEI-8362,和过渡态抑制剂,比如ONO-6818、AE-3763、FK-706、ICI-200,880、ZD-0892和ZD-8321)、磷酸二酯酶抑制剂(例如,罗氟司特(roflumilast)和西洛司特(cilomilast)(SB-207499))。
5.1.激酶和磷酸化
激酶是催化从磷酸供体(通常是5'-三磷酸腺苷(ATP))至受体底物的磷酰基转移反应的一组普遍的酶。虽然全部激酶均催化大体上相同的磷酰基转移反应,但是它们在它们的底物特异性、结构、和它们参与其中的途径中展示出卓越的多样性。全部可获得的激酶序列(大约60,000个序列)的最近的分类指示激酶可以被分组为25个同源(意思是源自共同的祖先)蛋白家族。基于结构折叠的相似性,这些激酶家族被装配为12个折叠组。进一步,25个家族中的22个(大约98.8%的全部序列)属于结构折叠已知的10个折叠组。其它3个家族中,多磷酸激酶形成不同的折叠组,并且2个剩余的家族均是整合膜激酶并且包括最后一个折叠组。这些折叠组不仅包括最广泛地传播的蛋白质折叠中的一些,比如罗斯曼样折叠(通过两个α螺旋以拓扑顺序β-α-β-α-β连接的三个或更多个平行β链)、铁氧还蛋白样折叠(沿着其主链具有特征βαββαβ二级结构的常见的α+β蛋白质折叠)、TIM-桶折叠(barrel fold)(意思是由沿着肽主链交替的八个α螺旋和八个平行β链构成的保守型蛋白质折叠)、和反向平行β桶折叠(β桶是扭转和卷曲以形成其中第一条链氢键结合至最后一条链的闭合结构的大β片层),还包括蛋白质结构的全部主要类别(全部α、全部β、α+β、α/β)。在折叠组中,每个家族的核苷酸结合阈的核心具有相同的架构,并且蛋白质核心的拓扑学或者是相同的或者与循环交替变换相关。折叠组内的家族之间的同源性不被暗示。
I组(23,124个序列)激酶包含蛋白S/T-Y激酶、非典型蛋白激酶、脂质激酶、和ATP抓握酶(grasp enzyme)并且进一步包括包括蛋白S/T-Y激酶和非典型蛋白激酶家族(22,074个序列)。这些激酶包括:胆碱激酶(EC 2.7.1.32);蛋白激酶(EC 2.7.137);磷酸化酶激酶(EC 2.7.1.38);高丝氨酸激酶(EC 2.7.1.39);I-磷脂酰肌醇4-激酶(EC 2.7.1.67);链霉素6-激酶(EC 2.7.1.72);乙醇胺激酶(EC 2.7.1.82);链霉素3'-激酶(EC 2.7.1.87);卡那霉素激酶(EC 2.7.1.95);5-甲硫核糖激酶(EC 2.7.1.100);紫霉素激酶(EC2.7.1.103);[羟甲基戊二酰-CoA还原酶(NADPH2)]激酶(EC 2.7.1.109);蛋白质-酪氨酸激酶(EC 2.7.1.112);[异柠檬酸脱氢酶(NADP+)]激酶(EC 2.7.1.116);[肌球蛋白轻链]激酶(EC 2.7.1.117);潮霉素-B激酶(EC 2.7.1.119);钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(EC2.7.1.123);视紫红质激酶(EC 2.7.1.125);[β-肾上腺素能受体]激酶(EC 2.7.1.126);[肌球蛋白重链]激酶(EC 2.7.1.129);[Tau蛋白]激酶(EC 2.7.1.135);大环内脂2'-激酶(EC 2.7.1.136);I-磷脂酰肌醇3-激酶(EC 2.7.1.137);[RNA-聚合酶]-亚基激酶(EC2.7.1.141);磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶(EC 2.7.1.153);和磷脂酰肌醇-4-磷酸3-激酶(EC 2.7.1.154)。I组进一步包括脂质激酶家族(321个序列)。这些激酶包括:I-磷脂酰肌醇-4-磷酸5-激酶(EC 2.7.1.68);ID-肌-肌醇-三磷酸3-激酶(EC 2.7.1.127);肌醇-四磷酸5-激酶(EC 2.7.1.140);I-磷脂酰肌醇-5-磷酸4-激酶(EC 2.7.1.149);I-磷脂酰肌醇-3-磷酸5-激酶(EC 2.7.1.150);肌醇-多磷酸多激酶(EC 2.7.1.151);和肌醇-六磷酸激酶(EC 2.7.4.21)。I组进一步包括ATP-抓握激酶(729个序列),其包括肌醇-四磷酸I-激酶(EC2.7.1.134);丙酮酸、磷酸二激酶(EC 2.7.9.1);和丙酮酸、水二激酶(EC 2.7.9。2)。
II组(17,071个序列)激酶包含罗斯曼样激酶。II组包括P-环激酶家族(7,732个序列)。这些包括葡糖酸激酶(EC 2.7.1.12);磷酸核酮糖激酶(EC 2.7.1.19);胸苷激酶(EC2.7.1.21);核糖基烟酰胺激酶(EC 2.7.1.22);脱磷酸-CoA激酶(EC 2.7.1.24);腺苷酰硫酸激酶(EC 2.7.1.25);泛酸激酶(EC 2.7.1.33);蛋白激酶(细菌)(EC 2.7.1.37);尿苷激酶(EC 2.7.1.48);莽草酸激酶(EC 2.7.1.71);脱氧胞苷激酶(EC 2.7.1.74);脱氧腺苷激酶(EC 2.7.1.76);多核苷酸5'-羟基-激酶(EC 2.7.1.78);6-磷酸果糖-2-激酶(EC2.7.1.105);脱氧鸟苷激酶(EC 2.7.1.113);四酰基二糖4'-激酶(EC 2.7.1.130);脱氧核苷激酶(EC 2.7.1.145);腺苷钴啉醇酰胺激酶(EC 2.7.1.156);多磷酸激酶(EC 2.7.4.1);磷酸甲羟戊酸激酶(EC 2.7.4.2);腺苷酸激酶(EC 2.7.4.3);核苷-磷酸激酶(EC2.7.4.4);鸟苷酸激酶(EC 2.7.4.8);胸苷酸激酶(EC 2.7.4.9);核苷-三磷酸-腺苷酸激酶(EC 2.7.4.10);(脱氧)核苷-磷酸激酶(EC 2.7.4.13);胞苷酸激酶(EC 2.7.4.14);和尿苷酸激酶(EC 2.7.4.22)。II组进一步包括烯醇丙酮酸磷酸羧激酶家族(815个序列)。这些酶包括蛋白激酶(HPr激酶/磷酸酶)(EC 2.7.1.37);烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(GTP)(EC4.1.1.32);和烯醇丙酮酸磷酸羧激酶(ATP)(EC 4.1.1.49)。II组进一步包括磷酸甘油酸激酶(1,351个序列)家族。这些酶包括磷酸甘油酸激酶(EC 2.7.2.3)和磷酸甘油酸激酶(GTP)(EC 2.7.2.10)。II组进一步包括天冬氨酸激酶家族(2,171个序列)。这些酶包括氨基甲酸激酶(EC 2.7.2.2);天冬氨酸激酶(EC 2.7.2.4);乙酰谷氨酸激酶(EC 2.7.2.81);谷氨酸5-激酶(EC 2.7.2.1)和鸟苷酸激酶(EC 2.7.4.)。II组进一步包括磷酸果糖激酶样激酶家族(1,998个序列)。这些酶包括6-磷酸果糖激酶(EC 2.7.1.11);NAD(+)激酶(EC2.7.1.23);I-磷酸果糖激酶(EC 2.7.1.56);二磷酸-果糖-6-磷酸I-磷酸转移酶(EC2.7.1.90);鞘氨醇激酶(EC 2.7.1.91);二酰基甘油激酶(EC 2.7.1.107);和神经酰胺激酶(EC 2.7.1.138)。II组进一步包括核糖激酶样家族(2,722个序列)。这些酶包括:葡糖激酶(EC 2.7.1.2);己酮糖激酶(EC 2.7.1.3);果糖激酶(EC 2.7.1.4);6-磷酸果糖激酶(EC2.7.1.11);核糖激酶(EC 2.7.1.15);腺苷激酶(EC 2.7.1.20);吡哆醛激酶(EC2.7.1.35);2-脱氢-3-脱氧葡糖酸激酶(EC 2.7.1.45);羟甲基嘧啶激酶(EC 2.7.1.49);羟乙基噻唑激酶(EC 2.7.1.50);I-磷酸果糖激酶(EC 2.7.1.56);肌苷激酶(EC 2.7.1.73);5-脱氢-2-脱氧葡糖酸激酶(EC 2.7.1.92);塔格糖-6-磷酸激酶(EC 2.7.1.144);ADP依赖性磷酸果糖激酶(EC 2.7.1.146);ADP-依赖性果糖激酶(EC 2.7.1.147);和磷酸甲基嘧啶激酶(EC 2.7.4.7)。II组进一步包括硫胺素焦磷酸激酶家族(175个序列),其包括硫胺素焦磷酸激酶(EC 2.7.6.2)。II组进一步包括甘油酸激酶家族(107个序列),其包括甘油酸激酶(EC 2.7.1.31)。
III组激酶(10,973个序列)包括铁氧还蛋白样折叠激酶。III组进一步包括核苷-二磷酸激酶家族(923个序列)。这些酶包括核苷-二磷酸激酶(EC 2.7.4.6)。III组进一步包括HPPK激酶家族(609个序列)。这些酶包括2-氨基-4-羟基-6-羟甲基二氢喋啶焦磷酸激酶(EC 2.7.6.3)。III组进一步包括胍基激酶家族(324个序列)。这些酶包括胍乙酸激酶(EC2.7.3.1);肌酸激酶(EC 2.7.3.2);精氨酸激酶(EC 2.7.3.3);和吲哚磷脂激酶(EC2.7.3.5)。III组进一步包括组氨酸激酶家族(9,117个序列)。这些酶包括蛋白激酶(组氨酸激酶)(EC 2.7.1.37);[丙酮酸脱氢酶(硫辛酰胺)]激酶(EC 2.7.1.99);和[3-甲基-2-氧丁酸脱氢酶(硫辛酰胺)]激酶(EC 2.7.1.115)。
IV组激酶(2,768个序列)包含核糖核酸酶H样激酶。这些酶包括己糖激酶(EC2.7.1.1);葡糖激酶(EC 2.7.1.2);果糖激酶(EC 2.7.1.4);鼠李树胶糖激酶(EC2.7.1.5);甘露糖激酶(EC 2.7.1.7);葡糖酸激酶(EC 2.7.1.12);L-核酮糖激酶(EC2.7.1.16);木酮糖激酶(EC 2.7.1.17);赤藓糖醇激酶(EC 2.7.1.27);甘油激酶(EC2.7.1.30);泛酸激酶(EC 2.7.1.33);D-核酮糖激酶(EC 2.7.1.47);L-岩藻酮糖激酶(EC2.7.1.51);L-木酮糖激酶(EC 2.7.1.53);阿洛糖激酶(EC 2.7.1.55);2-脱氢-3-脱氧半乳糖酸激酶(EC 2.7.1.58);N-乙酰葡糖胺激酶(EC 2.7.1.59);N-乙酰甘露糖胺激酶(EC2.7.1.60);多磷酸-葡萄糖磷酸转移酶(EC 2.7.1.63);β-糖苷激酶(EC 2.7.1.85);乙酸激酶(EC 2.7.2.1);丁酸激酶(EC 2.7.2.7);支链脂肪酸激酶(EC 2.7.2.14);和丙酸激酶(EC2.7.2.15)。
V组激酶(1,119个序列)包含TIMβ桶激酶。这些酶包括丙酮酸激酶(EC 2.7.1.40)。
VI组激酶(885个序列)包含GHMP激酶。这些酶包括半乳糖激酶(EC 2.7.1.6);甲羟戊酸激酶(EC 2.7.1.36);高丝氨酸激酶(EC 2.7.1.39);L-阿拉伯糖激酶(EC 2.7.1.46);岩藻糖激酶(EC 2.7.1.52);莽草酸激酶(EC 2.7.1.71);4-(胞苷5'-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(EC 2.7.1.148);和磷酸甲羟戊酸激酶(EC 2.7.4.2)。
VII组激酶(1,843个序列)包含AIR合成酶样激酶。这些酶包括硫胺素-磷酸激酶(EC 2.7.4.16)和硒化物、水二激酶(EC 2.7.9.3)。
VIII组激酶(565个序列)包含核黄素激酶(565个序列)。这些酶包括核黄素激酶(EC 2.7.1.26)。
IX组激酶(197个序列)包含二羟基丙酮激酶。这些酶包括甘油酮激酶(EC2.7.1.29)。
X组激酶(148个序列)包含推定的甘油酸激酶。这些酶包括甘油酸激酶(EC2.7.1.31)。
XI组激酶(446个序列)包含多磷酸激酶。这些酶包括多磷酸激酶(EC 2.7.4.1)。
XII组激酶(263个序列)包含整合膜激酶。XII组包括多萜醇激酶家族。这些酶包括多萜醇激酶(EC 2.7.1.108)。XII组进一步包括十一萜醇激酶家族。这些酶包括十一萜醇激酶(EC 2.7.1.66)。
激酶在众多细胞代谢及信号传导途径中起必不可少的作用,并且它们属于在结构水平、生物化学水平和细胞水平方面研究最彻底的酶。尽管事实上所有激酶使用相同的磷酸供体(大部分情况下为ATP),并且表面上催化同样的磷酰基转移反应,但它们在其结构折叠和底物识别机制上展示出显著的多样性。这很可能主要是由于它们的底物的结构和性质极为多样化的特性。
5.1.1促分裂原活化蛋白激酶-活化蛋白激酶(MK2和MK3)
不同组的MAPK-活化蛋白激酶(MAP-KAPK)已经限定了促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的下游。这些酶将信号转导至不为MAPK的直接底物的靶蛋白,并且因此,用来利用MAPK级联将磷酸化依赖的信号传导转至多种细胞功能。这些组中的一个由三种MAPKAPK:MK2、MK3(又称为3pK)和MK5(还命名为PRAK)形成。促分裂原活化蛋白激酶-活化蛋白激酶2(也称作“MAPKAPK2”、“MAPKAP-K2”、“MK2”)是丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶家族的激酶。MK2与MK3高度同源(大约75%氨基酸同一性)。MK2和MK3的激酶结构域与钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaMK)、磷酸化酶b激酶和核糖体S6激酶(RSK)同种型的C-末端激酶结构域(CTKD)最相似(大约35%-40%同一性)。mk2基因编码两种可变剪接的370个氨基酸(MK2A)和400个氨基酸(MK2B)的转录物。mk3基因编码382个氨基酸的一种转录物。MK2蛋白和MK3蛋白高度同源,但MK2A具备较短的C-末端区。MK2B的C-末端包含较短的MK2A同种型中不存在的功能二分的核定位序列(NLS)(Lys-Lys-Xaa10-Lys-Arg-Arg-Lys-Lys;SEQ ID NO:23),其指示可变剪接决定MK2同种型的细胞定位。MK3具备相似的核定位序列。在MK2B和MK3二者中发现的核定位序列均包含D结构域(Leu-Leu-Lys-Arg-Arg-Lys-Lys;SEQ ID NO:24),研究已经显示其介导MK2B和MK3与p38α和p38β的特异性相互作用。MK2B和MK3还具备位于NLS和D结构域的N-末端的功能核输出信号(NES)。MK2B中的NES足以在刺激之后引发核输出,该过程可以被来普霉素(leptomycin)B抑制。MK2和MK3中的催化结构域的N-末端序列富含脯氨酸,并且包含一个(MK3)或两个(MK2)推定的Src同源3(SH3)结构域-结合位点,研究已经显示对于MK2其介导体外与c-Abl的SH3结构域的结合。最近的研究表明此结构域参与MK2介导的细胞迁移。
MK2B和MK3主要位于休眠细胞的细胞核中,而MK2A存在于细胞质中。MK2B和MK3二者均在应激刺激之后经由染色体区域维持蛋白(CRM1)依赖性机制迅速地输出至细胞质。MK2B的核输出似乎由激酶活化介导,因为激酶的活化环内Thr334的磷酸模拟突变(phosphomimetic mutation)提高了MK2B的细胞质定位。不受理论的束缚,认为MK2B和MK3可以包含组成型活性的NLS和磷酸化调节的NES。
MK2和MK3似乎广泛表达,主要在心、骨骼肌和肾组织中表达。
5.1.2.活化
p38α和p38β的多种活化剂有效地刺激MK2和MK3活性。p38在四个脯氨酸定向位点Thr25、Thr222、Ser272和Thr334上介导MK2的体外和体内磷酸化。在这些位点中,只有Thr25在MK3中是非保守的。不受理论的束缚,虽然不知道磷酸化的Thr25的功能,但是其在两个SH3结构域-结合位点之间的位置表明其可以调节蛋白质-蛋白质相互作用。MK2中的Thr222(MK3中的Thr201)位于激酶结构域的活化环中,并且已经显示对MK2和MK3激酶活性必不可少。MK2中的Thr334(MK3中的Thr313)位于催化结构域的C-末端,并且对激酶活性必不可少。已经解析了MK2的晶体结构并且,不受理论的束缚,表明Thr334磷酸化可以充当MK2核输入和输出的转换。Thr334的磷酸化还可以减弱或干扰MK2的C末端与催化结构域的结合,这暴露了NES并且促进核输出。
研究已经显示,虽然p38能够在细胞核中活化MK2和MK3,但是实验证据表明MK2和MK3的活化和核输出偶联磷酸化依赖性构象转换,其还支配p38稳定性和定位,并且p38自身的细胞定位受MK2并且可能受MK3控制。另外的研究已经显示,在MK2的磷酸化和活化之后,细胞核的p38以与MK2的复合物输出至细胞质。p38和MK2之间的相互作用对于p38稳定性可能是重要的,因为研究指示MK2缺陷型细胞中的p38水平低,并且无催化活性的MK2蛋白的表达恢复p38水平。
5.1.3.底物和功能
进一步的研究已经显示小的热休克蛋白HSP27(又称为热休克蛋白27或Hsp27)、淋巴细胞特异性蛋白LSP-I和波形蛋白被MK2磷酸化。HSPB1是特别感兴趣的,因为其形成大的寡聚物,其可以充当分子伴侣并且保护细胞免受热休克和氧化应激。在磷酸化之后,HSPB1失去其形成大的寡聚物的能力,并且不能够阻断肌动蛋白聚合,这表明MK2介导的HSPB1的磷酸化起内环境稳定功能,其目标在于调节否则将在应激期间不稳定的肌动蛋白动力学。
MK3也显示在体外和体内磷酸化HSPB1,但是还没有阐明其在应激条件期间的作用。MK2与MK3共享许多底物。两种酶具有相当的底物偏好,并且以相似的动力学常数磷酸化肽底物。发现被MK2高效磷酸化所需的最小序列是Hyd-Xaa-Arg-Xaa-Xaa-pSer/Thr(SEQ IDNO:25),其中Hyd是体积大的疏水残基。
实验证据支持p38在调节细胞因子生物合成和细胞迁移中的作用。定向缺失小鼠中的mk2基因表明,虽然p38介导许多相似激酶的活化,但是MK2似乎是负责这些p38依赖性生物过程的关键激酶。失去MK2导致(i)脂多糖(LPS)诱导的细胞因子比如肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素-6(IL-6)和γ干扰素(IFN-γ)合成中的缺陷,和(ii)改变小鼠胚胎胎成纤维细胞、平滑肌细胞和嗜中性粒细胞的迁移。
与MK2在炎性反应中的作用一致,MK2缺陷型小鼠显示对单核细胞增多性李斯特菌感染的增加的易感性,和局部缺血之后减少的炎症介导的神经元死亡。因为在MK2缺陷型细胞中p38蛋白水平也显著减小,辨别这些表型是否单独地由于失去MK2是必要的。为达到此目的,在MK2缺陷型细胞中表达MK2突变体,并且结果指示MK2催化活性对恢复p38水平不是必要的,但是为调节细胞因子生物合成所需。
MK2的敲除和敲低研究为以下提供了有力支持:活化的MK2通过与IL-6mRNA的富含AU的3’非翻译区相互作用的蛋白质的磷酸化来增强IL-6mRNA的稳定性。具体而言,已经显示MK2主要负责hnRNPA0(稳定IL-6RNA的mRNA-结合蛋白)的磷酸化。此外,研究多种炎性疾病的几项另外的研究已经发现促炎细胞因子比如IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-8的水平在来自患有稳定的慢性阻塞性肺病(COPD)的患者的诱导的痰中或吸烟者的肺泡巨噬细胞中增加(Keatings V.等,Am JResp Crit Care Med,1996,153:530-534;Lim,S.等,JRespir CritCare Med,2000,162:1355-1360)。促炎细胞因子比如白介素-8(IL-8)和白介素-6(IL-6)、以及相关的下游细胞粘附分子(CAM)比如细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)、基质金属蛋白酶比如基质金属蛋白酶-7(MMP-7)、和信号传导分子比如S100钙结合蛋白A12(S100A12,又称为钙粒蛋白C)在周围血中升高的水平已经发现与患有特发性肺纤维化的患者中的死亡率、无肺移植存活和疾病进展相关联(Richards等.,AmJRespir Crit Care Med,2012,185:67-76;Richards,T.等,Am J Respir Crit Care Med,181:A1120,2010;Moodley,Y.等,Am J Respir Cell Mol Biol.,29(4):490-498,2003)。总之,这些研究暗示通过MK2活化诱导的升高水平的炎性细胞因子可以参与气道或肺组织疾病的发病机理;并且表明了其用于治疗气道或肺组织疾病比如特发性肺纤维化和慢性阻塞性肺病(COPD)的抗细胞因子疗法的可能性(Chung,K.,Eur RespirJ,2001,18:Suppl.34:50-59)。
5.1.4.mRNA翻译的调节
使用MK2基因敲除小鼠或MK2缺陷型细胞的先前的研究已经显示,MK2通过增加其mRNA的翻译速率来增加炎性细胞因子包括TNF-α、IL-1和IL-6的产生。在MK2缺陷型小鼠中不能检测到TNF-α转录、加工和释放的显著减少。已知p38途径在调节mRNA稳定性中起重要作用,并且MK2代表可能的靶标,p38通过其介导此功能。利用MK2缺陷型小鼠的研究指示,MK2的催化活性对其在细胞因子产生和迁移中的作用是必需的,这表明,不受理论的束缚,MK2磷酸化mRNA稳定性中涉及的靶标。与此一致,MK2已经显示结合和/或磷酸化核内不均一核糖核蛋白(hnRNP)A0、锌指蛋白36(tristetraprolin)、聚(A)-结合蛋白PABP1和HuR(广泛表达的RNA结合蛋白的elav(黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中的胚胎致性异常视觉)家族的成员)。已知这些底物与在3’非翻译区富含AU元件的mRNA结合或共纯化,这表明MK2可以调节富含AU的mRNA比如TNF-α的稳定性。当前不知道MK3是否起相似的作用,但是MK2缺陷成纤维细胞的LPS处理完全地废除了hnRNP AO磷酸化,这表明MK3不能够补偿MK2的失去。
MK3与MK2一起参与真核生物延伸因子2(eEF2)激酶的磷酸化。eEF2激酶磷酸化和钝化eEF2。eEF2活性对mRNA在翻译期间的延伸很关键,并且eEF2在Thr56上的磷酸化导致mRNA翻译的终止。eEF2激酶在Ser377上的MK2和MK3磷酸化表明这些酶可以调节eEF2激酶活性,并且从而调节mRNA翻译延伸。
5.1.5.通过MK2和MK3的转录调节
与许多MK相似,细胞核的MK2有助于cAMP应答元件结合(CREB)蛋白、血清应答因子(SRF)和转录因子ER81的磷酸化。野生型和MK2缺陷型细胞的比较揭示了MK2是应激诱导的主要SRF激酶,这表明MK2在应激介导的立即早期应答中的作用。MK2和MK3二者均在体内与碱性螺旋-环-螺旋转录因子E47相互作用,并且在体外磷酸化E47。发现MK2介导的E47的磷酸化抑制E47的转录活性,并且从而抑制E47依赖性基因表达,这表明MK2和MK3可以调节组织特异性基因表达和细胞分化。
5.1.6.MK2和MK3的其它靶标
还已经鉴别了多种其它MK2和MK3底物,其反映了MK2和MK3在多钟生物过程中的多样功能。支架蛋白14-3-3ζ是生理性MK2底物。研究指示14-3-3ζ与大量细胞信号转导途径的组分相互作用,包括蛋白激酶、磷酸酶和转录因子。另外的研究已经显示,MK2介导的14-3-3ζ在Ser58上的磷酸化危害其结合活性,这表明MK2可以影响通常由14-3-3ζ调节的多种信号转导分子的调节。
另外的研究已经显示,MK2也与7元Arp2和Arp3复合物的p16亚基(p16-Arc)相互作用并使其在Ser77上磷酸化。p16-Arc在调节肌动蛋白细胞骨架中起作用,这表明MK2可能参与此过程。
MK2和MK3还可以磷酸化5-脂加氧酶。5-脂加氧酶催化炎性介质白细胞三烯的形成中的初始步骤。酪氨酸羟化酶、糖原合酶和Akt也显示被MK2磷酸化。最后,MK2在Ser1210上磷酸化肿瘤抑制蛋白马铃薯球蛋白,其形成14-3-3ζ的停靠位点。马铃薯球蛋白和错构瘤蛋白通常形成功能复合物,其通过拮抗mTOR依赖性信号传导负调节细胞生长,这表明p38-介导的MK2的活化可以通过增加14-3-3ζ与马铃薯球蛋白的结合来调节细胞生长。
5.2.激酶抑制
真核生物蛋白激酶构成借助其催化结构域而相关的最大的同源蛋白超家族之一。最相关的蛋白激酶特异性针对丝氨酸/苏氨酸或酪氨酸磷酸化。蛋白激酶在细胞对细胞外刺激物的应答中起不可或缺的作用。因而,认为蛋白激酶的刺激是信号转导系统中最常见的活化机制之一。已知许多底物通过多种蛋白激酶经历磷酸化,并且已经公布了关于多种蛋白激酶的催化结构域的一级序列的相当量的信息。这些序列共享参与ATP结合、催化和结构完整性的维持的大数目残基。大部分蛋白激酶具备很保守的30-32kDa催化结构域。
研究已经试图鉴定和利用蛋白激酶的调节元件。这些调节元件包括抑制剂、抗体和封闭肽。
5.2.1.抑制剂
酶抑制剂是与酶结合从而降低酶活性的分子。结合抑制剂可以阻止底物进入酶的活性位点和/或妨碍酶催化其反应。抑制剂结合是可逆或不可逆的。不可逆的抑制剂通常与酶作用并且在使其化学地改变(例如,通过修饰酶活性必需的关键氨基酸残基),使得其不再能够催化其反应。与此相反,可逆的抑制剂非共价地结合,并且取决于这些抑制剂是否结合酶、酶-底物复合物或二者,产生不同的抑制类型。
酶抑制剂通常通过其特异性和效价来评估。如在此环境中使用的,术语“特异性”指的是抑制剂与其它蛋白质的选择性附着或其没有结合至其它蛋白质。如本文使用的,术语“效价”指的是抑制剂的解离常数,其指示抑制酶所需的抑制剂的浓度。
已经研究了用作蛋白激酶活性调节中的工具的蛋白激酶的抑制剂。已经研究了将抑制剂用于,例如,细胞周期蛋白依赖性(Cdk)激酶、MAP激酶、丝氨酸/苏氨酸激酶、Src家族蛋白酪氨酸激酶、酪氨酸激酶、钙调蛋白(CaM)激酶、酪蛋白激酶、限制点激酶(Chk1)、糖原合酶激酶3(GSK-3)、c-Jun N-末端激酶(JNK)、促分裂原活化蛋白激酶1(MEK)、肌球蛋白轻链激酶(MLCK)、蛋白激酶A、Akt(蛋白激酶B)、蛋白激酶C、蛋白激酶G、蛋白质酪氨酸激酶、Raf激酶和Rho激酶。
5.2.2.封闭肽
肽为由两个或更多个氨基酸的链组成的化合物,由此链中的一个氨基酸的羧基经由肽键连接至另一个氨基酸的氨基连接。肽已经尤其用于研究蛋白质结构和功能。合成肽尤其可以用作探针以查看在哪里发生蛋白质-肽相互作用。抑制性肽尤其可以用于临床研究以检查肽对蛋白激酶、癌蛋白和其它障碍的抑制作用。
已经研究了多种封闭肽的用途。例如,细胞外信号调节激酶(ERK),一种MAPK蛋白激酶,对细胞增殖和分化必不可少。MAPK的活化需要级联机制,由此MAPK被上游MAPKK(MEK)磷酸化,其然后转而被第三激酶MAPKKK(MEKK)磷酸化。ERK抑制肽通过与ERK结合起MEK诱铒的作用。
其它封闭肽包括autocamtide-2相关抑制肽(AIP)。此合成肽具有高度特异性,是Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)的有效抑制剂。AIP是autocamtide-2的不可磷酸化的类似物,CaMKII的高选择性肽底物。AIP以100nM的IC50(IC50是获得50%抑制所需的抑制剂的浓度)抑制CaMKII。AIP抑制关于syntide-2(CaMKII肽底物)和ATP是非竞争性的,但是关于autocamtide-2是竞争性的。抑制不受是否存在Ca2+/钙调蛋白影响。CaMKII活性完全被AIP(1μM)抑制,而PKA、PKC和CaMKIV不受影响。
其它封闭肽包括细胞分裂蛋白激酶5(Cdk5)抑制肽(CIP)。Cdk5当与p25缔合时,磷酸化阿尔茨海默病特异性磷酸化表位处的微管蛋白tau。p25是截短的活化剂,其在暴露于淀粉状蛋白β肽之后,由生理性Cdk5活化剂p35产生。在神经元感染CIP之后,CIP选择性地抑制p25/Cdk5活性,并抑制皮层神经元中异常的tau磷酸化。由CIP展现的特异性的原因尚未完全地理解。
已经研究了下列另外的封闭肽:细胞外调节激酶2(ERK2)、ERK3、p38/HOG1、蛋白激酶C、酪蛋白激酶II、Ca2+/钙调蛋白激酶IV、酪蛋白激酶II、Cdk4、Cdk5、DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK)、丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶PAK3、磷酸肌醇(PI)-3激酶、PI-5激酶、PSTAIRE(cdk高度保守序列)、核糖体S6激酶、GSK-4、生发中心激酶(GCK)、SAPK(应激活化蛋白激酶)、SEK1(应激信号传导激酶)、和粘着斑激酶(FAK)。
5.3.细胞穿透肽(CPP)
细胞穿透肽(CPP)是能够穿透哺乳动物细胞的质膜并且跨越膜传输许多类型和分子量的复合物的一类肽。这些复合物包括效应分子,比如蛋白质、DNA、缀合肽(conjugatedpeptide)、寡核苷酸,和小颗粒比如脂质体。当CPP化学地连接或融合至其它蛋白质时,得到的融合蛋白仍能够进入细胞。虽然转导的准确机制是未知的,但是这些蛋白质的内化不认为是受体介导或转运体介导的。CPP的长度通常是10-16个氨基酸,并且可以根据其组成分组,比如,例如,富含精氨酸和/或赖氨酸的肽。
能够将效应分子传输入细胞的CPP的用途在药物的设计中越来越有吸引力,因为其促进细胞摄取货物分子。这些通常取决于其序列分类为两亲性(意思是具有极性及非极性端二者)或阳离子(意思是或涉及包含净正电荷原子)的细胞穿透肽,其为大分子提供非侵入性递送技术。CPP通常被称为“特洛伊肽(Trojan peptide)”、“膜易位序列”、“蛋白转导结构域(PTD)”或“细胞穿透性蛋白(CPP)”。CPP也可以用于帮助新型HSPB1激酶抑制剂穿透细胞膜(参见:2008年1月10提交的标题为“Polypeptic Inhibitors of HSPB1 Kinase andUses Thereof”的美国专利申请序号11/972,459;和2008年8月7日提交的标题为“KinaseInhibitors and Uses Thereof”的美国专利申请序号12/188,109,每个申请的内容通过引用以其全部并入)。
5.3.1.含有病毒CPP的蛋白质
描述为具有转导性质的第一蛋白质是病毒来源的。这些蛋白质仍为用于CPP作用的最普遍认可的模型。在细胞穿透肽之中,已经最广泛地研究了富含精氨酸的细胞穿透肽,包括但不限于TAT肽(El-Sayed,A.等,AAPS J.11,13-22,2009;Wender,P.等,Adv.DrugDeliv.Rev.60,452-472,2008)。
TAT(HIV-1反式激活蛋白基因产物)是86个氨基酸的多肽,其充当整合的HIV-1基因组的强大的转录因子。TAT在潜伏感染的细胞中对病毒基因组作用刺激病毒复制。TAT蛋白的易位性质使得其能够活化休眠的感染细胞,并且其可以通过调节包括细胞因子的许多细胞基因来参与引发未感染细胞的随后感染。TAT的最小CPP是9个氨基酸的蛋白质序列RKKRRQRRR(TAT49-57;SEQ ID NO:20)。利用较长的TAT片段的研究成功地证明了大至120kDa的融合蛋白的转导。已经证明多种TAT-CPP的添加以及合成的TAT衍生物介导膜易位。含有TAT CPP的融合蛋白已经在涉及癌症、传输死亡-蛋白质进入细胞、和神经变性障碍的疾病模型的实验中用作治疗部分。
VP22是HSV-1被膜蛋白(tegument protein),HSV病毒粒子的结构部分。VP22能够不依赖于受体易位,并且在细胞核中积聚。VP22的此性质将该蛋白质归类为含有CPP的肽。包含全长VP22的融合蛋白已经有效跨越质膜易位。
5.3.2.具有细胞间易位性质的同源异型蛋白
同源异型蛋白是参与形态学过程的高度保守的反式激活转录因子。它们通过60个氨基酸的特异序列结合至DNA。DNA-结合同源域是同源异型蛋白的最高度保守的序列。已经描述了多种同源异型蛋白展现CPP样活性;它们能够以不具有细胞类型特异性的不依赖于能量且不依赖于胞吞作用的方式有效地跨越细胞膜易位。
触角蛋白(Antp)是能够跨越细胞膜易位的反式激活因子;能够易位的最小序列是16个氨基酸的肽,其对应于蛋白质的同源域(HD)的第三个螺旋。此螺旋的内化在4℃发生,这表明此过程不依赖于胞吞作用。作为具有AntpHD的融合蛋白产生的多至100个氨基酸的肽穿透细胞膜。
能够易位的其它同源域包括果蝇ftz(Ftz)和果蝇en(En)同源域。许多同源域共享高度保守的第三螺旋。
5.3.3.人CPP
人CPP在引入人患者之后可以绕过可能的免疫原性问题。具有CPP序列的肽包括:Hoxa-5、Hox-A4、Hox-B5、Hox-B6、Hox-B7、HOX-D3、GAX、MOX-2和FtzCPP。这些蛋白质均共享在AntpCPP中发现的序列。其它CPP包括胰岛-1、白介素-1、肿瘤坏死因子、和来自卡波西-成纤维细胞生长因子(或FGF-4)信号肽的疏水序列,其能够不依赖于能量、受体和胞吞作用易位。未确定的CPP包括成纤维细胞生长因子(FGF)家族的成员。
6.MK2抑制剂和纤维变性疾病或状况的治疗
促分裂原活化蛋白激酶活化蛋白激酶2(MAPKAPK2或MK2),p38MAPK下游的丝氨酸/苏氨酸激酶底物,已经暗示在通过结疤和纤维化并发的许多炎性疾病中(Lopes,L.等,Biochem Biophys Res Commun.,382(3):535-9,2009)。这些包括但不限于癌症、内膜增生、器官纤维化、腹腔粘连、炎性肠道疾病、和类风湿性关节炎。除特发性肺纤维化(IPF)之外,涉及炎症和纤维化并且影响肺的其它障碍包括急性肺损伤(ALI)、器官移植排斥(肺移植也是IPF的后期治疗)、继发于脓毒症的器官衰竭、急性肺衰竭、自身免疫性疾病比如硬皮病、和慢性阻塞性肺病(COPD)。
纤维化的发展已知需要导致成肌纤维细胞表型的细胞的成纤维细胞的炎症、增殖和募集(Horowitz J.等,Semin Respir Crit Care Med.,27(6):600-612,2006)。已经显示MK2在转录和转录后水平上控制基因表达(Neininger A.等,J Biol Chem.2002;277(5):3065-8,Thomas T.等,J Neurochem.,105(5):2039-52,2008;Johansen C.等,J Immunol.,176(3):1431-8,2006;Rousseau S.等,EMBO J.21(23):6505-14,2002)以及细胞骨架架构(Lopes,L.等,Biochem Biophys Res Commun.,382(3):535-9,2009)。此外,已经显示活化的MK2增加炎性细胞因子mRNA的翻译和稳定性,并且引起肌动蛋白重组;并且MK2的抑制与减少的炎症(Ward,B.等,J Surg Res.,169(1):e27-36,2011)和成肌纤维细胞分化(Lopes,L.等,Biochem Biophys Res Commun.,382(3):535-9,2009)相关联。
总之,这些数据表明MK2的抑制可以向患有纤维变性障碍或状况,例如,特发性肺纤维化(IPF)、急性肺损伤(ALI)和移植排斥,的患者提供治疗益处。在这点上,所述发明提供了使用MK2的细胞穿透性肽基抑制剂干预炎症和纤维化的过程的方法。
发明内容
根据一方面,所述发明提供了在肺移植后减弱肺同种异体移植机能障碍的方法,包括施用含有抗体组分和MK2抑制剂(MK2i)组分的组合物;所述抗体组分包含治疗量的抗CD44抗体;所述MK2抑制剂(MK2i)组分包含治疗量的氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的MK2抑制剂(MK2i)多肽、或在功能上等价于其治疗结构域的选自氨基酸序列KALARQLAVA(SEQ ID NO:8)的多肽、氨基酸序列KALARQLGVA(SEQ ID NO:9)的多肽和氨基酸序列KALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的多肽中的至少一个多肽,或其功能等价物,和药学上可接受的载体;其中组合物对协同地减少肺同种异体移植机能障碍的至少一种病理是有效的。根据一个实施方式,肺同种异体移植机能障碍特征在于与促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)在正常健康对照对象的组织中的活性相比,促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)在组织中的异常活性。根据另一个实施方式,肺同种异体移植机能障碍是原发性移植机能障碍。根据另一个实施方式,肺同种异体移植机能障碍是慢性肺同种异体移植机能障碍。根据另一个实施方式,全身施用组合物的抗CD44抗体组分。根据另一个实施方式,全身施用或通过吸入施用MK2i组分。根据另一个实施方式,同种异体移植机能障碍特征在于炎症。根据另一个实施方式,当与对照相比时,组合物对(i)调节TGFβ、CCL2、透明质酸和MMP9中的至少一个;(ii)降低TNFα、IL6或其组合的血浆水平;(iii)减弱α-平滑肌肌动蛋白的表达;(iiv)阻止TGFβ诱导的成肌纤维细胞活化;(v)抑制成纤维细胞浸润;或其组合是有效的。根据另一个实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物具有氨基酸序列FAKLAARLYRKALARQLGVAA(SEQ ID NO:3)。根据另一个实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物具有氨基酸序列KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA(SEQ ID NO:4)。根据另一个实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物是氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLAVA(SEQ ID NO:5)。根据另一个实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物是氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVA(SEQ ID NO:6)。根据另一个实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物是氨基酸序列HRRIKAWLKKIKALARQLGVAA(SEQ ID NO:7)。根据另一个实施方式,载体选自控释载体、延释载体、缓释载体、和长期释放载体。根据另一个实施方式,药物组合物的MK2i组分是干粉的形式。根据另一个实施方式,干粉包括具有1至5微米的质量中值空气动力学直径(MMAD)的微粒。根据另一个实施方式,治疗量的药物组合物的MK2i组分的施用经由吸入装置。根据另一个实施方式,吸入装置是喷雾器。根据另一个实施方式,吸入装置是定量(metered-dose)吸入器(MDI)。根据另一个实施方式,吸入装置是干粉吸入器(DPI)。根据另一个实施方式,吸入装置是干粉喷雾器。
根据另一方面,所述发明提供了用于治疗重度肺纤维化的方法,所述重度肺纤维化特征在于对象的组织中异常的成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积,所述方法包括:施用含有抗体组分和MK2抑制剂组分的药物组合物至对象;所述抗体组分包含治疗量的抗CD44抗体;所述MK2抑制剂组分包含治疗量的氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的MK2抑制剂(MK2i)多肽、或在功能上等价于其治疗结构域的选自氨基酸序列KALARQLAVA(SEQ ID NO:8)的多肽、氨基酸序列KALARQLGVA(SEQ ID NO:9)的多肽和氨基酸序列KALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的多肽中的至少一个多肽、或其功能等价物、和药学上可接受的载体;其中组合物对协同地减少对象的组织中的成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积是有效的。根据一个实施方式,重度肺纤维化是特发性肺纤维化。根据另一个实施方式,重度肺纤维化由施用博来霉素造成。根据另一个实施方式,重度肺纤维化进一步特征在于组织中的炎症。根据另一个实施方式,炎症由选自肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和白介素-1β(IL-1β)的至少一种细胞因子介导。根据另一个实施方式,组织中异常的成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积特征在于与促分裂原活化蛋白激酶-活化蛋白激酶2(MK2)在正常健康对照对象的组织中的活性相比,促分裂原活化蛋白激酶-活化蛋白激酶2(MK2)在组织中的异常活性。根据另一个实施方式,重度肺纤维化特征在于与正常健康对照对象相比选自以下的至少一种病理:肺间质中细胞外基质蛋白的异常沉积、肺中成纤维细胞增殖的异常促进、成肌纤维细胞分化的异常诱导、和成肌纤维细胞附着至细胞外基质的异常促进。根据另一个实施方式,全身施用组合物的抗CD44抗体组分。根据另一个实施方式,全身施用或通过吸入施用MK2i组分。根据另一个实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQID NO:1)的功能等价物是氨基酸序列FAKLAARLYRKALARQLGVAA(SEQ ID NO:3)。根据另一个实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物是氨基酸序列KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA(SEQ ID NO:4)。根据另一个实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物是氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLAVA(SEQ ID NO:5)。根据另一个实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物是氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVA(SEQ ID NO:6)。根据另一个实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物是氨基酸序列HRRIKAWLKKIKALARQLGVAA(SEQ ID NO:7)。根据另一个实施方式,载体选自控释载体、延释载体、缓释载体、和长期释放载体。根据另一个实施方式,药物组合物的MK2i组分是干粉的形式。根据另一个实施方式,干粉包括具有1至5微米的质量中值空气动力学直径(MMAD)的微粒。根据另一个实施方式,治疗量的药物组合物的MK2i组分的施用经由吸入装置。根据另一个实施方式,吸入装置是喷雾器。根据另一个实施方式,吸入装置是定量吸入器(MDI)。根据另一个实施方式,吸入装置是干粉吸入器(DPI)。根据另一个实施方式,吸入装置是干粉喷雾器。
附图说明
图1显示了纯喷雾干燥胰岛素的递送性能。
图2显示了喷雾干燥胰岛素的颗粒大小分布,其通过安德森多级撞击(AndersonCascade Impaction)(ACI)测定。
图3显示了微剂量干粉吸入器(DPI)对两种市售的“被动(passive)”干粉吸入器(DPI)的效率和流量比较。
图4显示了喷雾干燥纯肽的流量独立性。
图5显示了喷雾干燥肽(非胰岛素)的代表性显微照片。
图6显示了喷雾干燥肽(非胰岛素)的颗粒大小分布。
图7显示了微粉化/乳糖掺和物组合的颗粒大小分布,其通过下一代撞击器(NextGeneration Impactor)(NGI)测定。
图8显示了微粉化小分子(长效蕈毒碱剂(LAMA)/乳糖掺和物)的递送性能。
图9显示了石蜡包埋的人特发性肺纤维化IPF肺的免疫组织化学分析,其显示了活化的MK2(即,磷酸化-Thr334-MAPKAPK2)在成纤维细胞病灶处的核定位。正常肺(左小图);IPF肺组织活检切片(右小图)。插图显示了衬在具有活化的MK2的细胞染色阳性(暗灰色)的病灶处的上皮破裂。图9中显示的缩写如下:NL(具有具有肺泡囊的正常肺架构);AW(气道);FF(来自患有IPF的肺组织外植体的成纤维细胞病灶)。
图10显示了测试化合物抑制肺纤维化的博来霉素小鼠模型(特发性肺纤维化(IPF)预防模型)中的纤维化发展的能力的示意图。从博来霉素递送后的第7天开始,当炎症消退和纤维变性机制激活时,经由喷雾或向腹腔内每天施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)或MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)),直到博来霉素递送后的第21天,当观察到显著的纤维化时。
图11显示了吸入疗法和全身施用MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ IDNO:1)防范小鼠中的博来霉素诱导的肺纤维化。上小图:第21天的代表性小鼠肺组织的苏木精和伊红(H&E)染色。下小图:马逊蓝色三色染色的相同视野揭示了具有博来霉素损伤的大量胶原沉积(箭头)。缩写:AW:气道;NL:正常肺架构;FF:纤维变性病灶;V:静脉。
图12显示了MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)预防由博来霉素损伤引起的显著的胶原沉积。值代表平均值±SEM。n=5只动物/组。‘*’p<0.05;‘**’p<0.01;‘***’p<0.001。胶原指数=胶原的常量因子7.5×羟脯氨酸浓度。
图13显示了MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)以剂量依赖方式预防由博来霉素损伤引起的纤维化。马逊蓝色三色染色博来霉素小鼠的肺切片。(A)MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1);(B)MMI-0200(YARAAARQARAKALNRQLGVA;SEQ ID NO:19)。
图14显示了全身施用的MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)废除由博来霉素损伤引起的系统性T细胞活化。值代表平均值±SEM。‘p’值<0.01。n=4只动物/组。图14中显示的缩写如下:(i)利用PBS(PBS)治疗的野生型小鼠;(ii)利用PBS(BLEO)治疗的博来霉素小鼠;(iii)利用喷雾的MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1))(BLEO+MMI-0100(NEB))治疗的博来霉素小鼠;和(iv)利用腹腔内的MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1))(BLEO+MMI-0100(IP))治疗的博来霉素小鼠。
图15显示了测试MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)废除特发性肺纤维化的博来霉素模型(IPF治疗模型)中的纤维化进展的能力的示意图。在博来霉素递送后的第14天开始,以50μg/kg每天的剂量经由喷雾或向腹腔内PBS或MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)),直到博来霉素递送后的第28天。
图16显示了MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)的全身(IP)或喷雾(NEB)施用改善小鼠中博来霉素诱导的肺纤维化。上小图:苏木精和伊红(H&E)染色。下小图:相同视野的马逊蓝色三色染色。图16中显示的缩写如下:PBS(利用PBS治疗的野生型小鼠);BLEO(利用PBS治疗的博来霉素小鼠);MMI-0100(NEB)(利用喷雾的MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1))治疗的博来霉素小鼠);MMI-0100(IP)(利用腹腔内的MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1))治疗的博来霉素小鼠);NL(具有肺泡囊的正常肺架构);AW(气道);FF(来自患有IPF的肺组织外植体的成纤维细胞病灶)。
图17显示了MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1))停滞由博来霉素损伤引起的显著的胶原沉积。图17中显示的缩写如下:PBS(利用PBS治疗的野生型小鼠);BLEO(利用PBS治疗的博来霉素小鼠);BLEO+MMI-0100(NEB)(利用喷雾的MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1))治疗的博来霉素小鼠);BLEO+MMI-0100(IP)(利用腹腔内的MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1))治疗的博来霉素小鼠)。值代表平均值±SEM。n=5只动物/组。胶原指数=胶原的常量因子7.5×羟脯氨酸浓度。
图18显示了肺切片(博来霉素损伤后第28天)的抗磷酸化-Thr334-MAPKAPK2(MK2的活化形式)染色的代表性显微照片,所述肺切片来自(i)利用PBS(PBS)治疗的博来霉素小鼠;(ii)利用PBS(BLEO)治疗的博来霉素小鼠;(iii)利用喷雾的MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1))(BLEO+MMI-0100(NEB))治疗的博来霉素小鼠;和(iv)利用腹腔内的MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1))(BLEO+MMI-0100(IP))治疗的博来霉素小鼠。C57-BL/6小鼠在第0天遭受博来霉素损伤。在第14天,小鼠通过腹腔内(IP)注射或喷雾器(NEB)每天施用50μg/kg的MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1),直到博来霉素损伤后的第28天。原始放大倍数:20×。
图19显示了涉及TGF-β介导的炎性和纤维变性途径的关键信号传导分子。
图20显示了在最后施用 24小时后,MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ IDNO:1)下调特发性肺纤维化的博来霉素小鼠模型(治疗模型)中循环炎性细胞因子的水平。
图21显示了MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)抑制特发性肺纤维化治疗模型中的成肌纤维细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)活化。C57-BL/6小鼠在第0天遭受博来霉素损伤。在第14天到第28天,小鼠通过腹腔内(IP)注射或喷雾器(NEB)施用50μg/kg/日的MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)。福尔马林固定的肺组织切片针对α-SMA免疫染色。利用生物素化二次IgG抗体进行对照染色。链亲和素缀合的辣根过氧化物酶与3,3’-二氨基联苯胺一起用作底物,并且利用苏木精复染细胞核。原始放大倍数:20×。
图22显示了正常人胚胎肺成纤维细胞(IMR-90)中通过MK2肽抑制剂的TGF-β诱导的成肌纤维细胞活化的调节。利用MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)或MMI-0200(YARAAARQARAKALNRQLGVA;SEQ ID NO:19)以规定剂量预治疗IMR-90细胞持续1h,并且然后在存在或不存在TGF-β1(2ng/ml)的情况下培养48h。细胞裂解产物针对α-SMA(成肌纤维细胞活化的标志物)和GAPDH(加样对照)的抗体进行免疫印迹。
图23显示了人胚胎肺成纤维细胞(IMR-90)中TGF-β介导的纤连蛋白质表达的调节。利用MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)或MMI-0200(YARAAARQARAKALNRQLGVA;SEQ ID NO:19)以规定剂量预治疗IMR-90细胞持续1h,并且然后在存在或不存在TGF-β1(2ng/ml)的情况下培养72h。纤连蛋白被测量为条件培养基中的分泌片段。来自条件培养基的等量(14μg)的总蛋白被加样在每个泳道中。
图24显示了涉及通过α5β1-整合蛋白介导的PDGFR-β的活化由纤连蛋白调节间充质干细胞迁移的关键信号传导分子(Veevers-Lowe J等.,J Cell Sci,124:1288-1300,2011)。
图25显示了由IPF患者活化的MK2激酶水平的增加。(A)正常和IPF组织中磷酸化-Thr334水平的定量分析;(B)肺功能和MK2活化之间的关联。
图26显示了肺移植(LT)后前24hr中测量的升高的支气管肺泡灌洗液(BALF)透明质酸(HA)浓度与长期移植后原发性移植机能障碍(PGD)相关联。
图27显示了CD44染色:A)支气管上皮和浸润性单核细胞,B)肺泡巨噬细胞(AM)和肺泡上皮,和C)成纤维细胞。
图28显示了原发性移植机能障碍(PGD)活组织检查,其证明来自A)支气管上皮细胞、浸润性单核细胞,和B)肺泡巨噬细胞(AM)的TGF-β表达。来自C)支气管上皮细胞和浸润性单核细胞,D)成纤维细胞,和E)肺泡巨噬细胞(AM)的TGF-βR1表达。
图29显示了原发性移植机能障碍(PGD)活组织检查,其证明:来自A)支气管上皮和浸润性单核细胞,B)AM和2型肺细胞;C)受体,由围绕气道和在间质(其中发展的区域)中的浸润性单核细胞表达的CCR2,的CCL2。
图30显示了与同基因/同系移植物对照相比,异位气管移植(HTT)同种异体移植物的第14天qPCR的表达概况。
图31图解了第5天鼠正位左单肺移植(mOLTx)同种异体移植物组织病理学,其证明了与对照相比,用抗CD44Ab+MK2i疗法的排斥显著的减少。A和B)对照疗法C和D)抗CD44+MK2i。注意:血管周围(V)浸润物和气道(B)浸润物。
图32显示了在博来霉素后,α-平滑肌肌动蛋白透明质酸合酶2(ASMA-HAS2)CD44-/-小鼠相对ASMA-HAS2+转基因小鼠具有更少的胶原。
图33显示了利用的抗CD44Ab的预防(A)和治疗方案(B)二者,其显示了胶原含量的减少。
图34显示了来自特发性肺纤维化(IPF)患者的成纤维细胞是更具有浸润性的。
图35显示了在博来霉素损伤后,抗CD44Ab减少α-平滑肌肌动蛋白透明质酸合酶2(ASMA-HAS2)小鼠中的胶原。
图36显示了抗CD44减少特发性肺纤维化(IPF)成纤维细胞的浸润。
图37显示了CD44-/-成纤维细胞,其显示了减小的浸润性(A)。抗CD44减少成纤维细胞浸润(B)。
图38显示了在盐水或博来霉素处理后7天从小鼠分离的原代肺AEC2细胞被铺覆于插入式细胞培养皿(transwell)的上部小室,野生型(WT)原代成纤维细胞被铺覆于下部小室。利用蛋白质印迹通过α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)、胶原和纤连蛋白的增加的表达确定成纤维细胞的活化。
图39显示了MK2i(MMI-0100:YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1))减小来自人特发性肺纤维化(IPF)肺的成纤维细胞的浸润能力。
图40显示了MK2i(MMI-0100:YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1))减少来自人特发性肺纤维化(IPF)肺的成纤维细胞的HA产生。
图41显示了MK2i(MMI-0100:YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)减小来自博来霉素处理的转基因鼠透明质酸合酶2(mHAS2tg)肺的成纤维细胞的浸润能力。
图42显示了MK2i(MMI-0100:YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1))减少来自博来霉素处理的转基因鼠透明质酸合酶2(mHAS2)肺的成纤维细胞的透明质酸(HA)产生。
图43显示了MK2i(MMI-0100:YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1))减少博来霉素吃力的野生型(WT)小鼠肺中的透明质酸(HA)含量。
具体实施方式
所述发明提供了用于治疗有需要的对象中的肺纤维化的组合物和方法,方法包括施用治疗量的组合物,其包括具有氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(MMI-0100;SEQ IDNO:1)的多肽或其功能等价物。
术语表
如本文使用的,术语“气道”指的是空气通过其进入或离开身体的通道。肺气道包括空气在呼吸期间穿过的呼吸道的那些部分。
如本文使用的,术语“气道阻塞”指的是气流的任何异常减小。气流阻力可以发生在从上气道至末端支气管的气道中的任何地方。
如本文使用的,术语“气道疾病”指的是影响携带氧气和其它气体进入和离开肺的管(气道)的疾病。气道疾病包括但不限于慢性阻塞性肺病(COPD),其包括哮喘、气肿和慢性支气管炎。
举例而言,如本文使用的,术语“抗体”包括天然存在和非天然存在的抗体二者。具体地,术语“抗体”包括多克隆抗体和单克隆抗体,以及其片段。此外,术语“抗体”包括嵌合抗体和全合成抗体,以及其片段。
抗体是血清蛋白,其分子具备与其靶标上的小化学基团互补的小面积的它们的表面。每个抗体分子至少存在两个的这些互补区(称为抗体结合位点或抗原结合位点),并且在一些类型的抗体分子中,存在十个、八个,或在一些种类中多至12个,这些互补区可以与抗原上的其相应的互补区(抗原决定簇或表位)反应以将多价抗原的多种分子连接在一起以形成网格(lattice)。
全抗体分子的基本结构单位由四条多肽链构成,两条相同的轻(L)链(每条包含大约220个氨基酸)和两条相同的重(H)链(每条通常包含大约440个氨基酸)。两条重链和两条轻链通过非共价键和共价键(二硫键)的组合结合在一起。该分子由两个相同的一半组成,每个具有相同的抗原结合位点,其由轻链的N-末端区和重链的N-末端区组成。轻链和重链二者通常配合形成抗原结合表面。
人抗体显示两种轻链κ和λ;免疫球蛋白的个体分子通常仅是一种或另一种。在正常血清中,已经发现60%的分子具有κ决定簇和30%的λ。已经发现许多其它物种显示两种轻链,但其比例不同。例如,在小鼠和大鼠中,包含λ链,但是总百分比很小;在狗和猫中,κ链极低;马没有显示具有任何κ链;兔可以具有5至40%的λ,这取决于品系和b-基因座同种异型;并且鸡轻链与λ比与κ更同源。
在哺乳动物中,存在五类抗体IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,每种具有其自身的重链种类,α(对于IgA)、δ(对于IgD)、ε(对于IgE)、γ(对于IgG)和μ(对于IgM)。此外,存在分别具有γ1、γ2、γ3和γ4重链的四种IgG免疫球蛋白亚类(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。在其分泌形式中,IgM是由五个四-链单元组成的五聚物,给予其总共10个抗原结合位点。每个五聚物包含一个J链的拷贝,其共价地插入两个相邻的尾区之间。
所有五种免疫球蛋白种类不同于其它血清蛋白,它们在其中显示宽范围的电泳迁移率并且不是均一的。此异质性,例如,该个体IgG分子在净电荷上彼此不同,是免疫球蛋白的固有性质。
互补性的原理,通常被比作锁钥适合性,涉及相对弱的结合力(疏水键和氢键、范德华力和离子相互作用),只有当两个反应分子可以彼此极为接近并且实际上接近到一个分子的突出组成原子或原子团可以融入另一个分子中的互补凹陷或缺口时,所述弱的结合力才能够有效地作用。抗原-抗体相互作用显示了高度特异性,其在多种水平下被证明。就分子水平而言,特异性意思是抗体与抗原的结合位点具有与非相关抗原的抗原决定簇完全不相似的互补性。每当两个不同抗原的抗原决定簇具有一些结构相似性时,一个决定簇可能对另一个决定簇的一些抗体的结合位点发生一些程度的适合,并且此现象引起交叉反应。交叉反应在理解抗原-抗体反应的互补性或特异性中具有重要意义。免疫学特异性或互补性使得抗原中少量杂质/污染的检测成为可能。
可以通过将来自免疫供体的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系融合以产生建立的小鼠杂交瘤克隆来生成单克隆抗体(mAb),所述小鼠杂交瘤克隆在选择性培养基中生长。杂交瘤细胞是永生化杂交细胞,其由分泌抗体的B细胞与骨髓瘤细胞的体外融合产生。体外免疫,其指的是培养中的抗原特异性B细胞的初次活化,是另一种已经建立的产生小鼠单克隆抗体的手段。
也可以通过聚合酶链反应(PCR)扩增来扩增来自外周血淋巴细胞的免疫球蛋白重链(VH)和轻链(Vλ和Vκ)可变基因的多种文库。可以通过使用PCR随机地组合重链和轻链V-基因来制备编码单个多肽链的基因,所述多肽链中重链和轻链可变结构域通过多肽间隔区(单链Fv或scFv)连接。然后,可以通过融合至噬菌体的末端处的次要衣壳蛋白来克隆用于在丝状噬菌体表面展示的组合文库。
导向选择的技术基于利用啮齿动物免疫球蛋白V基因改组的人免疫球蛋白V基因。方法需要(i)利用小鼠单克隆抗体的重链可变区(VH)结构域改组人λ轻链的所有组成成分,所述小鼠单克隆抗体与感兴趣的抗原反应;(ii)选择针对该抗原的半-人Fab;(iii)在第二次改组中使用选择的λ轻链基因作为人重链文库的“停靠结构域”,以分离具有人λ轻链基因的克隆Fab片段;(v)通过利用包含该基因的哺乳动物细胞表达载体进行电穿孔来转染小鼠骨髓瘤细胞;和(vi)在小鼠骨髓瘤中作为完整的IgG1λ抗体分子表达可与抗原反应的Fab的V基因,,。通过Mahler,SM,Marquis,CP,Brown,G,Roberts,A and Hoogenboom,HR inImmunotechnology 3(1):31-43(1997)将源自噬菌体展示文库的人V基因克隆和表达为完全组装的人抗TNFΑ单克隆抗体。
如本文使用的,术语“肺组织疾病”指的是影响肺组织,例如,肺间质的结构的疾病。肺组织的结疤或炎症使得肺不能完全地膨胀(“限制性肺病”)。它还使得肺吸收氧气(氧合)和释放二氧化碳的能力减弱。肺组织疾病的实例包括但不限于特发性肺纤维化(IPF)、急性肺损伤(ALI)、辐射诱发的肺中的纤维化、和与肺移植相关联的纤维变性状况。肉样瘤病是其中在淋巴结、肺、肝、眼、皮肤或其它组织中发生肿胀(炎症)的疾病。
术语“肺间质”或“肺的间质”在本文可交换地使用,指的是位于肺中的气腔上皮和胸膜间皮之间的区域。基质蛋白、胶原和弹性蛋白的纤维是肺间质的主要组分。这些纤维的主要功能是形成维持通气期间的结构完整性的机械支架。
如本文使用的,术语“可及表面积”或“ASA”指的是暴露于溶剂的生物分子的表面积。如本文使用的,术语“溶剂可及表面”或“SAS”指的是可接近溶剂的给定残基的表面积的百分比。其被计算为三维结构中的残基的ASA和其延伸的肽构象的最大ASA之间的比率。
术语“氨基酸残基”或“氨基酸”或“残基”在本文可交换地使用,指的是掺入蛋白质、多肽或肽的氨基酸,其包括但不限于天然存在的氨基酸和已知的天然氨基酸的类似物,其可以以与天然存在的氨基酸相似的方式作用。氨基酸可以是L-或D-氨基酸。氨基酸可以被合成氨基酸取代,如此改变是为了增加肽的半衰期,增加肽的效价,或增加肽的生物利用度。
在本文主要地使用氨基酸的单字母名称。如本领域技术人员熟知的,这样的单字母名称如下:
A是丙氨酸;C是半胱氨酸;D是天冬氨酸;E是谷氨酸;F是苯丙氨酸;G是甘氨酸;H是组氨酸;I是异亮氨酸;K是赖氨酸;L是亮氨酸;M是甲硫氨酸;N是天冬酰胺;P是脯氨酸;Q是谷氨酰胺;R是精氨酸;S是丝氨酸;T是苏氨酸;V是缬氨酸;W是色氨酸;并且Y是酪氨酸。
下列代表彼此保守取代的氨基酸组:1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V);和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
如本文使用的,除非上下文另外清楚地规定,单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物。例如,提及“多肽”意思是一个或多个多肽。
如本文使用的,术语“添加”指的是将一个或多个碱基、或一个或多个氨基酸插入序列。
如本文使用的,术语“施用”指的是配药、供给、施加、给予、分配或供量。术语“施用(administering)”或“施用(administration)”可交换地使用,并且包括体内施用,以及直接施用至离体组织。通常,组合物可以以根据需要包含常规无毒的药学上可接受的载体、佐剂和媒介的剂量单位制剂,口服、含服、胃肠外、外用,通过吸入或吹入(即,通过嘴或通过鼻)、或直肠来全身施用;或可以通过比如而不限于注射、植入、移植、外部施加、或胃肠外的手段局部施用。可以进行另外的施用,例如,静脉内、经心包、口服、经由植入物、经粘膜、经皮、外用、肌肉内、皮下、腹膜内、鞘内、淋巴内、病灶内、或硬膜外。例如,可以进行一次、多次、和/或在一个或多个延长期内施用。
如本文使用的,术语“过敏反应”指的是免疫系统的超敏反应。过敏反应由称为变应原的正常无害的环境物质引起;这些反应是后天的、可预见的、和迅速的。过敏反应特征在于称为肥大细胞和嗜碱性粒细胞的某些白细胞被称为IgE的抗体类型过度的活化,其导致极端的炎性反应。常见的过敏反应包括湿疹、荨麻疹、枯草热、哮喘发作、食物过敏、和对螯针昆虫比如胡蜂和蜜蜂的毒液的反应。
如本文使用的,术语“α-平滑肌肌动蛋白”或“α-SMA”指的是首先上在血管平滑肌细胞中分离到的肌动蛋白蛋白α-肌动蛋白-2(ACTA2;又称为肌动蛋白或主动脉平滑肌肌动蛋白)。肌动蛋白是在所有真核细胞中表达的高度保守的蛋白质。肌动蛋白丝形成细胞骨架的一部分,并且在调节细胞形状和运动中起至关重要的作用。已经在哺乳动物细胞中鉴定了六个不同的肌动蛋白同种型。每个由单独的基因编码并且以发育调节和阻止特异的方式表达。α和β细胞质肌动蛋白在各种各样的细胞中表达,由此α骨骼肌动蛋白、α心脏肌动蛋白、α血管肌动蛋白、和γ肠肌动蛋白的表达更限制于特化的肌肉细胞类型。α-平滑肌肌动蛋白的基因是其表达相对地限制于血管平滑肌细胞的少数基因之一,但是其现在最常用作成肌纤维细胞形成的标志物。α平滑肌肌动蛋白的表达由激素和细胞增殖调节,并且被病理学状况改变,包括致癌性转化和动脉粥样硬化。
如本文使用的,术语“肺泡(alveolus)”或“肺泡(alveoli)”指的是具有空腔形式的解剖结构。在肺中发现,肺泡是与血液气体交换的呼吸位点的球形露出。肺泡包含一些胶原和弹性纤维。当吸气时,弹性纤维允许肺泡随着其充满空气而伸展。它们然后在呼气期间回弹,以便排除富含二氧化碳的空气。
如本文使用的,术语“博来霉素”指的是由细菌轮丝链霉菌产生的糖肽抗生素。其通过诱导DNA链断裂和抑制胸苷掺入DNA链起作用。博来霉素的最严重的并发症是肺纤维化和受损的肺功能。
如本文使用的,术语“支气管肺泡灌洗”或“BAL”指的是其中支气管镜穿过嘴和鼻进入肺并且流体被喷入肺的一小部分并且然后被重新收集用于检查的医疗过程。通常进行BAL以诊断肺病。BAL一般地用于诊断具有免疫系统问题的人中的感染、使用呼吸机的人中的肺炎、一些类型的肺癌的、和肺的结疤(间质性肺病)。BAL是采样上皮内衬液(epitheliallining fluid)(ELF)的组分和测定肺气道的蛋白质组成的最常见的方式,并且通常作为采样肺中的细胞或病原体水平的手段用于免疫学研究。
如本文使用的,术语“载体”和“药学载体”指的是用于将一种或多种活性剂递送至对象的药学上可接受的惰性药剂或媒介,并且通常被称为“赋形剂”。(药学)载体必需具有足够高的纯度和足够低的毒性以使得其适于施用至正在治疗的对象。(药学)载体进一步应当维持活性剂,例如,所述发明的多肽的稳定性和生物利用度。当与给定组合物的活性剂或其它组分结合时,(药学)载体可以是流体或固体,并且以所考虑的计划的施用方式选择以提供期望的体积、稠度等。(药学)载体可以非限制性地是结合剂(例如,预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等)、填料(例如,乳糖和其它糖类、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯、磷酸氢钙等)、润滑剂(例如,硬脂酸镁、滑石、二氧化硅、胶体二氧化硅、硬脂酸、硬脂酸金属盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠等)、崩解剂(例如,淀粉、羧基乙酸淀粉钠等)、或湿润剂(例如,十二烷基硫酸钠等)。用于所述发明的组合物的其它合适的(药学)载体包括但不限于水、盐溶液、醇类、聚乙二醇、明胶、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。用于胃肠外施用所述发明的多肽的组合物可以包括(药学)载体比如无菌水溶液、常见溶剂中的非水溶液比如醇类、或多肽在液体油基中的溶液。
如本文使用的,术语“胶原”指的是在哺乳动物的新鲜结缔组织中发现的一组天然存在的蛋白质。其是结缔组织的主要组分,并且是哺乳动物中最丰富的蛋白质,占据全身蛋白质含量的大约25%至35%。细长纤丝形式的胶原最主要地发现于纤维组织,比如腱、韧带和皮肤,并且还富含于角膜、软骨、骨髓、血管、内脏和椎间盘。目前为止,已经鉴定了29种类型的胶原,并且身体中超过90%的胶原是I型(皮肤、腱、血管、韧带、器官、骨髓)、II型(软骨)、III型(网状体(reticulate)(网状纤维的主要组分))、和IV型(其形成细胞基底膜的基底)胶原。
如本文使用的,术语“状况”指的是各种健康状态,并且意为包括由任何潜在机制、障碍、或损伤引起的障碍或疾病。
术语“细胞因子”,其指的是由细胞分泌的小的可溶性蛋白物质,其对其它细胞具有多种作用,通常用于指许多信号传导分子,非限制性地包括淋巴因子、白介素和趋化因子。细胞因子介导许多重要的生理学功能,包括生长、发育、创伤愈合和免疫反应。它们通过与位于细胞膜的其细胞特异性受体结合发挥作用,这使得在细胞中开始独特的信号转导级联,其最终将导致靶标细胞中的生化和表型变化。通常,细胞因子在局部起作用,尽管已经发现一些具有系统性免疫调节作用,以及类似于激素的多效性自分泌、旁分泌和内分泌作用。它们包括:I型细胞因子,其包含许多白介素,以及多种造血生长因子;II型细胞因子,包括干扰素和白介素-10;肿瘤坏死因子(“TNF”)相关分子,包括TNF-α和淋巴毒素;免疫球蛋白超家族成员,包括白介素1(“IL-1”);和趋化因子,在各种各样免疫和炎性功能中起关键作用的分子家族。相同的细胞因子可以取决于细胞状态对细胞具有不同的作用。细胞因子通常调节其它细胞因子的表达并引发级联。
如本文使用的,术语“疾病”或“障碍”指的是健康的损害或异常功能的状况,而不管原因(是否是可遗传的、环境的、饮食的、传染的、由于创伤、或另外的)。例如,障碍可以包括但不限于:炎性或纤维变性疾病、纤维化、急性肺损伤、辐射诱发的纤维化、移植排斥、慢性阻塞性肺病(COPD)、内毒素休克、局限性炎性疾病、动脉粥样硬化性心血管疾病、阿尔茨海默病、肿瘤疾病、神经缺血、结缔组织与系统性自身免疫疾病、类风湿性关节炎、克罗恩病、炎性肠道疾病、系统性红斑狼疮(SLE)、斯耶格伦综合症、硬皮病、血管炎、内膜增生、狭窄、再狭窄、动脉粥样硬化、平滑肌细胞肿瘤与转移、平滑肌痉挛、心绞痛、普林兹迈托心绞痛、缺血、中风、心动过缓、高血压、心脏肥大、肾衰竭、中风、肺动脉高压、哮喘、妊娠毒血症、未足月产、先兆子痫、子痫、雷诺病或现象、溶血性尿毒症、肛裂、失弛缓症、阳痿、偏头疼、与平滑肌痉挛相关联的缺血性肌肉损伤、血管病变、缓慢性心律失常(bradyarrythmia)、充血性心力衰竭、顿抑心肌(stunned myocardium)、肺动脉高血压、舒张期机能障碍、神经胶质增生(星形胶质细胞的增殖,并且可以包括中枢神经系统的受损区域中的细胞外基质(ECM)沉积)、慢性阻塞性肺病(即,特征在于气流阻塞或限制的呼吸道病;包括但不限于慢性支气管炎、气肿和慢性哮喘)、骨质减少、内皮机能障碍、炎症、变性关节炎、强直性脊柱炎、格-巴二氏病、传染病、脓毒病、内毒素休克、银屑病、放射性小肠炎、肝硬化、间质纤维化、肺纤维化(包括特发性肺纤维化)、结肠炎、阑尾炎、胃炎、喉炎、脑膜炎、胰腺炎、耳炎、再灌注损伤、外伤性脑损伤、脊髓损伤、周维神经病变、多发性硬化、过敏症、心代谢疾病、肥胖、II型糖尿病、I型糖尿病、和NASH/肝硬化。
如本文使用的,术语“结构域”指的是具有典型的三级结构和功能的蛋白质的区域,并且指的是一起组成通过折叠其线性肽链形成的其三级结构的蛋白质的任意三维亚基。
如本文使用的,术语“治疗结构域”(也称为“TD”)指的是肽、肽区段或变体、或其衍生物,其与肽KALARQLGVAA(SEQ ID NO:2)、或其区段具有实质同一性。治疗结构域通常其自身通常不能够穿透哺乳动物细胞的质膜。一旦在细胞内,治疗结构域可以抑制特定组的激酶的激酶活性。
如本文使用的,术语“细胞穿透肽”(也称为“CPP”、“蛋白质转导结构域”、“PTD”、“特洛伊肽”、“膜易位序列”和“细胞穿透性蛋白”)指的是能够穿透哺乳动物细胞细胞的质膜的肽类。其还指的是肽、肽区段、或变体或其衍生物,其与肽YARAAARQARA(SEQ ID NO:11)、或其功能区段具有实质同一性,并且指的是肽、肽区段、或变体或其衍生物,其在功能上等同于SEQ ID NO:11。CPP的长度通常为10-16个氨基酸,并且能够跨越哺乳动物细胞传输许多类型和分子量的化合物。这样的化合物包括但不限于效应分子,比如蛋白质、DNA、缀合肽、寡核苷酸)、和小颗粒比如脂质体。化学连接或融合至其它蛋白质(“融合蛋白”)的CPP仍能够穿透质膜并进入细胞。
如本文使用的术语“细胞外基质”指的是经由特异性细胞表面受体与细胞相互作用的细胞的外部环境中的支架。细胞外基质由纤维状蛋白质和糖葡胺聚糖(GAG)的连锁网(interlocking mesh)组成。在细胞外基质中发现的纤维状蛋白质的实例非限制性地包括胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、和层粘连蛋白。在细胞外基质中发现的GAG的实例非限制性地包括蛋白多糖(例如,硫酸肝素)、硫酸软骨素、硫酸钾蛋白、和非蛋白多糖的多糖(例如,透明质酸)。术语“蛋白多糖”指的是包含一种或多种糖葡胺聚糖附着至其的核心蛋白的一组糖蛋白。细胞外基质发挥许多功能,包括但不限于向细胞提供支撑和锚定、从一个组织分离另一个组织、和调节细胞内通讯。
术语“功能等价物”或“在功能上等价的”在本文可交换地使用,指的是具有相似或相同作用或用途的物质、分子、多核苷酸、蛋白质、肽或多肽。在功能上等价于例如多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的多肽可以具有基本上类似于或相同于SEQ IDNO:1的表达多肽的生物学活性,例如,抑制活性、动力学参数、盐度抑制、辅因子依赖活性、和/或功能单位大小。
在功能上等价于YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的多肽的实例包括但不限于氨基酸序列FAKLAARLYRKALARQLGVAA(SEQ ID NO:3)的多肽、氨基酸序列KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA(SEQ ID NO:4)的多肽、氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLAVA(SEQ ID NO:5)的多肽、氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVA(SEQ ID NO:6)的多肽、和氨基酸序列HRRIKAWLKKIKALARQLGVAA(SEQ ID NO:7)的多肽。
本发明中描述的氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)肽包括融合蛋白,其中为了增强治疗效果,细胞穿透肽(CPP;YARAAARQARA;SEQ ID NO:11)可操作地连接至治疗结构域(KALARQLGVAA;SEQID NO:2)。
在功能上等价于多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的治疗结构域(TD;KALARQLGVAA;SEQ ID NO:2)的多肽的实例包括但不限于氨基酸序列KALARQLAVA(SEQ IDNO:8)的多肽、氨基酸序列KALARQLGVA(SEQ ID NO:9)的多肽、和氨基酸序列KALARQLGVAA(SEQ ID NO:10)的多肽。
在功能上等价于多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的细胞穿透肽(CPP;YARAAARQARA;SEQ ID NO:11)的多肽的实例包括但不限于氨基酸序列WLRRIKAWLRRIKA(SEQ ID NO:12)的多肽、氨基酸序列WLRRIKA(SEQ ID NO:13)的多肽、氨基酸序列YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:14)的多肽、氨基酸序列WLRRIKAWLRRI(SEQ ID NO:15)的多肽、氨基酸序列FAKLAARLYR(SEQ ID NO:16)的多肽、氨基酸序列KAFAKLAARLYR(SEQ IDNO:17)的多肽、和氨基酸序列HRRIKAWLKKI(SEQ ID NO:18)的多肽。
如本文使用的,术语“内源的”指的是在生长或源自于内部、或内部衍生的。
如本文使用的,术语“内皮”指的是衬在血管的内表面的细胞内的薄层,其形成腔中循环血液和其余脉管壁之间的界面。内皮细胞将衬在整个循环系统内,从心至最小的毛细血管。这些细胞减少血液流动的湍流,使得流体被泵送得更远。
如本文使用的,术语“嗜酸性细胞”或“嗜酸性粒细胞”指的是负责防治脊柱动物中的多细胞寄生虫和某些感染的白细胞。它们是在迁移入血液前在造血期间在骨髓中发育的粒细胞。连同肥大细胞一起,它们还控制与过敏症和哮喘相关联的机制。在活化之后,嗜酸性细胞发挥多样的功能,包括(1)产生阳离子颗粒蛋白和其通过脱粒的释放,(2)产生活性氧类别,比如,超氧化物、过氧化物、和次溴酸盐(次溴酸,其由嗜酸性细胞过氧化物酶优先地产生),(3)产生脂质介质,比如,来自白三烯和前列腺素家族的类花生酸,(4)产生生长因子,比如转化生长因子(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)、和血小板源生长因子(PDGF),和(5)产生细胞因子比如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-13和TNF-α。
如本文使用的,术语“上皮”指的是由衬在遍及身体的结构的腔和表面内的细胞组成的组织。上皮的基底面面向下面的结缔组织,并且两层被基底膜分离。
如本文使用的,术语“外渗”指的是血细胞组分从毛细血管至环绕它们的组织的移动(血细胞渗出)。在恶性肿瘤转移的情况下,它指的是离开毛细血管和进入器官的癌细胞。
如本文使用的,术语“渗出”指的是来自循环系统的流体通过其穿过血管的壁进入病变或炎症区域的过程。血液渗出物包含一些或全部血浆蛋白、白细胞、血小板和红细胞。
如本文使用的,术语“纤维蛋白”指的是参与凝血的纤维状蛋白质。其是聚合以形成“网”的纤维性蛋白,所述“网”在创伤位点上方形成止血栓子或凝块(连同血小板)。纤维蛋白参与信号转导、血液凝固、血小板活化、和蛋白质聚合。
如本文使用的,术语“成纤维细胞”指的是制造和分泌细胞外基质蛋白包括但不限于胶原的结缔组织细胞。成纤维细胞,在结缔组织中发现的最常见的细胞类型,在愈合伤口中起重要的作用。与结缔组织的其它细胞一样,成纤维细胞源自原始间质(源自全部三个胚层并且位于胚胎的疏松结缔组织类型)。在某些情况下,上皮细胞可以产生成纤维细胞,称为上皮间充质转换的过程。成纤维细胞和纤维细胞是相同细胞的两种状态,前者是活化状态,后者是低活性状态,与维持和组织代谢相关,其中两种术语偶尔可交换地使用。
如本文使用的,术语“成肌纤维细胞”指的是创伤区域中的成纤维细胞,其具有平滑肌的一些特性,比如收缩性质,和纤维,并且被认为暂时地产生III型胶原。虽然存在许多可能方式的成肌纤维细胞发育,但是成肌纤维细胞是在其分化中在成纤维细胞和平滑肌细胞之间的细胞。在许多器官如肝、肺和肾中,它们主要地涉及纤维化。在创伤组织中,其与伤口加固(通过细胞外胶原纤维沉积)和然后创伤收缩(通过细胞内收缩和通过整合蛋白介导的拉动至胶原束的胶原纤维的伴行排列(concomitant alignment))相关。
如本文使用的,术语“纤连蛋白”指的是高分子量(~440kDa)细胞外基质糖蛋白,其与跨膜细胞表面基质受体蛋白(“整合蛋白”)并且与细胞外基质组分比如胶原、纤维蛋白和硫酸肝素蛋白多糖(例如多配体聚糖)结合。纤连蛋白作为二聚物存在,其由通过一对二硫键连接的两个几乎相同的单体构成。存在纤连蛋白的多种同种型。血浆纤连蛋白是可溶的并且在血液和其它体液中循环,其中其被认为增强凝血、创伤愈合和吞噬作用。其它同种型在细胞的表面上聚集,并且作为高度不溶性纤连蛋白丝沉积于细胞外基质。成纤维细胞的表面上或附近形成的纤连蛋白丝通常与相邻的细胞内肌动蛋白应力纤维对齐,其促进分泌的纤连蛋白分子聚集为丝并且影响丝取向。纤连蛋白在细胞粘附、细胞生长、细胞迁移和细胞分化中起主要作用,并且其对过程比如创伤愈合和胚胎发育是重要的。
如本文使用的,术语“纤维化”指的是器官或组织中因部分损伤或炎症或因干扰其血液供应而产生的过量的纤维结缔组织的形成或发展。其可以为导致疤痕的正常愈合反应、异常的反应过程的结果,或不具有已知的或理解的成因。
如本文使用的,术语“吸入”指的是利用呼吸吸取含药蒸气的动作。
如本文使用的,术语“吹入”指的是在压力下递送空气、气体或粉末至身体的腔或室的动作。例如,鼻吹入涉及通过鼻在压力下递送空气、气体或粉末至身体的腔或室的动作。
如本文使用的,术语“吸入递送装置”指的是从液体或干粉气溶胶制剂产生小液滴或气溶胶,并且用于通过嘴施用以便实现药物(例如,在溶液、粉末等中)的肺施用的机器/设备或组件。吸入递送装置的实例包括但不限于喷雾器、定量吸入器和干粉吸入器(DPI)。
如本文使用的,术语“喷雾器”指的是用于以雾的形式施加吸入肺的液体药物的装置。
如本文使用的,术语“定量吸入器”、“MDI”或“喷气机(puffer)”指的是加压的手持装置,其使用抛射剂以递送特定量的药物(“定量”)至患者的肺。如本文使用的,术语“抛射剂”指的是通常由通过会聚的扩散喷嘴的气体压力用于排出物质的材料。压力可以来自压缩气体、或通过化学反应产生的气体。排放材料可以是气体、液体、等离子体或化学反应前的固体、液体或凝胶。用于加压定量吸入器的抛射剂是液化气体,传统上是氯氟烃(CFC)且越来越多是氢氟烷烃(HFA)。合适的抛射剂包括,例如,氯氟烃(CFC),比如三氯氟甲烷(也称为抛射剂11)、二氯二氟甲烷(也称为抛射剂12)、和1,2-二氯-1,1,2,2-四氟乙烷(也称为抛射剂114);氢氯氟烃;氢氟烷(HFC),比如1,1,1,2-四氟乙烷(也称为抛射剂134a、HFC-134a或HFA-134a)和1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(也称为抛射剂227、HFC-227或HFA-227);二氧化碳;二甲醚;丁烷;丙烷;或其混合物。在其它实施方式中,抛射剂包括氯氟烃、氢氯氟烃、氢氟烷、或其混合物。在其它实施方式中,氢氟烷被用作抛射剂。在其它实施方式中,HFC-227和/或HFC-134a被用作抛射剂。
如本文使用的,术语“干粉吸入器”或“DPI”指的是类似于定量吸入器的装置,但是其中药物是粉末的形式。患者呼出完整呼吸,将嘴唇放在衔口(mouthpiece)周围,并且然后快速地吸入粉末。干粉吸入器不需要MDI必需的时机和协作。
如本文使用的,术语“颗粒”指的是极小的构分(例如纳米颗粒、微粒或在一些情况下更大的颗粒),在其中或其上包含本文所述的组合物。
如本文使用的,术语“肺纤维化”、“特发性肺纤维化”和“隐原性纤维性肺泡炎”指的是间质性肺病的主要构成,其特征在于重构正常肺组织结构和危害其功能的异常成纤维细胞增殖和细胞外基质蛋白的沉积。特发性肺纤维化的标志病变是成纤维细胞病灶。这些位点具有以下特点:间充质细胞的活跃复制和新鲜细胞外基质的丰富沉积。
如本文使用的,术语“纤维变性位置”或“纤维变性病灶”可交换地指的是由过量的纤维组织形成或发展的组织中的特定位置。
如本文使用的,术语“融合蛋白”指的是出于制造具有源自原始蛋白质或多肽中的每个的功能性质的单个多肽或蛋白质的目的,通过结合多个蛋白结构域或多肽构建的蛋白质或多肽。融合蛋白的制造可以通过以下完成:经由重组DNA技术可操作地结合或连接编码每个蛋白结构域或多肽的两个不同的核苷酸序列,从而制造编码期望的融合蛋白的新的多核苷酸序列。可选地,可以通过化学地接合期望的蛋白结构域制造融合蛋白。
如本文使用的,术语“特发性”意思是自发地产生或来自模糊或未知的原因。
如本文使用的,术语“炎症”指的是血管化组织通过其响应损伤的生理过程。参见,例如,FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY,4th Ed.,William E.Paul,ed.Lippincott-RavenPublishers,Philadelphia(1999)at 1051-1053,其通过引用并入本文。在炎性过程期间,参与解毒和修复的细胞被炎性介质动员至危害位点。炎症通常特征在于白血球特别是嗜中性粒细胞(多形核细胞)在炎症位点的强烈浸润。这些细胞通过在血管壁处或在未损伤组织中释放有毒物质来促进组织伤害。传统地,炎症已经被分为急性和慢性反应。
如本文使用的。术语“急性炎症”指的是对急性损伤的迅速的、短暂(几分钟至几天)的、相对一致的反应,其特征在于流液、血浆蛋白和嗜中性白血球的聚积。引起急性炎症的有害因素(injurious agent)的实例包括但不限于病原体(例如细菌、病毒、寄生虫)、来自外源性(例如石棉)或内源性(例如,尿酸盐结晶、免疫复合物)来源的异物、和物理(例如,烧伤)或化学(例如,腐蚀剂)因素。
如本文使用的,术语“慢性炎症”指的是较长持续时间的炎症,并且其具有不明确且不确定的终止期。当急性炎症通过不完全清除初始炎性因素(例如,吸烟)或由于在相同位置出现的多个急性事件而持续时,慢性炎症接管。包括淋巴细胞与巨噬细胞的流入和成纤维细胞生长的慢性炎症可以在延长或反复的炎性活动的位点导致组织结疤。
如本文使用的,术语“炎性介质”指的是炎性和免疫过程的分子介质。这些可溶性可扩散的分子在组织伤害和感染的位点的局部和更远的位点二者处起作用。一些炎性介质通过炎性过程活化,而其它的响应于急性炎症或通过其它可溶性炎性介质从细胞来源合成和/或释放。炎性反应的炎性介质的实例包括但不限于血浆蛋白酶、补体、激肽、凝血蛋白和溶纤维蛋白、脂质介质、前列腺素、白细胞三烯、血小板活化因子(PAF)、肽、激素(包括类固醇激素比如糖皮质激素)、和胺(包括但不限于组胺)、血清素、和神经肽、和促炎性细胞因子(包括但不限于白介素-1β(IL-1β)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IF-γ)、白介素12(IL-12)和白介素-17(IL-17))。
在促炎介质之中,已知IL-1、IL-6和TNF-α在在急性期反应中活化肝细胞以合成活化补体的急性期蛋白。补体是与病原体相互作用以标记它们以便被吞噬细胞破坏的血浆蛋白的系统。补体蛋白可以被病原体直接地或被病原体结合抗体间接地活化,其导致在病原体的表面上发生并且生成具有多种效应功能的活性组分的级联反应。IL-1、IL-6和TNF-α还激活骨髓内皮以动员嗜中性粒细胞,并且作为内源性致热原起作用,提高体温,其帮助从身体消除感染。细胞因子的主要作用是作用于下丘脑,改变体温调节,和作用于肌肉和脂肪细胞,刺激肌肉和脂肪细胞的分解代谢以升高体温。在升高的温度下,细菌和病毒复制降低,同时适应性免疫系统更高效地运行。
如本文使用的,术语“肿瘤坏死因子”指的是响应于抗原或感染由白细胞制造的细胞因子,其诱导肿瘤细胞坏死(死亡)并且具备广谱的促炎作用。肿瘤坏死因子还是对脂质代谢、凝血、胰岛素抗性、和衬在血管内的内皮细胞的功能作用的多功能细胞因子。
如本文使用的,术语“白介素(IL)”指的是来自第一次观察到由白血球分泌并且作用于白血球的一类同源相关蛋白的细胞因子。已经发现白介素由各种体细胞产生。白介素调节细胞生长、分化和运动,并且刺激免疫反应,比如炎症。白介素的实例包括白介素-1(IL-1)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、白介素-12(IL-12)和白介素-17(IL-17)。
在本文使用的术语“抑制(inhibiting)”、“抑制(inhibit)”或“抑制(inhibition)”指的是减小过程的量或速率,完全停止过程,或降低、限制或阻断其作用或功能。抑制可以包括将物质的量、速率、作用功能、或过程减小或降低至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%。
如本文使用的,术语“抑制剂”指的是与第一个分子结合从而降低第一个分子的活性的第二个分子。酶抑制剂是与酶结合从而降低酶活性的分子。抑制剂的结合可以阻止底物进入酶的活性位点和/或阻碍酶催化其反应。抑制剂结合是可逆的或不可逆的。不可逆的抑制剂通常与酶反应并且使其化学地改变,例如,通过修饰酶活性所必需的关键氨基酸残基。相比之下,可逆的抑制剂非共价地结合并且取决于这些抑制剂是否结合酶、酶-底物复合物、或二者产生不同类型的抑制。酶抑制剂通常通过其特异性和效价进行评估。
如本文可交换地使用的,术语“MK2抑制肽”、“MK2抑制剂”和“MK2i”指的是结合MK2从而降低MK2的活性的分子。根据一些实施方式,所述发明的MK2抑制肽(也称为MK2抑制剂或MK2i)包括但不限于MMI-0100:YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)、MMI-0200:YARAAARQARAKALNRQLGVA(SEQ ID NO:19)、MMI-0300:FAKLAARLYRKALARQLGVAA(SEQ ID NO:3)、MMI-0400:KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA(SEQ ID NO:4)和MMI-0500:HRRIKAWLKKIKALARQLGVAA(SEQ ID NO:7)。
如本文使用的,术语“损伤”指的是由物理的或化学的外部因素或外力引起的身体的结构或功能的损害或伤害。
本文使用的术语“分离的”指的是物质,比如,但不限于核酸、肽、多肽或蛋白质,其:(1)基本上或大体上不含正常地在其天然存在环境中发现的与其伴随或互相作用的组分。本文使用的术语“基本上不含”或“大体上不含”指的是相当地或显著地不含,或多于大约95%不含,或多于大约99%不含这样的组分。分离的物质任选包括在其天然环境中未发现的物质;或(2)如果物质在其天然环境中,则该物质已经通过有意的人为介入被合成地(非天然地)改变为组合物和/或被置于细胞中的某个位置(例如,基因组或亚细胞器),其对在环境中发现的物质是非天然的。可以对处于其天然状态的物质进行改变,或从其天然状态移除,以产生合成物质。例如,借助在其来源的细胞内进行人为介入,如果天然存在的核酸被改变,或如果其从已经被改变的DNA转录,则其成为分离的核酸。参见,例如,Compoundsand Methods for Site Directed Mutagenesis in Eukaryotic Cells,Kmiec,美国专利号 5,565,350;In Vivo Homologous Sequence Targeting in Eukaryotic Cells;Zarling等,PCT/US93/03868,每个通过引用以其全部并入本文。同样地,天然存在的核酸(例如,启动子),如果通过非天然存在的手段引入对该核酸非天然的基因组的基因座,则其称为分离的。如本文限定的,“分离的”核酸也称为“异源”核酸。
如本文使用的,术语“激酶”指的是将磷酸基团从高能供体分子转移至特异性靶分子或底物的酶类型。高能供体组可以包括但不限于ATP。
如本文使用的。术语“白血球”或“白细胞(WBC)”指的是免疫细胞类型。大多数白血球在骨髓中制造并且发现于血液和淋巴组织。白血球帮助身体与感染和其它疾病斗争。粒细胞、单核细胞和淋巴细胞是白血球。
如本文使用的,术语“淋巴细胞”指的是小的白细胞(白血球)在保护身体抵御疾病中起大作用。存在两种主要类型的淋巴细胞:B细胞和T细胞。B细胞制造攻击细菌和毒素的抗体,而当体细胞已经被病毒接管或已经变为癌性时,T细胞自身攻击体细胞。淋巴细胞分泌调节许多其它类型的细胞的功能活性并且通常存在于慢性炎症的位点的产物(淋巴因子)。
如本文使用的,术语“巨噬细胞”指的是环绕和杀死微生物,移除死细胞,并且刺激其它免疫系统细胞的作用的白细胞类型。在消化病原体后,巨噬细胞呈递病原体的抗原(分子,最通常是在病原体的表面上发现的蛋白质,由免疫系统用于识别)至对应的辅助T细胞。通过将抗原整合入细胞膜并且展示附着至MHC II类分子的抗原完成呈递,MHC II类分子向其它白细胞指示巨噬细胞不是病原体,而不管在其表面上具有抗原。最后,抗原呈递导致附着至病原体的抗原的抗体的产生,使得巨噬细胞更易于附着至它们的细胞膜和更易于吞噬作用。
如本文使用的,术语“间充质细胞”或“间质”指的是源自全部三个胚层的细胞,其发育为结缔组织、骨骼、阮福、淋巴系统和循环系统。
如本文使用的,术语“MK2激酶”或“MK2”指的是促分裂原活化蛋白激酶-活化蛋白激酶2(也称为“MAPKAPK2”、“MAPKAP-K2”、“MK2”),其是丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶家族的成员。
如本文使用的,术语“质量中值空气动力学直径”或“MMAD”指的是空气散播颗粒质量关于空气动力学直径的分布的中值。MMAD通常伴随几何标准差(g或σg),其表征颗粒大小分布的可变性。
如本文使用的,术语“调节”意思是调整、改变、适应或调节至某一测量或比例。
如本文使用的,术语“单核细胞”指的是在骨髓中制造并且经过血液至身体中的组织(在那里其变为巨噬细胞)的免疫细胞类型。单核细胞是白细胞类型和吞噬细胞类型。
如本文使用的,术语“嗜中性粒细胞”或“多形核嗜中性粒细胞(PMN)”指的是哺乳动物中最丰富的白细胞类型,其形成先天免疫系统的基本部分。它们连同嗜碱性细胞和嗜酸性细胞一起形成多形核细胞家族(PMN)的一部分。嗜中性粒细胞正常地发现于血流。在炎症的开始(急性)期期间,特别地由于细菌感染和一些癌症,嗜中性粒细胞是炎性细胞朝向炎症位点迁移的第一应答者之一。它们在称为趋化性的过程中,跟随化学信号比如白介素-8(IL-8)和C5a迁移通过血管,然后通过间质性组织,所述过程是运动性细胞或部分沿着化学浓度梯度朝向其视为吸引性的环境条件和/或远离其发现排斥(repellent)的环境的定向运动。
如本文使用的,术语“正常健康对照对象”指的是不具有气道或肺组织疾病的症状或其它临床证据的对象。
本文使用的术语“核酸”指的是单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物,并且除非另外限制,包含具有天然核苷酸的基本性质的已知类似物(例如,肽核酸),其中它们以与天然存在的核苷酸相似的方式与单链核酸杂交。
本文使用的术语“核苷酸”指的是由杂环碱基、糖和一个或多个磷酸基团构成的化合物。在最常见的核苷酸中,碱基是嘌呤或嘧啶的衍生物,并且糖是戊糖脱氧核糖或核糖。核苷酸是核酸的单体,其中三个或更多个结合在一起以形成核酸。核苷酸是RNA、DNA和多种辅因子包括但不限于CoA、FAD、DMN、NAD和NADP的结构单位。嘌呤包括腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G);嘧啶包括胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。
本文使用下列术语描述两种或更多种核酸或多核苷酸之间的序列关系:(a)“参考序列”、(b)“比较窗口”、(c)“序列同一性”、(d)“序列同一性的百分比”、和(e)“基本同一性”。
(a)术语“参考序列”指的是用作序列比较的基础的序列。参考序列可以是指定序列的子集或全部;例如,作为全长cDNA或基因序列的区段,或完整的cDNA或基因序列。
(b)术语“比较窗口”指的是多核苷酸序列的连续的指定区段,其中所述多核苷酸序列可以与参考序列比较,并且其中比较窗口中的多核苷酸序列部分与参考序列(其不包括添加或缺失)相比,可以包括添加或缺失(即空位)用于两个序列的最佳比对。通常,比较窗口的长度是至少20个连续核苷酸,并且任选地可以是至少30个连续核苷酸、至少40个连续核苷酸、至少50个连续核苷酸、至少100个连续核苷酸长或更长。本领域技术人员理解,为了避免由于在多核苷酸序列中包含空位而与参考序列高度相似,通常引入空位罚分,并且从匹配数减去空位罚分。
用于比较的序列比对方法在本领域是熟知的。可以通过以下实施用于比较的序列最佳比对:Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法;Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法;Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444(1988)的相似性检索方法;这些算法的计算机执行包括但不限于:PC/基因程序中的CLUSTAL,Intelligenetics,Mountain View,Calif.;Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group(GCG),575Science Dr.,Madison,Wis.,USA;由Higgins和Sharp,Gene 73:237-244(1988)很好描述的CLUSTAL程序;Higgins和Sharp,CABIOS 5:151-153(1989);Corpet,等,Nucleic acidsResearch 16:10881-90(1988);Huang等,Computer Applications in the Biosciences8:155-65(1992);和Pearson等,Methods in Molecular Biology,24:307-331(1994)。可以用于数据库相似性检索的BLAST程序家族包括:用于针对核苷酸数据库序列的核苷酸查询序列的BLASTN;用于针对蛋白质数据库序列的核苷酸查询序列的BLASTX;用于针对蛋白质数据库序列的蛋白质查询序列的BLASTP;用于针对核苷酸数据库序列的蛋白质查询序列的TBLASTN;和用于针对核苷酸数据库序列的核苷酸查询序列的TBLASTX。参见CurrentProtocols in Molecular Biology,Chapter19,Ausubel,等,Eds.,Greene Publishingand Wiley-Interscience,New York(1995)。
除非另外说明,本文提供的序列同一性/相似性值指的是使用BLAST 2.0程序套件使用默认参数获得的值。Altschul等,Nucleic acids Res.25:3389-3402(1997)。用于进行BLAST分析的软件是可以公开获得的,例如,通过国家生物技术信息中心。此算法包括首先通过识别查询序列中长度W的短字(short word)识别高分数序列对(HSP),所述短字当与数据库序列中相同长度的字比对时,与一些正值的阀值分数T匹配或符合。T被称为邻近字分数阀值(Altschul等,如上)。这些初始邻近字命中作为用于起始检索以发现包含它们的更长的HSP的种子。然后,只要累积的比对分数可以增加,字命中沿着每个序列以两个方向延伸。对于核苷酸序列,使用参数M(匹配残基对的奖励分数;总是>0)和N(不匹配残基的罚分;总是<0)计算累积的分数。对于氨基酸序列,评分矩阵被用于计算累积的分数。当出现以下情况时,停止每个方向中字命中的延伸:累积的比对分数从其最大获得值减少数量X;由于一个或多个负评分残基比对的积累,累积的分数变为0或低于0;或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用以下作为默认值:11的字长(W),10的期望值(E),100的切分点(cutoff),M=5,N=-4,和两条链进行比较。对于氨基酸序列,BLASTP程序使用以下作为默认值:3的字长(W),10的期望值(E),和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)。
除计算序列同一性百分比之外,BLAST算法还进行两个序列之间相似性的统计学分析(参见,例如,Karlin&Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的一种相似性测量是最小和概率(P(N)),其提供两个核苷酸或氨基酸序列之间将偶然出现匹配的可能性的指示。BLAST检索假设蛋白质可以作为随机序列建模。然而,许多真实的蛋白质包括非随机序列的区域,其可以是同聚物区域(homopolymerictract)、短期重复、或富集于一种或多种氨基酸的区域。可以在不相关的蛋白质之间比对这样的低复杂度区域,即使蛋白质的其它区域完全不相似。可以采用大量的低复杂度过滤程序以减少这样的低复杂度比对。例如,可以单独地或组合地采用SEG(Wooten和Federhen,Comput.Chem.,17:149-163(1993))和XNU(Claverie和States,Comput.Chem.,17:191-201(1993))低复杂度过滤器。
(c)本文在两个核酸或多肽序列的背景下使用的术语“序列同一性”或“同一性”指的是在指定的比较窗口内当比对最大一致性时两个序列中相同的残基。当在关于蛋白质使用序列同一性的百分比时,认识到不相同的残基位置通常是因保守氨基酸取代而不同,即,其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其它氨基酸残基取代,并且因此不改变分子的功能性质。在序列因保守取代而不同时,可以向上调节序列同一性百分比以校正取代的保守性质。据说因这样的保守取代而不同的序列具有“序列相似性”或“相似性”。用于进行此调节的手段对本领域技术人员是熟知的。通常,这包括将保守取代评分为部分不匹配而不是完全不匹配,从而增加序列同一性百分比。因而,例如,在给予相同氨基酸1分并且给予非保守取代0分时,保守取代被给予0和1之间的分数。例如,根据例如在程序PC/GENE(Intelligenetics,Mountain View,Calif.,USA)中执行的Meyers和Miller,Computer Applic.Biol.Sci.,4:11-17(1988))的算法计算保守取代的评分。
(d)本文使用的术语“序列同一性的百分比”意思是通过在比较窗口内比较两个最佳比对的序列而测定的值,其中比较窗口中的多核苷酸序列部分与参考序列(其不包括添加或缺失)相比可以包括添加或缺失(即,空位)用于两个序列的最佳比对。百分比如下计算:通过测定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目产生匹配位置的数目,用匹配位置的数目除以比较窗口中的位置的总数,并且将该结果乘以100以产生序列同一性的百分比。
(e)多核苷酸序列的术语“基本同一性”意思是使用描述的比对程序中的一种,使用标准参数,多核苷酸与参考序列相比包括具有至少70%序列同一性、至少80%序列同一性、至少90%序列同一性和至少95%序列同一性的序列。技术人员将认识到,可以通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、读框定位等,适当调整这些值以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性。出于这些目的,氨基酸序列的基本同一性通常意思是至少60%、或至少70%、至少80%、至少90%、或至少95%的序列同一性。核苷酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子在严格条件下是否彼此杂交。然而,如果其编码的多肽基本上相同,则在严格条件下彼此不杂交的核酸仍然基本上相同。例如,这可以当使用遗传密码所允许的最大密码子简并性形成核酸的拷贝时发生。两个核酸序列基本上相同的一个指示是第一核酸编码的多肽与由第二核酸编码的多肽有免疫学交叉反应。
如本文使用的,短语“可操作地连接的”指的是其中两个或更多个蛋白结构域或多肽经由重组DNA技术或化学反应接合或组合的连接,以使得得到的融合蛋白的每个蛋白结构域或多肽保留其原始功能。例如,SEQ ID NO:1通过可操作地连接细胞穿透肽(SEQ IDNO:11)与治疗结构域(SEQ ID NO:2)构建,从而产生具备SEQ ID NO:11的细胞穿透功能和SEQ ID NO:2的激酶抑制剂功能二者的融合肽。
如本文使用的,术语“实质”指的是如与结缔组织或血管对比构成器官的基本部分的动物组织。术语“实质的”意思是涉及器官的实质。
如本文使用的,术语“胃肠外”指的是通过注射引入身体(即,通过注射施用),包括,例如,皮下(即,在皮肤下注射)、肌肉内(即,注射入肌肉)、静脉内(即,注射入静脉)、鞘内(即,注射入脊髓周围空间或大脑的蛛网膜下)、胸骨内注射或输注技术,并且包括腹膜内注射或输注入体腔(例如腹膜)。使用针例如,外科手术针,或其它身体进入装置(corporalaccess device)递送胃肠外施用的组合物。如本文使用的,术语“外科手术针”指的是适于递送流体(即,能够流动)组合物进入选择的解剖结构的任何进入装置。可以使用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂,根据已知技术配制可注射的制剂,比如无菌注射的水性或油性悬浮液。
如本文使用的,术语“微粒”指的是悬浮在气体或液体中的固体或液体物质的细小颗粒。
如本文使用的术语“药学上可接受的载体”指的是常规地可用于施用药物的任何基本上无毒的载体,其中本发明的分离的多肽将保持稳定和生物利用。药学上可接受的载体必须具有足够高的纯度和足够低的毒性以使得其适合施用至正在治疗的哺乳动物。其进一步应当维持活性剂的稳定性和生物利用度。药学上可接受的载体可以是液体或固体,并且利用考虑的计划施用方式选择,以当与活性剂和给定组合物的其它组分结合时提供期望的体积、稠度等。
术语“药学上可接受的盐”意思是以下那些盐,其在可靠医学判断的范围内,适合用于与人和低级动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激、变应性反应等,且与合理的效益/风险比相称。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可交换地使用,指的是氨基酸残基的聚合物。术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物,以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。天然存在的氨基酸的这样的类似物的基本性质是,当掺入蛋白质时,该蛋白质与针对完全由天然存在的氨基酸组成的相同的蛋白质引发的抗体有特异反应性。
还在本文以最广义地使用的术语“多肽”和“蛋白质”指的是亚基氨基酸、氨基酸类似物或模拟肽的序列。除注释的地方之外,亚基通过肽键连接。本文描述的多肽可以是化学合成的或重组表达的。所述发明的多肽也可以是化学合成的。使用固相、液相或肽缩合技术、或其任意组合的熟知技术制备的合成多肽可以包括天然和非天然氨基酸。用于肽合成的氨基酸可以是利用Merrifield(1963,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154)的原始固相过程的标准去保护、中和、偶联和清洗方案的标准Boc(N-α-氨基保护的N-α-叔丁氧羰基)氨基酸树脂,或Carpino和Han(1972,J.Org.Chem.37:3403-3409)首先描述的碱不稳定的N-α-氨基保护的9-芴甲氧羰基(Fmoc)氨基酸。Fmoc和Boc N-α-氨基保护的氨基酸二者可以从Sigma,Cambridge Research Biochemical或本领域技术人员熟悉的其它化学公司获得。此外,可以利用本领域技术人员熟悉的其它N-α-保护基团合成多肽。可以通过本领域技术人员熟悉和例如在Stewart和Young,1984,Solid Phase Synthesis,Second Edition,PierceChemical Co.,Rockford,Ill.;Fields和Noble,1990,Int.J.Pept.Protein Res.35:161-214中提供的技术,或使用自动合成仪完成固相肽合成。本发明的多肽可以包括D-氨基酸(其在体内耐受L-氨基酸特异性蛋白酶)、D-和L-氨基酸的组合、和多种“设计的”氨基酸(例如,β-甲基氨基酸、C-α-甲基氨基酸和N-α-甲基氨基酸等)以传达特殊的性质。合成氨基酸包括针对赖氨酸的鸟氨酸,和针对亮氨酸或异亮氨酸的正亮氨酸。此外,多肽可以具有模拟肽键,比如酯键,以制备具有新性质的肽。例如,可以生成掺入减少的肽键的肽,即,R1-CH2-NH-R2,其中R1和R2是氨基酸残基或序列。减少的肽键可以介绍为二肽亚基。这样的多肽可以耐受蛋白酶活性,并且将具备延长的体内半衰期。因此,这些术语可以适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物,以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。天然存在的氨基酸的这样的类似物的基本性质是,当将掺入蛋白质时,该蛋白质与完全由天然存在的氨基酸组成的相同的蛋白质引出的抗体有特异反应性。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”还包括修饰,其包括但不限于糖基化、脂质附着、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ-羧基化、羟基化和ADP-核糖基化。将了解,如熟知且如上面记载的,多肽可以是不完全线性的。例如,多肽可以由于泛素化而是分支的,并且它们可以通常由于翻译后事件而为具有或不具有分支的环状,所述翻译后事件包括天然加工事件和不天然存在的人为操作带来的事件。也可以通过非翻译天然过程和通过完全合成方法来合成环状、分支及分支环状多肽。在一些实施方式中,肽是任意长度或大小的。
如本文使用的,术语“酶原(proenzyme)”或“酶原(zymogen)”指的是无活性酶前体。酶原需要生化改变(比如显露活性位点的水解反应,或改变构型以显露活性位点)以使其变为活性酶。生化改变通常发生于溶酶体,其中为了使其活化前体酶的特异部分被裂解。在活化后释放的氨基酸链被称为活化肽。
如本文使用的,术语“增殖”指的是通过将单个细胞连续地分裂为相同的子细胞来扩增细胞群。
如本文使用的,术语“肺间质”指的是肺的气囊周围的组织和空间。
如本文使用的,术语“肺泡”指的是具有空腔形式的解剖结构。肺泡位于肺的呼吸区,在肺泡管和肺泡前房的末端处,形成呼吸道的端点。肺泡是与血液气体交换的呼吸位点的球形露出,并且仅在哺乳动物肺中发现。肺泡膜是气体交换表面。血液携带来自身体其余部分的二氧化碳用于释放入肺泡,并且肺泡中的氧气被肺泡血管中的血液携带以传输至身体中的全部细胞。肺泡包含一些胶原和弹性纤维。当吸气时,弹性纤维允许肺泡随着其充满空气而伸展。它们然后在呼气期间回弹,以便排除富含二氧化碳的空气。在肺泡壁中存在三种主要肺泡细胞,(1)鳞状肺泡细胞,其形成肺泡壁的结构,(2)大肺泡细胞,其分泌肺表面活性物以降低水的表面张力和使得膜分离,从而增加气体交换的能力,(3)巨噬细胞,其消灭外源病原体,比如细菌。
如本文使用的,术语“ROC曲线”指的是接收器工作特性曲线,其是真阳性率对假阳性率的图。
术语“相似的”与术语类似的、等价的、或相像的可交换地使用,意思是具有共同的性状或特性。
如本文使用的,术语“溶液”指的是两种或更多种物质的均匀混合物。它通常但未必是液体。在溶液中,溶质分子(或溶解的物质)在溶剂中均一分布。
术语“可溶性”和“溶解性”指的是易于溶解于指定流体(溶剂)的性质。术语“不溶性”指的是在指定溶剂中具有最小或限制溶解性的物质的性质。在溶液中,溶质分子(或溶解的物质)在溶剂中均一分布。
如本文使用的,术语“应力纤维”指的是由肌动蛋白丝、交联蛋白(将连个或更多个丝结合在一起的蛋白质)和肌球蛋白II马达构成的细胞中的高度有序结构。肌动蛋白是球状蛋白质(~43kDa),其聚合和形成具有彼此卷绕的原丝的有序丝状结构,以形成单个“肌动蛋白丝”,又称为“微丝”。肌球蛋白马达在应力纤维中移动,其滑动肌动蛋白丝越过彼此,使得纤维可以收缩。为了收缩以生成力,纤维必须被锚定至某物。应力纤维可以锚定至细胞膜,并且通常是其中此锚定发生也连接至细胞外的结构(基质或一些其它基底)的位点。这些连接位点被称为粘着斑。许多蛋白质需要适当的粘着斑产生和维持。针对这些固定的外部基底的收缩是允许由肌球蛋白马达生成的力和丝生长和重排来移动和重塑细胞的收缩。
如本文使用的,术语“悬浮物”指的是其中细微分散的种类与另一个种类结合的分散物(混合物),而且前者被如此细微地分散和混合,使得其不迅速地沉淀。在日常生活中,最常见的悬浮物是液体中的固体。
可交换地使用的术语“对象”或“个体”或“患者”指的是哺乳动物来源的动物物种的成员,包括但不限于小鼠、大鼠、猫、山羊、绵羊、马、仓鼠、雪貂、鸭嘴兽、猪、狗、豚鼠、兔和灵长类,比如,例如,猴、猿或人。
如本文使用的,短语“需要这样的治疗的对象”指的是遭受疾病、障碍、状况或病理过程的患者。在一些实施方式中,术语“需要这样的治疗的对象”还用于指(i)将施用至少本发明的至少一种多肽;(ii)正在接受本发明的至少一种多肽;或(iii)已经接受本发明的至少一种多肽的患者,除非上下文和短语的用法另外指示。
在本文使用的术语“取代”指的是其中DNA序列中的一个或多个碱基被交换为另一个或多个碱基的情况。取代可为同义取代或非同义取代。取代可以是同义取代或非同义取代。如本文使用的,“同义取代”指的是在编码蛋白质的基因的外显子中一个碱基取代另一个碱基以使得产生的氨基酸序列未被修饰。如本文使用的“非同义取代”指的是在编码蛋白质的基因的外显子中一个碱基取代另一个碱基以使得产生的氨基酸序列被修饰。
可交换地使用的活性剂的术语“治疗量”、“有效量”或“药学有效量”指的是足以提供预期的治疗益处的量。例如,抑制所述发明的组合物的激酶的“治疗量”包括但不限于以下量,其足以:(1)移除至少一个纤维变性位置或降低其大小或(2)减小细胞外基质包括胶原和纤连蛋白沉积在肺纤维化患者的肺中的间质中的速率。术语还包含足以抑制或减轻肺纤维化患者的至少一种症状的量,其中症状包括但不限于氧饱和、呼吸困难(难以呼吸)、干咳(意思是空气从肺中突然地、嘈杂地呼出,其可能由刺激或炎症引起并且不从呼吸道移除痰)、杵状指(clubbing)(手指成为球根状外观的缺陷)、和捻发音(在吸入期间肺中的噼啪声,偶尔被称为啰音或爆裂声)。
根据所述发明可以采用的活性剂的有效量通常在大约0.001mg/kg体重至大约10g/kg体重的范围内。然而,剂量水平基于各种因素,包括损伤的类型、年龄、重量、性别、患者的医疗状况、状况的严重程度、给药的途径和频率、和采用的具体活性剂。因而给药方案可以广泛地变化,但是可以使用标准方法由医师常规地确定。
术语“治疗(treat)”或“治疗(treating)”包括废除、基本上抑制、减慢或逆转疾病、状况或障碍的进展,基本上减轻状况的临床或美容症状,基本上预防疾病、状况或障碍的临床或美容症状的出现,并且保护免受有害或恼人的症状。治疗进一步指的是实现下列中一个或多个:(a)减小障碍的严重程度;(b)限制正在治疗的障碍(一种或多种)特有的症状的发展;(c)限制正在治疗的障碍(一种或多种)特有的症状的恶化;(d)限制先前已经患有障碍(一种或多种)的患者中的障碍(一种或多种)的复发;和(e)限制先前有障碍(一种或多种)症状的患者的症状的复发。
本文使用的术语“变体”、“突变体”和“衍生物”指的是与参考核苷酸或多肽序列具有基本同一性的核苷酸或多肽序列。序列中的差异可以是在序列或结构上自然地或通过设计改变的结果。天然改变可以在特定核酸序列的正常复制或自然复制过程期间产生。设计的改变可以出于具体的目的而具体地设计并且将其引入序列。这样的具体的改变可以在体外使用各种诱变技术完成。这样具体生成的序列变体可以被称为原始序列的“突变体”或“衍生物”。
技术人员同样可以生产具有单个或多个氨基酸取代、缺失、添加或置换,但是功能上等价于SEQ ID NO:1的多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的多肽变体。这些变体尤其可以包括:(a)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸取代的变体;(b)其中添加一个或多个氨基酸的变体;(c)其中至少一个氨基酸包括取代基的变体;(d)其中来自一个物种的氨基酸残基在保守或非保守位置处被取代为另一个物种中的对应残基的变体;和(d)其中靶蛋白与另一个肽或多肽比如融合配偶体(fusion partner)、蛋白标签或其它化学部分融合的变体,其可以赋予靶蛋白有用的性质,例如,抗体的表位。用于获得这样的变体的技术包括但不限于遗传(抑制、缺失、突变等)、化学和酶技术,其是技术人员所知。如本文使用的,术语“突变”指的是生物体的基因或染色体内的DNA序列的变化,其导致产生在亲代型中未发现的新品质或性状,或通过改变编码基因的DNA的核苷酸序列或通过改变染色体的物理排列而在染色体中发生这类变化的过程。突变的三种机制包括取代(一个碱基对交换另一个碱基对)、添加(将一个或多个碱基插入序列)、和缺失(失去一个或多个碱基对)。
如本文使用的,术语“媒介”指的是促进与其混合的药物或其它材料的物质。
如本文使用的,术语“创伤愈合”或“创伤修复”通常指的是身体在创伤后修复组织的自然过程。当个体受伤时,发生一系列复杂的生化事件以修复伤害,所述生化事件包括止血、炎症、增殖和重构。
I.组合物:用于预防或治疗特征在于异常的成纤维细胞增殖和胶原沉积的疾病的治疗肽
根据一方面,所述发明提供了用于治疗特征在于对象的组织中异常的成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积的疾病、状况或过程的药物组合物,
其中药物组合物包括治疗量的氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的多肽或其功能等价物、和其药学上可接受的载体,并且
其中治疗量对减少对象的组织中的成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积是有效的。
根据一个实施方式,疾病或状况是急性肺损伤(ALI)或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。
根据另一个实施方式,疾病或状况是辐射诱发的纤维化。
根据另一个实施方式,疾病或状况是移植排斥。
根据另一个实施方式,组织是肺组织。
根据另一个实施方式,疾病或状况是间质性肺病。
根据另一个实施方式,其中疾病或状况是肺纤维化。
根据另一个实施方式,其中肺纤维化是特发性肺纤维化。
根据另一个实施方式,肺纤维化由施用博来霉素造成。
根据另一个实施方式,肺纤维化由过敏反应、吸入环境微粒、吸烟、细菌感染、病毒感染、对对象的肺的机械伤害、肺移植排斥、自身免疫障碍、遗传障碍、或其组合造成。
根据另一个实施方式,疾病或状况进一步特征在于组织中的炎症。
根据另一个实施方式,炎症是急性或慢性炎症。
根据另一个实施方式,炎症由选自肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和白介素-1β(IL-1β)的至少一种细胞因子介导。
根据另一个实施方式,肺纤维化特征在于选自以下的至少一种病理:与正常健康对照对象相比,肺间质中细胞外基质蛋白的异常沉积、肺中成纤维细胞增殖的异常促进、肺中成肌纤维细胞分化的异常诱导、和成肌纤维细胞附着至细胞外基质的异常促进。
根据另一个实施方式,组织中异常的成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积特征在于与正常健康对照对象的组织中促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的活性相比,组织中促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的异常活性。
根据另一个实施方式,组织中异常的成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积由以下证明:与正常健康对照对象的组织中活化的促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的量或分布相比,组织中活化的(磷酸化的)促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的异常的量和分布。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制选自本文在表1中列出的组的激酶的激酶活性。
根据另一个实施方式,此抑制可以,例如,对减少对象的组织中的成纤维细胞增殖、细胞外基质沉积、或其组合是有效的。
根据另一个实施方式,此抑制可以,例如,对减少选自以下的至少一种病理是有效的:与正常健康对照对象相比,肺间质中细胞外基质蛋白的异常沉积、肺中成纤维细胞增殖的异常促进、肺中成肌纤维细胞分化的异常诱导、和成肌纤维细胞附着至细胞外基质的异常促进。
根据一些实施方式,MMI抑制剂在体内的抑制概况取决于剂量、给药途径、和响应于抑制剂的细胞类型。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制激酶的至少50%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制激酶的至少65%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制该激酶的至少75%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制该激酶的至少80%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制该激酶的至少85%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制该激酶的至少90%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制该激酶的至少95%的激酶活性。
根据一些实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2激酶)的激酶活性。根据一些其它实施方式,药物组合物抑制MK2激酶的至少50%的激酶活性。根据一些其它实施方式,药物组合物抑制MK2激酶的至少65%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制MK2激酶的至少75%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制MK2激酶的至少80%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制MK2激酶的至少85%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制MK2激酶的至少90%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制MK2激酶的至少95%的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶3(MK3激酶)的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制MK3激酶的至少50%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制MK3激酶的至少65%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制MK3激酶的至少70%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制MK3激酶的至少75%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制MK3激酶的至少80%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制MK3激酶的至少85%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制MK3激酶的至少90%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制MK3激酶的至少95%的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的至少50%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的至少65%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的至少70%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的至少75%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的至少80%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的至少85%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的至少90%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的至少95%的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制BDNF/NT-3生长因子受体(TrkB)的激酶活性。根据另一个实施方式,药物进一步抑制BDNF/NT-3生长因子受体(TrkB)的至少50%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物进一步抑制BDNF/NT-3生长因子受体(TrkB)的至少65%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物进一步抑制BDNF/NT-3生长因子受体(TrkB)的至少70%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物进一步抑制BDNF/NT-3生长因子受体(TrkB)的至少75%的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的激酶活性和促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶3(MK3)的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的激酶活性和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的激酶活性和BDNF/NT-3生长因子受体(TrkB)的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的激酶活性、促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶3(MK3)的激酶活性、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的激酶活性、和BDNF/NT-3生长因子受体(TrkB)的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化蛋白激酶2(MK2)的激酶活性、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的激酶活性、和BDNF/NT-3生长因子受体(TrkB)的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的至少65%的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶3(MK3)的至少65%的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的至少65%的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制BDNF/NT-3生长因子受体(TrkB)的至少65%的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的至少65%的激酶活性和促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶3(MK3)的至少65%的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的至少65%的激酶活性和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的至少65%的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的至少65%的激酶活性和BDNF/NT-3生长因子受体(TrkB)的至少65%的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的至少65%的激酶活性、促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶3(MK3)的至少65%的激酶活性、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的至少65%的激酶活性、和BDNF/NT-3生长因子受体(TrkB)的至少65%的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制选自MK2、MK3、CaMKI、TrkB的至少一种激酶的激酶活性,而基本上不抑制从本文在表1中列出的其余组的一种或多种其它选择的激酶的活性。
根据一些实施方式,MMI抑制剂在体内的抑制概况取决于剂量、给药途径、和响应于抑制剂的细胞类型。
根据这样的实施方式,药物组合物抑制其它选择的激酶(一种或多种)的小于50%的激酶活性。根据这样的实施方式,药物组合物抑制其它选择的激酶(一种或多种)的小于65%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制其它选择的激酶(一种或多种)的小于50%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制其它选择的激酶(一种或多种)的小于40%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制其它选择的激酶(一种或多种)的小于20%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制其它选择的激酶(一种或多种)的小于15%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制其它选择的激酶(一种或多种)的小于10%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制其它选择的激酶(一种或多种)的小于5%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物增加其它选择的激酶的激酶活性。
根据前一段的实施方式,基本上不抑制的一种或多种其它选择的激酶选自Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII,包括其亚基CaMKIIδ)、原癌基因丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶(PIM-1)、细胞肉瘤(c-SRC)、脾脏酪氨酸激酶(SYK)、C-src酪氨酸激酶(CSK)、和胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)。
根据一些实施方式,药物组合物进一步包括至少一种另外的治疗剂。
根据一些这样的实施方式,另外的治疗剂选自纯化的牛V型胶原(例如,IW-001;ImmuneWorks;United Therapeutics)、IL-13受体拮抗物(例如,QAX576;Novartis)、蛋白质酪氨酸激酶抑制剂(例如,伊马替尼Craig Daniels/Novartis)、内皮受体拮抗物(例如,ACT-064992(马西替坦);Actelion)、双内皮素受体拮抗物(例如,波生坦Actelion)、前列环素类似物(吸入性伊洛前列素(例如,);Actelion)、抗CTGF单克隆抗体(例如,FG-3019)、内皮素受体拮抗物(A-选择性)(例如,安立生坦Gilead)、AB0024(Arresto)、赖氨酰氧化酶样2(LOXL2)单克隆抗体(例如,GS-6624(以前的AB0024);Gilead)、c-Jun N-末端激酶(JNK)抑制剂(例如,CC-930;Celgene)、吡非尼酮(例如,(InterMune),(Shionogi))、IFN-γ1b(例如,InterMune),针对全部三种TGF-β同种型的全中和IgG4人抗体(例如,GC1008;Genzyme)、TGF-β活化抑制剂(例如,Stromedix(STX-100))、重组人正五聚蛋白-2蛋白(rhPTX-2)(例如,PRM151;Promedior)、双特异性IL4/IL13抗体(例如,SAR156597;Sanofi)、人源化单克隆抗体靶向整合蛋白αvβ6(BIBF 1120;Boehringer Ingelheim)、N-乙酰半胱氨酸(Zambon SpA)、西地那非TNF拮抗物(例如,依那西普Pfizer)、糖皮质激素(例如,强的松、布地奈德、莫米松糠酸酯、丙酸氟替卡松和糠酸氟替卡松)、支气管扩张药(例如,白三烯改性剂(例如,孟鲁司特)、抗胆碱能支气管扩张药(例如,异丙托溴铵和噻托溴铵)、短效β2激动剂(例如,甲磺酸乙基异丙肾上腺素肾上腺素、舒喘灵/舒喘宁、和特布他林)、长效β2激动剂(例如,沙美特罗、福莫特罗、indecaterol和其组合。
根据一些其它实施方式,另外的治疗剂包括支气管扩张药,其包括但不限于白三烯改性剂、抗胆碱能支气管扩张药、β2激动剂、或其组合。
根据另一个实施方式,另外的治疗剂包括皮质类固醇,其包括但不限于强的松、布地奈德、莫米松、倍氯米松(beclemethasone)、或其组合。
根据一些其它实施方式,另外的治疗剂是抗炎性剂。
根据一些这样的实施方式,抗炎性剂是非甾体抗炎性剂。如本文使用的,术语“非甾体抗炎性剂”指的是在其作用上类似阿司匹林的一大群药剂,包括但不限于布洛芬萘普生钠和扑热息痛有用于所述发明的上下文的非甾体抗炎性剂的另外的实例非限制性地包括昔康类,比如吡罗昔康、伊索昔康、替诺昔康、舒多昔康和CP-14,304;双水杨酸、贝诺酯(benorylate)、三柳胆镁(trilisate)、safapryn、solprin、二氟尼柳和芬度柳;乙酸衍生物,比如双氯芬酸、芬氯酸、消炎痛、舒林酸、托美丁、伊索克酸、呋罗芬酸、硫平酸、齐多美辛、阿西美辛、芬替酸、佐美酸、环氯弗酸(clindanac)、奥昔平酸、联苯乙酸和酮咯酸;灭酸类(fenamates),比如甲芬那酸、甲氯芬那酸、氟芬那酸、尼氟灭酸和托芬那酸;丙酸衍生物,比如苯睧洛芬、氟比洛芬、酮洛芬、非诺洛芬、芬布芬、吲哚洛芬、吡洛芬、卡洛芬、丙嗪、普拉洛芬、咪洛芬、硫洛芬、舒洛芬、阿明洛芬和噻洛芬酸;吡唑,比如保泰松、羟布宗、非普拉宗、阿扎丙宗和曲保松。还可以采用这些非甾体抗炎性剂的混合物,以及这些药剂的皮肤病学上可接受的盐和酯。例如,依托芬那酯,氟芬那酸衍生物,对外部应用是特别有用的。
根据另一个实施方式,非甾体抗炎性剂包括转化生长因子-β3(TGF-β3)、抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)药剂、或其组合。
根据另一个实施方式,抗炎性剂是甾体抗炎性剂。如本文使用的,术语“甾体抗炎性剂”指的是包含17个碳4个环系统的众多化合物中的任一个,并且包括固醇、多种激素(如促蛋白合成类固醇)和糖苷。甾体抗炎性药物的代表性实例非限制性地包括皮质类固醇比如氢化可的松、羟基曲安西龙、α-甲基地塞米松、地塞米松-磷酸盐、二丙酸倍氯米松、戊酸氯倍他索、地奈德、去羟米松、醋酸去氧皮质酮、地塞米松、二氯松、戊酸二氟米松、氟轻可舒松(fluadrenolone)、氟氯奈德、特戊酸氟米松、氟轻可舒松缩酮(fluosinoloneacetonide)、氟轻松醋酸酯、氟可丁丁酯(flucortine butylester)、氟可龙、醋酸氟泼尼定(fluprednylidene)、氟氢缩松、哈西奈德、醋酸氢化可的松、丁酸氢化可的松、甲基泼尼松龙、曲安奈德、可的松、可托多松、醋酸氟轻松(flucetonide)、氟氢可的松、双醋二氟拉松(difluorosone diacetate)、氟轻可舒松缩酮、氟氢可的松、双醋二氟拉松(diflorosonediacetate)、氟轻可舒松缩酮、甲羟松、安西法尔(amcinafel)、安西非特、倍他米松和其酯的余量、氯化强的松、醋酸氯化强的松醋、氯可托龙(clocortelone)、地西松(clescinolone)、二氯松、二氟拨尼酯(diflurprednate)、氟二氯松、氟尼缩松、氟米龙、氟培龙、氟泼尼松龙、戊酸氢化可的松、氢化可的松环戊丙酸酯、氢可他酯、甲泼尼松、帕拉米松、泼尼松龙、强的松、二丙酸倍氯米松、曲安西龙、和其混合物。
根据另一个实施方式,甾体抗炎性剂包括选自强的松,布地奈德、莫米松、倍氯米松、和其组合的至少一种皮质类固醇。
根据另一个实施方式,另外的治疗剂包括黄嘌呤或黄嘌呤衍生物,比如甲基黄嘌呤。
根据另一个实施方式,另外的治疗剂包括嗜中性粒细胞弹性酶抑制剂。
根据另一个实施方式,另外的治疗剂是至少一种嗜中性粒细胞弹性酶抑制剂,其包括但不限于ICI 200355、ONO-5046、MR-889、L-694,458、CE-1037、GW-311616、TEI-8362、ONO-6818、AE-3763、FK-706、ICI-200,880、ZD-0892、ZD-8321、和其组合。
根据另一个实施方式,另外的治疗剂包括至少一种磷酸二酯酶抑制剂,其包括但不限于磷酸二酯酶4抑制剂。磷酸二酯酶4抑制剂的实例包括但不限于罗氟司特、西洛司特或其组合。
根据另一个实施方式,另外的治疗剂是镇痛剂。根据一些实施方式,镇痛剂通过提高痛阈而不干扰意识或改变其它感觉模式来缓解疼痛。根据一些这样的实施方式,镇痛剂是非阿片镇痛药。“非阿片镇痛药”是减少疼痛但不是阿片镇痛药的天然或合成物质。非阿片镇痛药的实例包括但不限于依托度酸、消炎痛、舒林酸、托美丁、萘丁美酮、吡罗昔康、扑热息痛、非诺洛芬、氟比洛芬、布洛芬、酮洛芬、萘普生、萘普生钠、丙嗪、阿司匹林、三水杨酸胆碱镁、二氟尼柳、甲氯芬那酸、甲芬那酸、和保泰松。根据一些其它实施方式,镇痛药是阿片镇痛药。“阿片镇痛药”、“阿片”或“麻醉性镇痛药”是与中枢神经系统中的阿片受体结合,产生对抗行为的天然或合成物质。阿片镇痛药的实例包括但不限于可待因、芬太尼、氢吗啡酮、左啡诺、哌替啶、美沙酮、吗啡、羟考酮、羟吗啡酮、丙氧芬、丁丙诺啡、布托啡诺、地佐辛、纳布啡、和喷他佐辛。
根据另一个实施方式,另外的治疗剂是抗感染剂。根据另一个实施方式,抗感染剂是抗生素药剂。如本文使用的,术语“抗生素药剂”意思是在传染病的治疗中主要使用的具有抑制细菌和其它微生物的生长或消灭细菌和其它微生物的能力的任意组化学物质。抗生素药剂的实例包括但不限于青霉素G;甲氧西林;萘夫西林;苯唑西林;氯唑西林;二氯唑西林;氨苄青霉素;阿莫西林;替卡西林;羧苄青霉素;美洛西林;阿洛西林;哌拉西林;亚胺培南;氨曲南;头孢噻酚;头孢克洛;头孢西丁;头孢呋辛;头孢尼西;头孢美唑;头孢替坦;头孢丙烯;氯碳头孢;头孢他美;头孢哌酮;头孢噻肟;头孢唑肟;头孢曲松;头孢他啶;头孢吡肟;头孢克肟;头孢泊肟;头孢磺啶;氟罗沙星;萘啶酸;诺氟沙星;环丙沙星;氧氟沙星;依诺沙星;洛美沙星;西诺沙星;多西环素;米诺环素;四环素;阿米卡星;庆大霉素;卡那霉素;奈替米星;妥布霉素;链霉素;阿奇霉素;克拉霉素;红霉素;依托红霉素;琥乙红霉素;葡庚糖酸红霉素;乳糖酸红霉素;硬脂酸红霉素;万古霉素;太古霉素;氯霉素;克林霉素;甲氧苄啶;新诺明;呋喃妥因;利福平;莫匹罗星;灭滴灵;头孢氨苄;罗红霉素;Co-amoxiclavuanate;哌拉西林和他唑巴坦的组合;和其多种盐、酸、碱和其它衍生物。抗菌抗生素药剂包括但不限于青霉素、头孢菌素、碳头孢烯、头霉素、碳青霉烯、单环β-内酰胺、氨基糖苷、糖肽、喹诺酮、四环素、大环内脂、和氟喹诺酮。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制在对象的肺中发生的炎症。根据另一个实施方式,炎症是急性炎症。根据另一个实施方式,炎症是慢性炎症。根据另一个实施方式,炎症由肿瘤坏死因子-α(TNF-α)介导。根据另一个实施方式,炎症由白介素-6(IL-6)介导。根据另一个实施方式,炎症由白介素-1β(IL-1β)介导。
根据另一个实施方式,与对照相比,药物组合物调节肺中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的量。根据另一个实施方式,与对照相比,药物组合物调节肺中白介素-6(IL-6)的量。根据另一个实施方式,与对照相比,药物组合物调节肺中白介素-1β(IL-1β)的量。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制热休克27kDa蛋白1(HSPB1)的活性。根据另一个实施方式,被药物组合物抑制的HSPB1的活性是成纤维细胞增殖的异常诱导。根据另一个实施方式,被药物组合物抑制的HSPB1的活性是成肌纤维细胞分化的异常诱导。根据另一个实施方式,被药物组合物抑制的HSPB1的活性是细胞外基质蛋白沉积入肺间质。根据另一个实施方式,细胞外基质蛋白是胶原。根据另一个实施方式,被药物组合物抑制的HSPB1的活性是纤维变性位置形成的促进。根据另一个实施方式,被药物组合物抑制的HSPB1的活性是成肌纤维细胞收缩活性的增加。根据另一个实施方式,被药物组合物抑制的HSPB1的活性是成肌纤维细胞附着至细胞外基质的促进。
根据一些实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物与氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)具有基本序列同一性。
根据另一个实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物与氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)具有至少70%序列同一性。根据另一个实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物与氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)具有至少80%序列同一性。根据另一个实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物与氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)具有至少90%序列同一性。根据另一个实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物与氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)具有至少95%序列同一性。
根据另一个实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物具有氨基酸序列FAKLAARLYRKALARQLGVAA(SEQ ID NO:3)。
根据另一个实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物具有氨基酸序列KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA(SEQ ID NO:4)。
根据另一个实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物具有氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLAVA(SEQ ID NO:5)。
根据另一个实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物具有氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVA(SEQ ID NO:6)。
根据另一个实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物具有氨基酸序列HRRIKAWLKKIKALARQLGVAA(SEQ ID NO:7)。
根据一些其它实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物是包括可操作地连接至第二多肽的第一多肽的融合蛋白,其中第一多肽具有氨基酸序列YARAAARQARA(SEQ ID NO:11),并且第二多肽包括治疗结构域,其序列与氨基酸序列KALARQLGVAA(SEQ ID NO:2)具有基本同一性。
根据一些这样的实施方式,第二多肽与氨基酸序列KALARQLGVAA(SEQ ID NO:2)具有至少70%序列同一性。根据一些其它实施方式,第二多肽与氨基酸序列KALARQLGVAA(SEQID NO:2)具有至少80%序列同一性。根据一些其它实施方式,第二多肽与氨基酸序列KALARQLGVAA(SEQ ID NO:2)具有至少90%序列同一性。根据一些其它实施方式,第二多肽与氨基酸序列KALARQLGVAA(SEQ ID NO:2)具有至少95%序列同一性。
根据一些实施方式,第二多肽是氨基酸序列KALARQLAVA(SEQ ID NO:8)的多肽。
根据另一个实施方式,第二多肽是氨基酸序列KALARQLGVA(SEQ ID NO:9)的多肽。
根据另一个实施方式,第二多肽是氨基酸序列KALARQLGVAA(SEQ ID NO:10)的多肽。
根据一些其它实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物是包括可操作地连接至第二多肽的第一多肽的融合蛋白,其中第一多肽包括在功能上等价于YARAAARQARA(SEQ ID NO:11)的细胞穿透肽,并且第二多肽具有氨基酸序列KALARQLGVAA(SEQ ID NO:2)。
根据另一个实施方式,第一多肽是氨基酸序列WLRRIKAWLRRIKA(SEQ ID NO:12)的多肽。根据另一个实施方式,第一多肽是氨基酸序列WLRRIKA(SEQ ID NO:13)的多肽。根据另一个实施方式,第一多肽是氨基酸序列YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:14)的多肽。根据另一个实施方式,第一多肽是氨基酸序列WLRRIKAWLRRI(SEQ ID NO:15)的多肽。根据另一个实施方式,第一多肽是氨基酸序列FAKLAARLYR(SEQ ID NO:16)的多肽。根据另一个实施方式,第一多肽是氨基酸序列KAFAKLAARLYR(SEQ ID NO:17)的多肽。根据另一个实施方式,第一多肽是氨基酸序列HRRIKAWLKKI(SEQ ID NO:18)的多肽。
根据另一方面,所述发明还提供了分离的核酸,其编码与氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)具有至少70%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。根据一些实施方式,分离的核酸编码与氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)具有至少80%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。根据一些其它实施方式,分离的核酸编码与氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)具有至少90%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。根据一些其它实施方式,分离的核酸编码与氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)具有至少95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约100mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.00001mg/kg体重至大约100mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.0001mg/kg体重至大约100mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.001mg/kg体重至大约10mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.01mg/kg体重至大约10mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.1mg/kg(或100μg/kg)体重至大约10mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约1mg/kg体重至大约10mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约10mg/kg体重至大约100mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约2mg/kg体重至大约10mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约3mg/kg体重至大约10mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约4mg/kg体重至大约10mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约5mg/kg体重至大约10mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约60mg/kg体重至大约100mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约70mg/kg体重至大约100mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约80mg/kg体重至大约100mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约90mg/kg体重至大约100mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约90mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约80mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约70mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约60mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约50mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约40mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,治疗性抑制肽的治疗量的具有从大约0.000001mg/kg体重至大约30mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约20mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约10mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约1mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约0.1mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约0.1mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约0.01mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约0.001mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约0.0001mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约0.00001mg/kg体重的量。
根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在1μg/kg/天至25μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在1μg/kg/天至2μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在2μg/kg/天至3μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在3μg/kg/天至4μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物的治疗性抑制肽的治疗剂量在4μg/kg/天至5μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在5μg/kg/天至6μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在6μg/kg/天至7μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在7μg/kg/天至8μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在8μg/kg/天至9μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在9μg/kg/天至10μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在1μg/kg/天至5μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在5μg/kg/天至10μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在10μg/kg/天至15μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在15μg/kg/天至20μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在25μg/kg/天至30μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在30μg/kg/天至35μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在35μg/kg/天至40μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在40μg/kg/天至45μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在45μg/kg/天至50μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在50μg/kg/天至55μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在55μg/kg/天至60μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在60μg/kg/天至65μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在65μg/kg/天至70μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在70μg/kg/天至75μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在80μg/kg/天至85μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在85μg/kg/天至90μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在90μg/kg/天至95μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在95μg/kg/天至100μg/kg/天的范围内。
根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量是1μg/kg/天。
根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量是2μg/kg/天。
根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量是5μg/kg/天。
根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量是10μg/kg/天。
根据一些实施方式,本发明的多肽包括D-氨基酸(其在体内耐受L-氨基酸特异性蛋白酶)、D-和L-氨基酸的组合、和多种“设计的”氨基酸(例如,β-甲基氨基酸、C-α-甲基氨基酸和N-α-甲基氨基酸等)以传达特殊的性质。合成氨基酸取代的实例包括鸟氨酸取代赖氨酸,和正亮氨酸取代亮氨酸或异亮氨酸。
根据一些实施方式,多肽可以被连接至其它化合物以促进增加的体内半衰期,比如聚乙二醇或葡聚糖。这样的连接可以是共价的或非共价的,如本领域技术人员所理解的。根据一些其它实施方式,多肽可以被包裹在微团比如由聚(乙二醇)-聚(聚丙二醇)或聚(乙二醇)-聚乳酸嵌段共聚物制造的微团中。根据一些其它实施方式,多肽可以被包裹在由可降解的聚酯包括但不限于,聚乳酸、聚乙交酯和聚己酸内酯组成的可降解的纳米颗粒或微粒中。
根据另一个实施方式,多肽可以以固体形式(包括颗粒剂、粉末或栓剂)或液体形式(例如,溶液、悬浮液或乳液)制备。
根据另一个实施方式,所述发明的组合物可以是可分散的干粉的形式,以便通过吸入或吹入递送(分别通过嘴或通过鼻)。干粉组合物可以通过本领域已知的工艺制备,比如冻干和气流粉碎,如在国际专利公布号WO 91/16038中公开的和如在美国专利号6,921,527中公开的,其公开内容通过引用并入。所述发明的组合物以足以给对象提供单位剂量治疗的量放置在合适的剂量容器内。剂量容器是以下容器:在合适的吸入装置内适配以允许通过散布入气流来气溶胶化干粉组合物,从而形成气溶胶并且然后在腔室中捕获如此产生的气溶胶,所述腔室具有附加的衔口,以便需要治疗的对象的随后的吸入。这样的剂量容器包括本领域已知的封装组合物的任意容器比如明胶或塑料胶囊,其具有允许气流(例如,空气)导向进入容器以分散干粉组合物的可移除的部分。这样的容器由在美国专利号4,227,522;美国专利号4,192,309;和美国专利号4,105,027中显示的那些例证。合适的容器还包括与Glaxo的Rotohaler牌粉末吸入器或Fison的牌粉末吸入器共同使用的那些。提供优良防潮层的另一种合适的单位剂量容器由铝箔层压塑料形成。基于药物的粉末按重量计或按体积计填充入可成形的箔中的凹陷,并且利用覆箔-层压塑料密封。与粉末吸入装置一起使用的这样的容器描述在美国专利号4,778,054中,并且与Glaxo的(美国专利号4,627,432;4,811,731;和5,035,237)一起使用。全部这些参考文献通过引用以其全部并入本文。
根据另一个实施方式,所述发明的组合物的载体包括释放剂,比如缓释或延释载体。在这样的实施方式中,载体可以是能够缓释或延释多肽以提供更高效的施用的任意物质,例如,导致多肽的更不频繁和/或降低的剂量,提高操作的便利,并且延长或延迟对正在治疗、预防或促进的疾病、障碍、状况、综合征等的作用。这样的载体的非限制性实例包括天然和合成聚合物等的脂质体、微海绵、微球、或微胶囊。脂质体可以由各种磷脂形成,包括但不限于,胆固醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱。
用于合成和制备小肽的方法是本领域熟知的,并且公开在例如美国专利号5,352,461;5,503,852;6,071,497;6,331,318;6,428,771和美国公布号20060040953中。美国专利号6,444,226和6,652,885描述了为了使活性剂与颗粒结合,在向其中添加活性剂的溶液的水性悬浮液中制备和提供二酮哌嗪的微粒。这些专利进一步描述了通过冻干移除液体介质以产生包括活性剂的微粒的方法。改变这样的悬浮液的溶剂条件以促进活性剂与颗粒的结合公开在美国申请号60/717,524;11/532,063;和11/532,065;美国专利号6,440,463;和美国申请号11/210,709和11/208,087中。这些专利和专利申请中的每个通过引用并入本文。
在一些实施方式中,本发明的MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)和其功能等价物可以通过在例如美国申请号11/678,046(通过引用并入本文)中公开的喷雾干燥的方法干燥。
在又另一个实施方式中,本发明的多肽可以应用于各种溶液。合适的制剂是无菌的,溶解足够量的多肽,并且对提出的应用无害。例如,所述发明的组合物可以配制为水性悬浮液,其中活性成分(一种或多种)在与适于制造水性悬浮液的赋形剂的掺合物中。
这样的赋形剂非限制性地包括悬浮剂(例如,羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶),分散或湿润剂,其包括天然存在的磷脂(例如,卵磷脂)、或环氧烷烃与脂肪酸的缩合产物(例如,聚氧乙烯硬脂酸酯)、或环氧烷烃与长链脂肪醇的缩合产物(例如,十七碳乙烯氧基鲸蜡醇(heptadecaethyl-eneoxycetanol))、或环氧烷烃与源自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(例如,聚氧乙烯山梨醇单油酸酯)、或环氧烷烃与源自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如,聚乙烯失水山梨醇单油酸酯)。
所述发明的组合物还可以通过在植物油(例如,花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或在矿物油(例如,液体石蜡)中悬浮活性成分配制为油性悬浮液。油性悬浮液可以包含增稠剂(例如,蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇)。
所述发明的组合物还可以通过添加水以适于制备水性悬浮液的可分散的粉末或颗粒剂的形式配制。这样的粉末和颗粒剂中的活性成分提供在与分散或湿润剂、悬浮剂、和一种或多种防腐剂的掺合物中。合适的分散或湿润剂和悬浮剂由上面已经提及的那些例证。还可以存在另外的赋形剂。
根据一些实施方式,干粉由喷雾干燥过程产生。
根据一些其它实施方式,干粉由微粉化产生。
根据另一个实施方式,干粉包括具有1至5微米的质量中值空气动力学直径(MMAD)的微粒。
根据另一个实施方式,干粉包括具有大约2微米的质量中值空气动力学直径(MMAD)的微粒。
根据另一个实施方式,药物组合物包装在吸入装置中,包括,例如,不限于喷雾器、定量吸入器(MDI)、和干粉吸入器(DPI)。
根据一些其它实施方式,药物组合物是使用喷雾器进行气溶胶递送的液体。根据一些这样的实施方式,药物组合物的流量是至少0.3ml/min,并且药物组合物被递送为2mm颗粒,分布入最深的肺泡。
所述发明的组合物还可以是乳液的形式。乳液是通过结合两种不混溶的液体载体制备的两相系统,其中的一个贯穿另一个均匀地散开(disburse)并且由小球构成,所述小球的直径等于或大于最大的胶体颗粒的直径。小球大小是关键的,并且必须使得系统实现最大稳定性。通常,两个相的分离将不会发生,除非掺入第三种物质,乳化剂。因而,基本的乳液包含至少三种组分,两种不混溶的液体载体和乳化剂,以及活性成分。大多数乳液将水相掺入非水相(或反之亦然)。然而,制备基本上非水性的乳液是可能的,例如,非水性不混溶系统甘油和橄榄油的阴离子和阳离子表面活性剂。因而,本发明的组合物可以是水包油乳液的形式。油相可以是植物油,例如,橄榄油或花生油,或矿物油,例如液体石蜡,或其混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的树胶,例如,阿拉伯树胶或黄蓍胶,天然存在的磷脂,例如大豆、卵磷脂,和源自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯,例如失水山梨醇单油酸酯,和偏酯与环氧乙烷的缩合产物,例如,聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯。
根据一些实施方式,所述发明的多肽是化学合成的。使用固相、液相或肽缩合技术、或其任意组合的熟知技术制备的这样的合成多肽可以包括天然或非天然氨基酸。用于肽合成的氨基酸可以是利用Merrifield(1963,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154)的原始固相过程的标准去保护、中和、偶联和清洗方案的标准Boc(N-α-氨基保护的N-α-叔丁氧羰基)氨基酸树脂,或Carpino和Han(1972,J.Org.Chem.37:3403-3409)首先描述的碱不稳定的N-α-氨基保护的9-芴甲氧羰基(Fmoc)氨基酸。Fmoc和Boc N-α-氨基保护的氨基酸二者可以从Sigma,Cambridge Research Biochemical或本领域技术人员熟悉的其它化学公司获得。此外,可以利用本领域技术人员熟悉的其它N-α-保护基团合成多肽。可以通过本领域技术人员熟悉和例如在Stewart和Young,1984,Solid Phase Synthesis,Second Edition,PierceChemical Co.,Rockford,Ill.;Fields和Noble,1990,Int.J.Pept.Protein Res.35:161-214中提供的技术,或使用自动合成仪完成固相肽合成,每个通过引用以其全部并入本文。
II.用于预防或治疗特征在于异常的成纤维细胞增殖和胶原沉积的疾病的方法
根据另一方面,所述发明提供了用于治疗特征在于对象的组织中异常的成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积的疾病、状况或过程的方法,方法包括:
施用药物组合物至对象,所述药物组合物包括治疗量的氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的多肽或其功能等价物、和其药学上可接受的载体,
其中治疗量对减少对象的组织中的成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积是有效的。
根据方法的一个实施方式,疾病或状况是急性肺损伤(ALI)或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。
根据另一个实施方式,疾病或状况是辐射诱发的纤维化。
根据另一个实施方式,疾病或状况是移植排斥。
根据另一个实施方式,组织是肺组织。
根据另一个实施方式,疾病或状况是间质性肺病。
根据另一个实施方式,疾病或状况是肺纤维化。
根据另一个实施方式,肺纤维化是特发性肺纤维化。
根据另一个实施方式,肺纤维化由施用博来霉素造成。
根据另一个实施方式,肺纤维化由过敏反应、吸入环境微粒、吸烟、细菌感染、病毒感染、对对象的肺的机械伤害、肺移植排斥、自身免疫障碍、遗传障碍、或其组合造成。
根据另一个实施方式,疾病或状况是进一步特征在于组织中的炎症。
根据另一个实施方式,炎症是急性或慢性炎症。
根据另一个实施方式,炎症由选自肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和白介素-1β(IL-1β)的至少一种细胞因子介导。
根据另一个实施方式,肺纤维化特征在于选自以下的至少一种病理:与正常健康对照对象相比,肺间质中细胞外基质蛋白的异常沉积、肺中成纤维细胞增殖的异常促进、肺中成肌纤维细胞分化的异常诱导、和成肌纤维细胞附着至细胞外基质的异常促进。
根据另一个实施方式,组织中异常的成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积特征在于与正常健康对照对象的组织中促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的活性相比,组织中促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的异常活性。
根据另一个实施方式,组织中异常的成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积由以下证明:与正常健康对照对象的组织中活化的促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的量或分布相比,组织中活化的(磷酸化的)促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的异常的量和分布。
根据另一个实施方式,肺纤维化特征在于选自以下的至少一种病理:与正常健康对照对象相比,肺间质中细胞外基质蛋白的异常沉积、肺中成纤维细胞增殖的异常促进、肺中成肌纤维细胞群分化为成肌纤维细胞群的异常诱导、和成肌纤维细胞附着至细胞外基质的异常促进。
根据另一个实施方式,疾病或状况是慢性阻塞性肺病(COPD)。根据另一个实施方式,慢性阻塞性肺病(COPD)由吸烟造成。根据另一个实施方式,慢性阻塞性肺病(COPD)由环境微粒造成。根据另一个实施方式,慢性阻塞性肺病(COPD)由α-1抗胰蛋白酶缺陷造成。根据另一个实施方式,慢性阻塞性肺病(COPD)由儿童期呼吸感染造成。
根据另一个实施方式,肺纤维化特征在于与正常健康对照对象相比,对象的肺中热休克27kDa蛋白1(HSPB1)的异常活性。根据另一个实施方式,HSPB1的异常活性是与正常健康对照对象相比,对象的肺间质中细胞外基质蛋白的异常沉积。根据另一个实施方式,细胞外基质蛋白是胶原。根据另一个实施方式,HSPB1的异常活性是与正常健康对照对象相比肺中成纤维细胞增殖的异常促进。根据另一个实施方式,HSPB1的异常活性是与正常健康对照对象相比肺中成肌纤维细胞分化的异常诱导。根据另一个实施方式,HSPB1的异常活性是与正常健康对照对象相比肺中纤维变性位置形成的促进。根据另一个实施方式,HSPB1的异常活性是与正常健康对照对象相比肺中成肌纤维细胞收缩活性的增加。根据另一个实施方式,HSPB1的异常活性是与正常健康对照对象相比肺中成肌纤维细胞附着至细胞外基质的异常促进。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制在对象的肺中发生的炎症。根据另一个实施方式,炎症是急性炎症。根据另一个实施方式,炎症是慢性炎症。根据另一个实施方式,炎症由肿瘤坏死因子-α(TNF-α)介导。根据另一个实施方式,炎症由白介素-1β(IL-1β)介导。根据另一个实施方式,炎症由白介素-6(IL-6)介导。
根据另一个实施方式,与对照相比,药物组合物调节对象的肺中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的量。根据另一个实施方式,与对照相比,药物组合物调节对象的肺中白介素-1β(IL-1β)的量。根据另一个实施方式,与对照相比,药物组合物调节对象的肺中白介素-6(IL-6)的量。
根据另一个实施方式,与对象的肺中的正常健康对照对象相比,药物组合物抑制HSPB1的异常活性。根据另一个实施方式,HSPB1的异常活性是与正常健康对照对象相比肺间质中细胞外基质蛋白的异常沉积。根据另一个实施方式,细胞外基质蛋白是胶原。根据另一个实施方式,HSPB1的异常活性是与正常健康对照对象相比肺中成纤维细胞增殖的异常促进。根据另一个实施方式,HSPB1的异常活性是与正常健康对照对象相比肺中成纤维细胞分化为成肌纤维细胞的异常诱导。根据另一个实施方式,HSPB1的异常活性是与正常健康对照对象相比纤维变性位置形成的异常促进。根据另一个实施方式,HSPB1的异常活性是与正常健康对照对象相比成肌纤维细胞的收缩活性的异常增加。根据另一个实施方式,与正常健康对照对象相比,成肌纤维细胞收缩活性特征在于升高水平的α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)。根据另一个实施方式,与正常健康对照对象相比,成肌纤维细胞收缩活性特征在于应力纤维形成的增加。根据另一个实施方式,HSPB1的异常活性是与正常健康对照对象相比成肌纤维细胞附着至细胞外基质的异常促进。
根据一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2激酶)的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制MK2激酶的至少50%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制MK2激酶的至少65%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制MK2激酶的至少75%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制MK2激酶的至少80%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制MK2激酶的至少85%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制MK2激酶的至少90%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制MK2激酶的至少95%的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶3(MK3激酶)的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制MK3激酶的至少50%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制MK3激酶的至少65%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制MK3激酶的至少70%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制MK3激酶的至少75%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制MK3激酶的至少80%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制MK3激酶的至少85%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制MK3激酶的至少90%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制MK3激酶的至少95%的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的至少50%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的至少65%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的至少70%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的至少75%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的至少80%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的至少85%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的至少90%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的至少95%的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制BDNF/NT-3生长因子受体(TrkB)的激酶活性。根据另一个实施方式,药物进一步抑制BDNF/NT-3生长因子受体(TrkB)的至少50%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物进一步抑制BDNF/NT-3生长因子受体(TrkB)的至少65%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物进一步抑制BDNF/NT-3生长因子受体(TrkB)的至少70%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物进一步抑制BDNF/NT-3生长因子受体(TrkB)的至少75%的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的激酶活性和促分裂原活化蛋白激酶-活化蛋白激酶3(MK3)的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的激酶活性和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的激酶活性和BDNF/NT-3生长因子受体(TrkB)的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的激酶活性、促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶3(MK3)的激酶活性、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的激酶活性、和BDNF/NT-3生长因子受体(TrkB)的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的激酶活性、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的激酶活性、和BDNF/NT-3生长因子受体(TrkB)的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的至少65%的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶3(MK3)的至少65%的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的至少65%的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制BDNF/NT-3生长因子受体(TrkB)的至少65%的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的至少65%的激酶活性和促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶3(MK3)的至少65%的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的至少65%的激酶活性和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的至少65%的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的至少65%的激酶活性和BDNF/NT-3生长因子受体(TrkB)的至少65%的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的至少65%的激酶活性、促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶3(MK3)的至少65%的激酶活性、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的至少65%的激酶活性、和BDNF/NT-3生长因子受体(TrkB)的至少65%的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制选自MK2、MK3、CaMKI、TrkB的至少一种激酶的激酶活性,而基本上不抑制来自本文在表1中列出的其余组的一种或多种其它选择的激酶的活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制选自本文在表1中列出的组的激酶的激酶活性。
根据另一个实施方式,此抑制可以,例如,对减少对象的组织中的成纤维细胞增殖、细胞外基质沉积、或其组合是有效的。
根据另一个实施方式,此抑制可以,例如,对减少选自以下的至少一种病理是有效的:与正常健康对照对象相比,肺间质中细胞外基质蛋白的异常沉积、肺中成纤维细胞增殖的异常促进、成肌纤维细胞分化的异常诱导、和成肌纤维细胞附着至细胞外基质的异常促进。
根据一些实施方式,MMI抑制剂在体内的抑制概况取决于剂量、给药途径、和响应于抑制剂的细胞类型。
根据这样的实施方式,药物组合物抑制其它选择的激酶(一种或多种)的小于50%的激酶活性。根据这样的实施方式,药物组合物抑制其它选择的激酶(一种或多种)的小于65%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制其它选择的激酶(一种或多种)的小于50%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制其它选择的激酶(一种或多种)的小于40%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制其它选择的激酶(一种或多种)的小于20%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制其它选择的激酶(一种或多种)的小于15%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制其它选择的激酶(一种或多种)的小于10%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制其它选择的激酶(一种或多种)的小于5%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物增加其它选择的激酶的激酶活性。
根据前一段的实施方式,基本上不抑制的一种或多种其它选择的激酶选自Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII,包括其亚基CaMKIIδ)、原癌基因丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶(PIM-1)、细胞肉瘤(c-SRC)、脾脏酪氨酸激酶(SYK)、C-src酪氨酸激酶(CSK)、和胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)。
根据一些实施方式,药物组合物进一步包括另外的治疗剂。
根据一些这样的实施方式,另外的治疗剂选自纯化的牛V型胶原(例如,IW-001;ImmuneWorks;United Therapeutics)、IL-13受体拮抗物(例如,QAX576;Novartis)、蛋白质酪氨酸激酶抑制剂(例如,伊马替尼Craig Daniels/Novartis)、内皮受体拮抗物(例如,ACT-064992(马西替坦);Actelion)、双内皮素受体拮抗物(例如,波生坦Actelion)、前列环素类似物(吸入性伊洛前列素(例如,);Actelion)、抗CTGF单克隆抗体(例如,FG-3019)、内皮素受体拮抗物(A-选择性)(例如,安立生坦Gilead)、AB0024(Arresto)、赖氨酰氧化酶样2(LOXL2)单克隆抗体(例如,GS-6624(以前的AB0024);Gilead)、c-Jun N-末端激酶(JNK)抑制剂(例如,CC-930;Celgene)、吡非尼酮(例如,(InterMune)、(Shionogi))、IFN-γ1b(例如,InterMune)、针对全部三种TGF-β同种型的全中和IgG4人抗体(例如,GC1008;GENZYME)、TGF-β活化抑制剂(例如,Stromedix(STX-100))、重组人正五聚蛋白-2蛋白(rhPTX-2)(例如,PRM151;Promedior)、双特异性IL4/IL13抗体(例如,SAR156597;Sanofi)、人源化单克隆抗体靶向整合蛋白αvβ6(BIBF 1120;Boehringer Ingelheim)、N-乙酰半胱氨酸(Zambon SpA)、西地那非TNF拮抗物(例如,依那西普Pfizer)、糖皮质激素(例如,强的松、布地奈德、莫米松糠酸酯、丙酸氟替卡松和糠酸氟替卡松)、支气管扩张药(例如,白三烯改性剂(例如,孟鲁司特)、抗胆碱能支气管扩张药(例如,异丙托溴铵和噻托溴铵)、短效β2激动剂(例如,甲磺酸乙基异丙肾上腺素肾上腺素、舒喘灵/舒喘宁和特布他林)、长效β2激动剂(例如,沙美特罗、福莫特罗、indecaterol和其组合。
根据一些其它实施方式,另外的治疗剂包括支气管扩张药,其包括但不限于白三烯改性剂、抗胆碱能支气管扩张药、β2激动剂、或其组合。
根据另一个实施方式,另外的治疗剂包括皮质类固醇,其包括但不限于强的松、布地奈德、莫米松、倍氯米松、或其组合。
根据一些其它实施方式,另外的治疗剂包括支气管扩张药,其包括但不限于白三烯改性剂、抗胆碱能支气管扩张药、β2激动剂、或其组合。
根据另一个实施方式,另外的治疗剂包括皮质类固醇,其包括但不限于强的松、布地奈德、莫米松、倍氯米松、或其组合。
根据另一个实施方式,另外的治疗剂是抗炎性剂。
根据另一个实施方式,抗炎性剂是非甾体抗炎性剂。还可以采用非甾体抗炎性剂的混合物,以及这些药剂的皮肤病学上可接受的盐和酯。例如,依托芬那酯,氟芬那酸衍生物,对外部应用是特别有用的。
根据另一个实施方式,其中非甾体抗炎性剂包括转化生长因子-β3(TGF-β3)、抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)药剂、或其组合。
根据另一个实施方式,抗炎性剂是甾体抗炎性剂。根据另一个实施方式,甾体抗炎性剂包括选自强的松、布地奈德、莫米松、倍氯米松、和其组合的至少一种皮质类固醇。
根据另一个实施方式,另外的治疗剂包括甲基黄嘌呤。
根据另一个实施方式,另外的治疗剂包括嗜中性粒细胞弹性酶抑制剂。
根据另一个实施方式,另外的治疗剂是至少一种嗜中性粒细胞弹性酶抑制剂,其包括但不限于ICI 200355、ONO-5046、MR-889、L-694,458、CE-1037、GW-311616、TEI-8362、ONO-6818、AE-3763、FK-706、ICI-200,880、ZD-0892、ZD-8321、和其组合。
根据另一个实施方式,另外的治疗剂包括至少一种磷酸二酯酶抑制剂,其包括但不限于磷酸二酯酶4抑制剂。磷酸二酯酶4抑制剂的实例包括但不限于罗氟司特、西洛司特或其组合。
根据另一个实施方式,另外的治疗剂是镇痛剂。根据一些这样的实施方式,镇痛剂是非阿片镇痛药。根据一些其它实施方式,镇痛药是阿片镇痛药。
根据另一个实施方式,另外的治疗剂是抗感染剂。根据另一个实施方式,抗感染剂是抗生素药剂。
根据一些实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物与氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)具有基本序列同一性。
根据一些这样的实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物与氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)具有至少70%序列同一性。根据另一个实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物与氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)具有至少80%序列同一性。根据另一个实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物与氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)具有至少90%序列同一性。根据另一个实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物与氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)具有至少95%序列同一性。
根据另一个实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物具有氨基酸序列FAKLAARLYRKALARQLGVAA(SEQ ID NO:3)。
根据另一个实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物具有氨基酸序列KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA(SEQ ID NO:4)。
根据另一个实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物具有氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLAVA(SEQ ID NO:5)。
根据另一个实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物具有氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVA(SEQ ID NO:6)。
根据另一个实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物具有氨基酸序列HRRIKAWLKKIKALARQLGVAA(SEQ ID NO:7)。
根据一些其它实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物是包括可操作地连接至第二多肽的第一多肽的融合蛋白,其中第一多肽是氨基酸序列YARAAARQARA(SEQ ID NO:11),并且第二多肽包括治疗结构域,其序列与氨基酸序列KALARQLGVAA(SEQ ID NO:2)具有基本同一性。
根据另一个实施方式,第二多肽与氨基酸序列KALARQLGVAA(SEQ ID NO:2)具有至少70%序列同一性。根据一些其它实施方式,第二多肽与氨基酸序列KALARQLGVAA(SEQ IDNO:2)具有至少80%序列同一性。根据一些其它实施方式,第二多肽与氨基酸序列KALARQLGVAA(SEQ ID NO:2)具有至少90%序列同一性。根据一些其它实施方式,第二多肽与氨基酸序列KALARQLGVAA(SEQ ID NO:2)具有至少95%序列同一性。
根据另一个实施方式,第二多肽是氨基酸序列KALARQLAVA(SEQ ID NO:8)的多肽。
根据另一个实施方式,第二多肽氨基酸序列KALARQLGVA(SEQ ID NO:9)的多肽。
根据另一个实施方式,第二多肽是氨基酸序列KALARQLGVAA(SEQ ID NO:10)的多肽。
根据一些实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物是包括可操作地连接至第二多肽的第一多肽的融合蛋白,其中第一多肽包括在功能上等价于YARAAARQARA(SEQ ID NO:11)的细胞穿透肽,并且第二多肽具有氨基酸序列KALARQLGVAA(SEQ ID NO:2),并且药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化蛋白激酶2(MK2)的激酶活性。
根据另一个实施方式,第一多肽是氨基酸序列WLRRIKAWLRRIKA(SEQ ID NO:12)的多肽。
根据另一个实施方式,第一多肽是氨基酸序列WLRRIKA(SEQ ID NO:13)的多肽。
根据另一个实施方式,第一多肽是氨基酸序列YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:14)的多肽。
根据另一个实施方式,第一多肽是氨基酸序列WLRRIKAWLRRI(SEQ ID NO:15)的多肽。
根据另一个实施方式,第一多肽是氨基酸序列FAKLAARLYR(SEQ ID NO:16)的多肽。根据一些这样的实施方式,第一多肽是氨基酸序列KAFAKLAARLYR(SEQ ID NO:17)的多肽。根据一些这样的实施方式,第一多肽是氨基酸序列HRRIKAWLKKI(SEQ ID NO:18)的多肽。
根据另一方面,所述发明还提供了分离的核酸,其编码与氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)具有至少70%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
根据一些这样的实施方式,分离的核酸编码与氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)具有至少80%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。根据一些其它实施方式,分离的核酸编码与氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ IDNO:1)具有至少90%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。根据一些其它实施方式,分离的核酸编码与氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)具有至少95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
根据另一个实施方式,施用的步骤可以口服、含服、胃肠外、外用,通过吸入或吹入、或直肠来全身发生,或可以通过比如而不限于注射、植入、移植、外部施加、或胃肠外的手段局部发生。可以进行另外的施用,例如,静脉内、经粘膜、经皮、肌肉内、皮下、气管内(包括通过肺吸入)、腹膜内、鞘内、淋巴内、病灶内、或硬膜外。可以作为单独的单位剂量或以包括多种药物和/或物质的多单位剂量的治疗方案的形式进行施用,例如,一次、多次、和/或在一个或多个延长期内。
根据一些其它实施方式,施用的步骤作为单一剂量发生一次。根据一些其它实施方式,施用的步骤作为时间周期内的多个剂量进行。根据一些这样的实施方式,时间周期是一天、一周、一个月、一个月、一年、或其倍数。根据一些实施方式,施用的步骤每天进行持续至少一周的时期。根据一些实施方式,施用的步骤每周进行持续至少一个月的时期。根据一些实施方式,施用的步骤每月进行持续至少两个月的时期。根据另一个实施方式,施用的步骤在至少一年的时期内重复进行。根据另一个实施方式,施用的步骤每月进行至少一次。根据另一个实施方式,施用的步骤每周进行至少一次。根据另一个实施方式,施用的步骤每天进行至少一次。
根据一些其它实施方式,治疗量的药物组合物经由吸入装置施用。可以用于施用药物组合物的吸入装置的实例包括但不限于喷雾器、定量吸入器(MDI)、干粉吸入器(DPI)、和干粉喷雾器。
根据另一个实施方式,干粉包括具有1至5微米的质量中值空气动力学直径(MMAD)的微粒。根据另一个实施方式,干粉包括具有大约2微米的质量中值空气动力学直径(MMAD)的微粒。
根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约100mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.00001mg/kg体重至大约100mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.0001mg/kg体重至大约100mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.001mg/kg体重至大约10mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.01mg/kg体重至大约10mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.1mg/kg(或100μg/kg)体重至大约10mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约1mg/kg体重至大约10mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约10mg/kg体重至大约100mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约2mg/kg体重至大约10mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约3mg/kg体重至大约10mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约4mg/kg体重至大约10mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约5mg/kg体重至大约10mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约60mg/kg体重至大约100mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约70mg/kg体重至大约100mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约80mg/kg体重至大约100mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约90mg/kg体重至大约100mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约90mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约80mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约70mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约60mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约50mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约40mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约30mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约20mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约10mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约1mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约0.1mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约0.1mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约0.01mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约0.001mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约0.0001mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约0.00001mg/kg体重的量。
根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在1μg/kg/天至25μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在1μg/kg/天至2μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在2μg/kg/天至3μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在3μg/kg/天至4μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物的治疗性抑制肽的治疗剂量在4μg/kg/天至5μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在5μg/kg/天至6μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在6μg/kg/天至7μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在7μg/kg/天至8μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在8μg/kg/天至9μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在9μg/kg/天至10μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在1μg/kg/天至5μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在5μg/kg/天至10μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在10μg/kg/天至15μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在15μg/kg/天至20μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在25μg/kg/天至30μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在30μg/kg/天至35μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在35μg/kg/天至40μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在40μg/kg/天至45μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在45μg/kg/天至50μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在50μg/kg/天至55μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在55μg/kg/天至60μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在60μg/kg/天至65μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在65μg/kg/天至70μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在70μg/kg/天至75μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在80μg/kg/天至85μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在85μg/kg/天至90μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在90μg/kg/天至95μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在95μg/kg/天至100μg/kg/天的范围内。
根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量是1μg/kg/天。
根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量是2μg/kg/天。
根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量是5μg/kg/天。
根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量是10μg/kg/天。
III.用于预防或治疗特征在于异常的成纤维细胞增殖和胶原沉积的疾病的系统
根据另一方面,所述发明提供了用于治疗特征在于对象的组织中异常的成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积的疾病、状况或过程的系统,
其中药物组合物包括治疗量的氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的多肽或其功能等价物、和其药学上可接受的载体,并且
其中治疗量对减少对象的组织中的成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积是有效的。
根据方法的一个实施方式,疾病或状况是急性肺损伤(ALI)或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。
根据另一个实施方式,疾病或状况是辐射诱发的纤维化。
根据另一个实施方式,疾病或状况是移植排斥。
根据另一个实施方式,组织是肺组织。
根据另一个实施方式,疾病或状况是间质性肺病。
根据另一个实施方式,疾病或状况是肺纤维化。
根据另一个实施方式,肺纤维化是特发性肺纤维化。
根据另一个实施方式,肺纤维化由施用博来霉素造成。
根据另一个实施方式,肺纤维化由过敏反应、吸入环境微粒、细菌感染、病毒感染、对对象的肺的机械伤害、肺移植排斥、自身免疫障碍、遗传障碍、或其组合造成。
根据另一个实施方式,疾病或状况是进一步特征在于组织中的炎症。
根据另一个实施方式,炎症是急性或慢性炎症。
根据另一个实施方式,炎症由选自肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、和白介素-1β(IL-1β)的至少一种细胞因子介导。
根据另一个实施方式,组织中异常的成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积特征在于与促分裂原活化蛋白激酶-活化蛋白激酶2(MK2)在正常健康对照对象的组织中的活性相比,促分裂原活化蛋白激酶-活化蛋白激酶2(MK2)在组织中的异常活性。
根据另一个实施方式,组织中异常的成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积由以下证明:与正常健康对照对象的组织中活化的促分裂原活化蛋白激酶-活化蛋白激酶2(MK2)的量或分布相比,组织中活化的(磷酸化的)促分裂原活化蛋白激酶-活化蛋白激酶2(MK2)的异常的量和分布。
根据另一个实施方式,肺纤维化特征在于选自以下的至少一种病理:与正常健康对照对象相比,肺间质中细胞外基质蛋白的异常沉积、肺中成纤维细胞增殖的异常促进、肺中成肌纤维细胞群分化为成肌纤维细胞群的异常诱导、和成肌纤维细胞附着至细胞外基质的异常促进。
根据另一个实施方式,药学上可接受的载体包括但不限于控释载体、延释载体、缓释载体、和长期释放载体。
根据另一个实施方式,吸入装置是喷雾器。
根据另一个实施方式,吸入装置是定量吸入器(MDI)。
根据另一个实施方式,吸入装置是干粉吸入器(DPI)。
根据另一个实施方式,吸入装置是干粉喷雾器。
根据另一个实施方式,药物组合物是干粉的形式。
根据另一个实施方式,干粉包括具有1至5微米的质量中值空气动力学直径(MMAD)的微粒。
根据另一个实施方式,干粉包括具有大约2微米的质量中值空气动力学直径(MMAD)的微粒。
根据一些实施方式,药物组合物进一步包括另外的治疗剂。
根据一些这样的实施方式,另外的治疗剂选自纯化的牛V型胶原(例如,IW-001;ImmuneWorks;United Therapeutics)、IL-13受体拮抗物(例如,QAX576;Novartis)、蛋白质酪氨酸激酶抑制剂(例如,伊马替尼Craig Daniels/Novartis)、内皮受体拮抗物(例如,ACT-064992(马西替坦);Actelion)、双内皮素受体拮抗物(例如,波生坦Actelion)、前列环素类似物(吸入性伊洛前列素(例如,);Actelion)、抗CTGF单克隆抗体(例如,FG-3019)、内皮素受体拮抗物(A-选择性)(例如,安立生坦Gilead)、AB0024(Arresto)、赖氨酰氧化酶样2(LOXL2)单克隆抗体(例如,GS-6624(以前的AB0024);Gilead)、c-Jun N-末端激酶(JNK)抑制剂(例如,CC-930;Celgene)、吡非尼酮(例如,(InterMune)、(Shionogi))、IFN-γ1b(例如,InterMune)、针对全部三种TGF-β同种型的全中和IgG4人抗体(例如,GC1008;GENZYME)、TGF-β活化抑制剂(例如,Stromedix(STX-100))、重组人正五聚蛋白-2蛋白(rhPTX-2)(例如,PRM151;Promedior)、双特异性IL4/IL13抗体(例如,SAR156597;Sanofi)、人源化单克隆抗体靶向整合蛋白αvβ6(BIBF 1120;Boehringer Ingelheim)、N-乙酰半胱氨酸(Zambon SpA)、西地那非TNF拮抗物(例如,依那西普Pfizer)、糖皮质激素(例如,强的松、布地奈德、莫米松糠酸酯、丙酸氟替卡松、和糠酸氟替卡松),支气管扩张药(例如,白三烯改性剂(例如,孟鲁司特)、抗胆碱能支气管扩张药(例如,异丙托溴铵和噻托溴铵)、短效β2激动剂(例如,甲磺酸乙基异丙肾上腺素肾上腺素、舒喘灵/舒喘宁、和特布他林)、长效β2激动剂(例如,沙美特罗、福莫特罗、indecaterol和其组合。
根据一些其它实施方式,另外的治疗剂包括支气管扩张药,其包括但不限于白三烯改性剂、抗胆碱能支气管扩张药、β2激动剂、或其组合。
根据另一个实施方式,另外的治疗剂包括皮质类固醇,其包括但不限于强的松、布地奈德、莫米松、倍氯米松、或其组合。
根据一些这样的实施方式,另外的治疗剂包括支气管扩张药,其包括但不限于白三烯改性剂、抗胆碱能支气管扩张药、β2激动剂、或其组合。
根据另一个实施方式,另外的治疗剂包括皮质类固醇,其包括但不限于强的松、布地奈德、莫米松、倍氯米松、或其组合。
根据另一个实施方式,另外的治疗剂是抗炎性剂。
根据另一个实施方式,抗炎性剂是非甾体抗炎性剂。还可以采用非甾体抗炎性剂的混合物,以及这些药剂的皮肤病学上可接受的盐和酯。例如,依托芬那酯,氟芬那酸衍生物,对外部应用是特别有用的。
根据另一个实施方式,其中非甾体抗炎性剂包括转化生长因子-β3(TGF-β3)、抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)药剂、或其组合。
根据另一个实施方式,抗炎性剂是甾体抗炎性剂。根据另一个实施方式,甾体抗炎性剂包括选自强的松、布地奈德、莫米松、倍氯米松、和其组合的至少一种皮质类固醇。
根据另一个实施方式,另外的治疗剂包括甲基黄嘌呤。
根据另一个实施方式,另外的治疗剂包括嗜中性粒细胞弹性酶抑制剂。
根据另一个实施方式,另外的治疗剂是至少一种嗜中性粒细胞弹性酶抑制剂,其包括但不限于ICI 200355、ONO-5046、MR-889、L-694,458、CE-1037、GW-311616、TEI-8362、ONO-6818、AE-3763、FK-706、ICI-200,880、ZD-0892、ZD-8321、和其组合。
根据另一个实施方式,另外的治疗剂包括至少一种磷酸二酯酶抑制剂,其包括但不限于磷酸二酯酶4抑制剂。磷酸二酯酶4抑制剂的实例包括但不限于罗氟司特、西洛司特或其组合。
根据另一个实施方式,另外的治疗剂是镇痛剂。根据一些这样的实施方式,镇痛剂是非阿片镇痛药。根据一些其它实施方式,镇痛药是阿片镇痛药。
根据另一个实施方式,另外的治疗剂是的抗感染剂。根据另一个实施方式,抗感染剂是抗生素药剂。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制在对象的肺中发生的炎症。根据另一个实施方式,炎症是急性炎症。根据另一个实施方式,炎症是慢性炎症。根据另一个实施方式,炎症由升高水平的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)介导。根据另一个实施方式,炎症由升高水平的白介素-6(IL-6)介导。根据另一个实施方式,炎症由升高水平的白介素-1β(IL-1β)的介导。
根据另一个实施方式,与对照相比,药物组合物调节肺中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的量。根据另一个实施方式,与对照相比,药物组合物调节肺中白介素-6(IL-6)的量。根据另一个实施方式,与对照相比,药物组合物调节肺中白介素-1β(IL-1β)的量。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制HSPB1的活性。根据另一个实施方式,被药物组合物抑制的HSPB1的活性是成纤维细胞增殖的异常诱导。根据另一个实施方式,被药物组合物抑制的HSPB1的活性是成纤维细胞群分化为成肌纤维细胞群的异常诱导。根据另一个实施方式,被药物组合物抑制的HSPB1的活性是细胞外基质蛋白沉积入肺间质。根据另一个实施方式,细胞外基质蛋白是胶原。根据另一个实施方式,被药物组合物抑制的HSPB1的活性是纤维变性位置形成的促进。根据另一个实施方式,被药物组合物抑制的HSPB1的活性是成肌纤维细胞收缩活性的增加。根据另一个实施方式,被药物组合物抑制的HSPB1的活性是成肌纤维细胞附着至细胞外基质的促进。
根据另一个实施方式,组织中异常的成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积由以下证明:与正常健康对照对象的组织中活化的促分裂原活化蛋白激酶-活化蛋白激酶2(MK2)的量或分布相比,组织中活化的(磷酸化的)促分裂原活化蛋白激酶-活化蛋白激酶2(MK2)的异常的量和分布。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制选自本文在表1中列出的组的激酶的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制激酶的至少50%的激酶活性。根据另一个实施方式药物组合物抑制激酶的至少65%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制该激酶的至少75%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制该激酶的至少80%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制该激酶的至少85%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制该激酶的至少90%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制该激酶的至少95%的激酶活性。
根据一些实施方式,MMI抑制剂在体内的抑制概况取决于剂量、给药途径、和响应于抑制剂的细胞类型。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制激酶的至少50%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制激酶的至少65%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制该激酶的至少75%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制该激酶的至少80%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制该激酶的至少85%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制该激酶的至少90%的激酶活性。根据另一个实施方式药物组合物抑制该激酶的至少95%的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2激酶)的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制MK2激酶的至少50%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制MK2激酶的至少65%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制MK2激酶的至少75%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制MK2激酶的至少80%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制MK2激酶的至少85%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制MK2激酶的至少90%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制MK2激酶的至少95%的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶3(MK3激酶)的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制MK3激酶的至少50%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制MK3激酶的至少65%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制MK3激酶的至少70%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制MK3激酶的至少75%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制MK3激酶的至少80%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制MK3激酶的至少85%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制MK3激酶的至少90%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制MK3激酶的至少95%的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的至少50%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的至少65%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的至少70%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的至少75%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的至少80%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的至少85%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的至少90%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物进一步抑制Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的至少95%的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制BDNF/NT-3生长因子受体(TrkB)的激酶活性。根据另一个实施方式,药物进一步抑制BDNF/NT-3生长因子受体(TrkB)的至少50%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物进一步抑制BDNF/NT-3生长因子受体(TrkB)的至少65%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物进一步抑制BDNF/NT-3生长因子受体(TrkB)的至少70%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物进一步抑制BDNF/NT-3生长因子受体(TrkB)的至少75%的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的激酶活性和促分裂原活化蛋白激酶-活化蛋白激酶3(MK3)的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的激酶活性和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的激酶活性和BDNF/NT-3生长因子受体(TrkB)的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的激酶活性、促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶3(MK3)的激酶活性、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的激酶活性、和BDNF/NT-3生长因子受体(TrkB)的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的激酶活性、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的激酶活性、和BDNF/NT-3生长因子受体(TrkB)的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的至少65%的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶3(MK3)的至少65%的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的至少65%的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制BDNF/NT-3生长因子受体(TrkB)的至少65%的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的至少65%的激酶活性和促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶3(MK3)的至少65%的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的至少65%的激酶活性和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的至少65%的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的至少65%的激酶活性和BDNF/NT-3生长因子受体(TrkB)的至少65%的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的至少65%的激酶活性、促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶3(MK3)的至少65%的激酶活性、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI)的至少65%的激酶活性、和BDNF/NT-3生长因子受体(TrkB)的至少65%的激酶活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制选自MK2、MK3、CaMKI、TrkB的至少一种激酶的激酶活性,而基本上不抑制来自本文在表1中列出的其余组的一种或多种其它选择的激酶的活性。
根据另一个实施方式,药物组合物抑制选自本文在表1中列出的组的激酶的激酶活性。
根据另一个实施方式,此抑制可以,例如,对减少对象的组织中的成纤维细胞增殖、细胞外基质沉积、或其组合是有效的。
根据另一个实施方式,此抑制可以,例如,对减少选自以下的至少一种病理是有效的:与正常健康对照对象相比,肺间质中细胞外基质蛋白的异常沉积、肺中成纤维细胞增殖的异常促进、成肌纤维细胞分化的异常诱导、和成肌纤维细胞附着至细胞外基质的异常促进。
根据一些实施方式,MMI抑制剂在体内的抑制概况取决于剂量、给药途径、和响应于抑制剂的细胞类型。
根据这样的实施方式,药物组合物抑制其它选择的激酶(一种或多种)的小于50%的激酶活性。根据这样的实施方式,药物组合物抑制其它选择的激酶(一种或多种)的小于65%的激酶活性。根据这样的实施方式,药物组合物抑制其它选择的激酶(一种或多种)的小于50%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制其它选择的激酶(一种或多种)的小于40%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制其它选择的激酶(一种或多种)的小于20%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制其它选择的激酶(一种或多种)的小于15%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制其它选择的激酶(一种或多种)的小于10%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物抑制其它选择的激酶(一种或多种)的小于5%的激酶活性。根据另一个实施方式,药物组合物增加其它选择的激酶的激酶活性。
根据前一段的实施方式,基本上不抑制的一种或多种其它选择的激酶选自Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII,包括其亚基CaMKIIδ)、原癌基因丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶(PIM-1)、细胞肉瘤(c-SRC)、脾脏酪氨酸激酶(SYK)、C-src酪氨酸激酶(CSK)、和胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)。
根据一些实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物与氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)具有基本序列同一性。
根据另一个实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物与氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)具有至少70%序列同一性。根据另一个实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物与氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)具有至少80%序列同一性。根据另一个实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物与氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)具有至少90%序列同一性。根据另一个实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物与氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)具有至少95percent序列同一性。
根据另一个实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物具有氨基酸序列FAKLAARLYRKALARQLGVAA(SEQ ID NO:3)。
根据另一个实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物具有氨基酸序列KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA(SEQ ID NO:4)。
根据另一个实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物具有氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLAVA(SEQ ID NO:5)。
根据另一个实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物具有氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVA(SEQ ID NO:6)。
根据另一个实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物具有氨基酸序列HRRIKAWLKKIKALARQLGVAA(SEQ ID NO:7)。
根据一些其它实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物是包括可操纵地连接至第二多肽的第一多肽的融合蛋白,其中第一多肽具有氨基酸序列YARAAARQARA(SEQ ID NO:11),并且第二多肽包括治疗结构域,其序列与氨基酸序列KALARQLGVAA(SEQ ID NO:2)具有基本同一性。
根据另一个实施方式,第二多肽与氨基酸序列KALARQLGVAA(SEQ ID NO:2)具有至少70%序列同一性。根据一些其它实施方式,第二多肽与氨基酸序列KALARQLGVAA(SEQ IDNO:2)具有至少80%序列同一性。根据一些其它实施方式,第二多肽与氨基酸序列KALARQLGVAA(SEQ ID NO:2)具有至少90%序列同一性。根据一些其它实施方式,第二多肽与氨基酸序列KALARQLGVAA(SEQ ID NO:2)具有至少95%序列同一性。
根据另一个实施方式,第二多肽是氨基酸序列KALARQLAVA(SEQ ID NO:8)的多肽。
根据另一个实施方式,第二多肽是氨基酸序列KALARQLGVA(SEQ ID NO:9)的多肽。
根据另一个实施方式,第二多肽是氨基酸序列KALARQLGVAA(SEQ ID NO:10)的多肽。
根据一些其它实施方式,多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物是包括可操纵地连接至第二多肽的第一多肽的融合蛋白,其中第一多肽包括在功能上等价于YARAAARQARA(SEQ ID NO:11)的细胞穿透肽,并且第二多肽具有氨基酸序列KALARQLGVAA(SEQ ID NO:2)。
根据进一步的实施方式,第一多肽是氨基酸序列WLRRIKAWLRRIKA(SEQ ID NO:12)的多肽。
根据另一个实施方式,第一多肽是氨基酸序列WLRRIKA(SEQ ID NO:13)的多肽。
根据另一个实施方式,第一多肽是氨基酸序列YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:14)的多肽。
根据另一个实施方式,第一多肽是氨基酸序列WLRRIKAWLRRI(SEQ ID NO:15)的多肽。
根据另一个实施方式,第一多肽是氨基酸序列FAKLAARLYR(SEQ ID NO:16)的多肽。
根据另一个实施方式,第一多肽是氨基酸序列KAFAKLAARLYR(SEQ ID NO:17)的多肽。
根据另一个实施方式,第一多肽是氨基酸序列HRRIKAWLKKI(SEQ ID NO:18)的多肽。
根据另一方面,所述发明还提供了分离的核酸,其编码与氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)具有至少70%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。根据一些这样的实施方式,分离的核酸编码与氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQID NO:1)具有至少80%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。根据一些这样的实施方式,分离的核酸编码与氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)具有至少90%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。根据一些这样的实施方式,分离的核酸编码与氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)具有至少95%氨基酸序列同一性的蛋白质序列。
根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约100mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.00001mg/kg体重至大约100mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.0001mg/kg体重至大约100mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.001mg/kg体重至大约10mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.01mg/kg体重至大约10mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.1mg/kg(100μg/kg)体重至大约10mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约1mg/kg体重至大约10mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约10mg/kg体重至大约100mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约2mg/kg体重至大约10mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约3mg/kg体重至大约10mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约4mg/kg体重至大约10mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约5mg/kg体重至大约10mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约60mg/kg体重至大约100mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约70mg/kg体重至大约100mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约80mg/kg体重至大约100mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约90mg/kg体重至大约100mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约90mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约80mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约70mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约60mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约50mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约40mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约30mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约20mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约10mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约1mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约0.1mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约0.1mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约0.01mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约0.001mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约0.0001mg/kg体重的量。根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗量具有从大约0.000001mg/kg体重至大约0.00001mg/kg体重的量。
根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在1μg/kg/天至25μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在1μg/kg/天至2μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在2μg/kg/天至3μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在3μg/kg/天至4μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物的治疗性抑制肽的治疗剂量在4μg/kg/天至5μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在5μg/kg/天至6μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在6μg/kg/天至7μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在7μg/kg/天至8μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在8μg/kg/天至9μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在9μg/kg/天至10μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在1μg/kg/天至5μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在5μg/kg/天至10μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在10μg/kg/天至15μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在15μg/kg/天至20μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在25μg/kg/天至30μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在30μg/kg/天至35μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在35μg/kg/天至40μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在40μg/kg/天至45μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在45μg/kg/天至50μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在50μg/kg/天至55μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在55μg/kg/天至60μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在60μg/kg/天至65μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在65μg/kg/天至70μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在70μg/kg/天至75μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在80μg/kg/天至85μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在85μg/kg/天至90μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在90μg/kg/天至95μg/kg/天的范围内。根据一些其它实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量在95μg/kg/天至100μg/kg/天的范围内。
根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量是1μg/kg/天。
根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量是2μg/kg/天。
根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量是5μg/kg/天。
根据另一个实施方式,药物组合物的治疗性抑制肽的治疗剂量是10μg/kg/天。
在本申请内,除非另外说明,利用的技术可以发现于任意多种熟知的参考文献,比如:Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Sambrook,等,1989,Cold Spring HarborLaboratory Press),Gene Expression Technology(Methods in Enzymology,Vol.185,edited by D.Goeddel,1991.Academic Press,San Diego,CA),“Guide to ProteinPurification”in Methods in Enzymology(M.P.Deutshcer,ed.,(1990)Academic Press,Inc.);PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Innis,等1990.AcademicPress,San Diego,CA),Culture ofAnimal Cells:A Manual ofBasic Technique,2nd Ed.(R.I.Freshney.1987.Liss,Inc.New York,NY),和Gene Tranfer and ExpressionProtocols,pp.109-128,ed.E.J.Murray,The Humana Press Inc.,Clifton,N.J.),其全部通过引用并入本文。
除非另外定义,本文使用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员一般所理解的相同的含义。虽然与本文描述的方法和材料相似或等同的任何方法及材料也可以用于本发明实践或测试,但是现在描述了优选的方法和材料。本文提及的全部出版物通过引用并入本文,以公开和描述与引用的出版物关联的方法和/或材料。
除非上下文另外明确地规定,在提供数值范围时,可以理解,在该范围的上限和下限之间的每个介于其间的值(至下限单位的十分之一)、和该规定范围中的任何其它规定值或介于其间的值包含在本发明内。可以独立地包括在较小范围中的这些较小范围的上限和下限也包含在本发明内,在规定范围中服从任何具体排除限制。在规定范围包括限制中的一种或两种时,排除那些包括的限制二者中的任一种的范围也包括在本发明中。
还必须注意,除非上下文另外明确地规定,如在本文和所附权利要求中所用的,单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物。本文使用的全部技术和科学术语具有相同的含义。
本文讨论的出版物通过引用以其全部并入本文,并且仅因其公开内容先于本申请的提交日期而提供。本文的任何事物不解释为承认所述发明由于在先的发明而不享有先于这样的出版物的权利。另外,提供的出版物的日期可能不同于实际出版日期,其可能需要独立地确认。
本领域技术人员应当理解,可以做出多种改变并且可以进行等价物替换,而不背离本发明的真实精神和范围。此外,对于所述发明的客观精神和范围,可以进行很多修改以适应具体的情况、材料、物质组成、过程、过程步骤或多个步骤。所有这样的修改都意欲落入所附权利要求的范围内。
实施例
提出下列实施例,以便为本领域普通技术人员提供如何制造和使用所述发明的完整公开内容和描述,并且不意欲限制本发明人认为的其发明的范围,也不意欲表示下面的实验是全部实验或仅被实施的实验。已经做出努力以确保关于使用的数字(例如量、温度等)的准确性,但是一些实验误差和偏差在所难免。除非另外指出,份是重量份,分子量是重均分子量,温度是摄氏度,并且压力是大气压或接近大气压。
I.材料和方法
MMI-0100药物研发
对于MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)生产的优质生产规范(GMP),大约1kg的Fmoc-Ala-王氏树脂被转移入装备有机械搅拌器的50L玻璃固相合成反应容器。树脂允许在二甲基甲酰胺(DMF)中膨胀不少于(NLT)2小时,然后滤干DMF。然后利用DMF的连续漂洗来清洗树脂珠。通过DMF中20%的哌啶的处理N-端保护基团(即Fmoc)被移除(去封闭步骤),并且利用DMF清洗树脂。序列中的下一个氨基酸在存在1-羟基苯并三唑(HOBt)和二异丙基碳二亚胺(DIC)的情况下被偶联。通常,合成规模的2.5-3.5摩尔当量的Fmoc-氨基酸(Fmoc-AA)被用于偶联。Fmoc-AA溶解于DMF并且通过添加HOBt和DIC被活化。通过茚三酮检验监测每个偶联的完成。如果偶联未完成,则通过使用对称酸酐法进行利用相同氨基酸的第二次偶联。通常,合成规模的3.0-6.0摩尔当量的Fmoc-AA被用于偶联。Fmoc-AA溶解于二氯甲烷(DCM)和最小体积的DMF通过添加Fmoc-AA/DIC=1.0/0.5的摩尔比的DIC被活化。当完整的肽序列完成时,利用DMF和MeOH的连续清洗来彻底地漂洗肽树脂。树脂然后在真空下干燥不少于3小时。典型回收的总的干燥肽树脂是大约2800克,其代表~65%的肽树脂产率。
大约370-500克的肽树脂然后被转移入装备有磁力搅拌棒的合适大小的玻璃瓶。包含肽树脂的烧瓶在冰/水浴或在冰箱中冷却不晚于30分钟。三氟乙酸(TFA)混合物(95mL:2.5mL:2.5mL的比率的TFA、TIS和水的混合物)在冰/水浴中预冷不晚于30分钟。每克树脂大约8-12mL的TFA裂解混合物被添加至此容器。一旦肽树脂和TFA混合物结合,就移除冰/水浴并且反应混合物在室温下搅拌2-3小时。反应混合物然后通过粗玻璃滤器过滤,并且利用每次清洗每克树脂0.1-1.0mL的TFA清洗树脂两次。收集合并滤液并且丢弃树脂。滤液然后以每10mL醚1mL的滤液的比率添加至在冰箱中预冷少于30分钟的醚,以沉淀裂解的肽。肽-醚混合物被平衡(equilibrate)至室温持续不晚于30分钟。在中等(medium)玻璃滤器上收集沉淀的肽。利用冷醚彻底地清洗沉淀物三次,使用足够的醚至少覆盖滤器上的全部沉淀物。醚然后通过相同的中等玻璃滤器洗脱。粗肽被转移入塑料瓶并且被放置于与机械真空泵连接的干燥器以干燥不晚于12小时。在干燥后,粗肽在5±3℃下储存。裂解过程重复多次直到全部肽树脂被裂解。典型批量回收的总的干燥的粗肽是大约1250克,其代表大约110%的裂解产率。
通过将肽以20mg/mL的最终粗肽浓度溶解于HPLC缓冲液,来自裂解反应的粗肽制备用于高效液相色谱(HPLC)纯化。肽溶液通过1μm玻璃滤膜过滤并且被装载至由制备型HPLC系统操作的C18反相柱上。清洗和平衡柱。线性梯度用于从柱洗脱粗肽。在每次粗纯化之后,使用Kromasil C18,5μm,100柱,通过分析型HPLC系统分析级分。基于每个级分的HPLC纯度和杂质概况,合并由初次纯化生成的级分。肽池(peptide pool)在2-8℃下储存直到进一步处理。此过程重复直到所有粗肽通过HPLC柱纯化并且满足主池纯度标准。通过HPLC进行醋酸盐的盐交换。最终肽溶液通过0.22μm滤器过滤并且被装载至托盘冻干器上。在开始冻干周期前,肽在40℃下预冻不晚于720分钟。冻干耗费大约5天。有纯化和冻干步骤造成大约50-55%的最终产率。
放射性测量的IC50测定
由二分之一对数稀释液(one-half log dilution)的10点曲线(10-point curve)估算IC50值。肽提供在二甲基亚砜(DMSO)中。具体地,利用50mM 3-甘油磷酸钠(pH=7.5)、0.1mMEGTA、30μM的底物肽(KKLNRTLSVA;SEQ ID NO:21)、10mM醋酸镁、和90uMγ-33P-ATP(25μL的最终体积)在室温下培育人重组MK2(h)(5-10mU)持续40分钟。然后,利用3%磷酸终止反应。10μL的此混合物被点至P30过滤垫(filtermat)上,并且利用75mM磷酸清洗三次持续五分钟和利用甲醇清洗一次。最后,膜被干燥并且使用闪烁计数器。选择ATP的表观Km在15μM之内的ATP浓度,因为Hayess和Benndorf(Biochem Pharmacol,1997,53(9):1239-47)显示了它们的原始抑制肽(即,肽KKKALNRQLGVAA;SEQ ID NO:22)的机制不与ATP结合竞争。
除测定MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)的IC50值以外,使用Millipore的IC50Profiler Express服务(Millipore,Billerica,MA)测试针对266种人激酶的抑制活性。
对于特异性分析,使用溶解于二甲基亚砜(DMSO)的每个100μM的MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)、MMI-0200(YARAAARQARAKALNRQLGVA;SEQ IDNO:19)、MMI-0300(FAKLAARLYRKALARQLGVAA;SEQ ID NO:3)、MMI-0400(KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA;SEQ ID NO:4)、和MMI-0500(HRRIKAWLKKIKALARQLGVAA;SEQID NO:7)。选择100μM浓度,因为此浓度在体内研究中抑制粘附形成(如在2009年10月20日提交的美国申请号12/582,516中公开的,其内容通过引用以其全部并入本文)。每种激酶活性测量以一式两份实施。
组织化学和免疫组织化学
通过气管内施用0.025U的博来霉素/PBS至C57BL/6小鼠来生成肺纤维化的小鼠模型。从博来霉素损伤后第7天(对于分析炎性后/纤维变性后阶段;预防模型)或博来霉素损伤后第14天(对于分析纤维变性后阶段;治疗模型)开始至博来霉素递送后第21或28天,每天气管内施用或经由喷雾施用MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)或MMI-0200(YARAAARQARAKALNRQLGVA;SEQ ID NO:19)(以每天50μg/kg、75μg/kg和100μg/kg的剂量)。在博来霉素递送后第21天(对于预防模型)或博来霉素递送后第28天(对于治疗模型),利用戊巴比妥钠注射(120mg/kg)处死一组小鼠并且打开胸腔。结扎右主支气管(mainstembronchus)并且移除右肺。气管被插管并且左肺在21cm H2O压力下灌注有4%甲醛。组织块然后被包埋在石蜡中,并且制备4-mm切片用于染色。利用苏木精和伊红(H&E)对来自每只动物的切片进行染色以使细胞可视化,或利用马逊蓝色三色染色突出胶原沉积。在培育后,利用0.2%醋酸清洗切片,通过浸入95%乙醇脱水,并且利用染色皿中的二甲苯(3-4次)透明。利用有机封固剂将染色切片固定在贴标签的载玻片上。
II.结果
实施例1.MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)的IC50和特异性。
使用Millipore的IC50Profiler Express服务测定MK2抑制(MMI-0100;YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1))的IC50(半抑制浓度)值。此定量测定测量抑制50%的给定的生物过程或该过程的组分(即,酶、细胞或细胞受体)需要多少抑制剂[IC50]。具体地,在这些测定中,如果激酶未被抑制肽抑制,则带正电荷的底物被来自ATP的放射性标记的磷酸基团磷酸化。带正电荷的底物然后被吸引到带负电荷的滤膜,利用闪烁记数器定量,并且与100%活性对照比较。
选择ATP的表观Km在15μM内的ATP浓度,因为靠近该Km的ATP浓度可以允许激酶具有相同的相对量的磷酸化活性。MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)的IC50测定为22μM。
除测定化合物的IC50以外,通过检查可用于在Millipore激酶概况服务中测试的全部266种人激酶的活性来评估MK2抑制肽的特异性(表1)。对于分析,测定被MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1);MMI-0200(YARAAARQARAKALNRQLGVA;SEQ IDNO:19);MMI-0300(FAKLAARLYRKALARQLGVAA;SEQ ID NO:3);MMI-0400(KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA;SEQ ID NO:4);和MMI-0500(HRRIKAWLKKIKALARQLGVAA;SEQID NO:7)抑制大于65%的激酶。
如表1中所示,在100μM下,MK2抑制肽MMI-0100(SEQ ID NO:1)、MMI-0200(SEQ IDNO:19)、MMI-0300(SEQ ID NO:3);MMI-0400(SEQ ID NO:4);和MMI-0500(SEQ ID NO:5)抑制具体组的激酶并且显示非常有限的脱靶激酶抑制。更具体地,MK2抑制肽MMI-0100(SEQID NO:1)、MMI-0200(SEQ ID NO:19)、MMI-0300(SEQ ID NO:3);MMI-0400(SEQ ID NO:4);和MMI-0500(SEQ ID NO:5)在体外抑制促分裂原活化蛋白激酶-活化蛋白激酶2(MK2)、促分裂原活化蛋白激酶-活化蛋白激酶3(MK3)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(CaMKI,丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶)、和BDNF/NT-3生长因子受体(TrkB,酪氨酸激酶)的大于65%的激酶活性。
表1.激酶概况测定
实施例2.MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:
1)和其功能等价物的制剂
根据一些实施方式,MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)和其功能等价物经由喷雾干燥、微粉化(例如,气流粉碎)配制为冻干粉末,或配制为用于喷雾的液体制剂。
喷雾干燥
在一些实施方式中,考虑到下列因素,喷雾干燥用于制备MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)和其功能等价物:
(a)蛋白质和肽易于变性,即,破裂为三级结构并且有时破裂为二级结构;
(b)变性可以是可逆的或不可逆的,并且可以由各种条件造成,比如温度增加、温度降低、极端的pH、添加溶剂、压力、和剪切变性(此适用于微粉化);
(c)变性蛋白质是低活性和无治疗性的,有时是完全无活性的;
(d)由加工参数控制,喷雾干燥能够将这些无定形的大分子变为具有指定的颗粒大小分布的离散的球形颗粒;喷雾干燥颗粒可以是非常球形、环形的,并且通常是中空的,这意思是>5μm的颗粒仍可以是可呼吸的,但是抵御肺中的清除机制;和
(e)利用或不利用赋形剂的喷雾干燥通常改进蛋白质的稳定性。
MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)和其功能等价物的冻干制剂被评估用于与喷雾干燥工艺潜在协同(例如,匹配最佳湿度水平、缓冲液浓度/pH、赋形剂选择等)以确保肽稳定性的保护。
最初的喷雾干燥运行以限定喷雾干燥操作的工艺参数为目的,目标是相互同意的验收标准。对于吸入产品,颗粒大小被认为是重要的标准。对于感兴趣区域中的肺泡沉积(II型),1-5微米的质量中值空气动力学直径(MMAD)通常被接受为适于肺泡空间中的外周沉积(Heyder,J.Proc Am Thorac Soc,1(4):315-320,2004,其通过引用并入本文)。其它研究已经表明1-3微米的MMAD是用于喷雾干燥工艺的期望的起始靶标颗粒大小。由于MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)的可能的生物空间靶标在肺泡区域中,最初靶向大约2微米范围中的MMAD以确保沉积入肺泡空间。
验收标准包括但不限于(1)颗粒大小(即,大约2μm的D90);(2)湿度水平(即,小于3%w/w的湿度);(3)粉末密度;和(4)表面形貌(球形、粗糙、曲面)。
然后实施工艺设计实验以优化喷雾干燥工艺参数,包括,例如,但不限于(1)入口压力和干燥温度;(2)原料浓度和进料速率(federate);和(3)肽/赋形剂比率(例如,赋形剂是缓冲盐和单糖)。
实施例3.用于持续气溶胶性能评估的MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQID NO:1)的批量生产
在上面描述的限定的工艺参数下进行2-3次喷雾干燥运行以生成用于气溶胶性能评估的材料。
喷雾干燥粉末良好地适于从吸入器递送,例如,非限制性地,微剂量吸入器。对于纯或共喷雾干燥掺和物二者,微剂量利用此配制方案常规地实现高射出剂量,和高细小颗粒级分与剂量二者。喷雾干燥胰岛素的示例性气溶胶性能显示在图1和2中。
虽然干微粉化是小分子用于肺递送的优选的粉末生产方法,与喷雾干燥相比,它是产生压力的方法,其使用高剪切力。因为使用高剪切力可以导致蛋白质和肽的断裂,干粉末化通常不用于大分子。此外,如果剂量大小是小的,则需要增量剂以改进流动性和允许填充操作中粉末的精确测量。主要的赋形剂并且是出于此目的批准用于肺递送的仅有的赋形剂之一是乳糖,可能需要测试与MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)或其功能等价物的化学相容性,因为乳糖与某些肽不相容。
微粉化工艺是本领域中相当简单和熟知的。简略地,MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)和其功能等价物的冻干干粉经历研磨阶段直到达到规定的目标颗粒大小分布(即,MMAD、D10、D50、D90)。此纯粉末化粉末测试效能以确保其粉末化后的活性,优化用于从吸入器递送,并且在初级(热封泡罩)包装中测试其化学和物理稳定性。纯粉末然后与批准的对于目标为肺乳糖级的优先选择掺和,测试掺和均一性,并且经历相同的吸入器优化和稳定性测试。
微剂量干粉吸入器(DPI)
根据一些实施方式,可以使用干粉吸入器(DPI)施用MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)和其功能等价物。例如,微剂量干粉吸入器(DPI)具有‘主动的’压电驱动气溶胶发生器,其是呼吸驱动的并且独立于患者的吸入流量和体积实现高效率的肺递送。与需要大约40-60升/分钟(LPM)的用于有效肺递送的流动的强有力吸入的‘被动的’DPI不同,微剂量DPI不需要呼吸动作(breathing maneuver),因为它可以在低至10LPM多至90LPM的流动的流量的非常宽的范围内有效地递送,而且具有等价的性能(参见图3和4中的性能实施例)。
根据一些其它实施方式,可以使用潮式呼吸应用施用MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)和其功能等价物,比如‘干粉喷雾器’(DPN)。DPN递送干粉剂量同步于具有低至2升/分钟(LPM)的触发(triggering)、5和15LPM之间期望的峰值流动和低至30ml的潮气量的吸入潮式呼吸,其是比成人IPF患者所期望的更加挑战的条件。此新型DPN已经成功地完成其第二次成人临床试验,而且在2011年11月完成其第一次研究。这些结果经由互联网在万维网(www)URL“clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01489306?spons=Microdose&rank=1”可获得。
微剂量电子吸入器系统是极端灵活的剂型,可以精确地和高效地递送上面的两种剂型模式,对于喷雾干燥药物产品具有特别高的效率,并且已经用超过30种小大分子显示此性能。主要包装中的喷雾干燥胰岛素,例如,可以维持至少18个月。喷雾干燥肽和微粉化小分子二者的递送性能的实施例显示在图5-8中。
关于干粉制剂对肺膜(pulmonary membrane)的作用,例如,致敏、干粉递送,尤其在低粉末负载(<4-5mg)下,这不太可能影响肺膜或引起致敏(咳嗽等),除非这是活性分子的固有性质(我们在动物研究中还没有观察到)。选择已经由于卓越的肺生物相容性而被肺部批准的赋形剂,并且其以非常低的数量(即,低mg范围)存在。例如,低的数量下的甘露醇不太可能具有效果。
液体喷雾
可选地,可以经由液体喷雾递送MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)或其功能等价物。先前的临床前研究已经显示MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQID NO:1)可以经由改造适于动物使用的喷雾器系统递送至啮齿动物。
为了特别地处理MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)的递送能力以积极地影响被危害的肺,在博来霉素动物模型功效实验中,有效地气溶胶化MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)的溶液。局部的肺MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)施用通过由(www.aerogen.com)设计和制造的啮齿动物喷雾器装置实现。实验室微泵喷雾器使用用于临床前气溶胶调查吸入研究的高效气溶胶化技术,其提供了临床前和临床产品研发之间的有价值的连接。流量是>0.3ml/min,并且设计为递送2mm大小的颗粒,而且分布入最深的肺泡。已经肺纤维化的博来霉素小鼠模型中证明了雾化的MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ IDNO:1)的功效和遍及肺的细胞摄取(参见图16)。局部的、临床相关的吸入施用在减弱MK2活化中等效于常规的全身注射。
实施例4.活化的MK2的水平在患有特发性肺纤维化(IPF)的患者肺的纤维变性病变中增加
促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)-活化的蛋白激酶2(MK2)在通过p38MAPK-α和β的应激之后被活化。p38MAPK的这两种同种型与MK2的羧基端中的碱性停靠基序(basic dockingmotif)结合,其随后磷酸化其调节位点。由于活化,MK2从细胞核输出至细胞质并且协同转运活性p38MAPK至此区室。MK2稳定p38MAPK定位并且对分化、迁移和细胞因子产生至关重要(Kotlyarov,A.,Mol Cell Biol.22(13):4827-4835,2002)。
因此,为了检查p38MAPK-MK2信号传导途径在受IPF影响的肺中是否活化,利用针对MK2(抗磷酸化-Thr334-MAPKAPK2)的活化形式的磷酸化-特异性抗体对从正常和IPF患者获得的肺切片进行染色。使用DAB对正常肺和IPF肺组织进行免疫染色,并且利用苏木精复染细胞核。如图9中所示,与正常肺活检组织(左)相比,在来自患有IPF的肺组织外植体的纤维变性病灶中的细胞中观察到增加表达的活化的MK2。这些结果表明IPF患者的肺中的纤维化形成特征在于p38MAPK-MK2信号传导途径的异常活化。
实施例5.雾化和全身施用MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)防护小鼠中博来霉素诱导的肺纤维化。
特发性肺纤维化(IPF)的标志之一是间充质细胞的活化和基质的特别是胶原的丰富沉积。可以通过组织学和生物化学技术二者测量肺中胶原的由此导致的积聚,最显著地经由羟脯氨酸的积聚,其几乎完全源自肺中的胶原,并且因而充当整体肺胶原含量的替代物(Umezawa H.等,Cancer,20(5):891-895,1967)。
因此,通过在预防或预纤维变性阶段期间全身地(腹膜内)或局部地(经由雾化给药)递送MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)肽(即,从博来霉素损伤后第7天开始的药物施用;参见图10)和通过测量作为博来霉素小鼠中的纤维化指数的胶原水平,使用博来霉素诱导的肺纤维化的小鼠模型,评估MMI-0100肽(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)对治疗肺纤维化的疗效。
简略地,通过气管内递送大约0.025U的博来霉素(溶解于PBS)至C57BL/6小鼠来诱导小鼠的肺中的纤维变性位置。为了检查MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)在预防/预纤维变性期中的博来霉素损伤的肺的治疗的功效,从博来霉素递送后第7天(当炎症消退和纤维变性机制被激活时)开始直到博来霉素递送后第21天(当观察到显著的纤维化时)(图10),每天腹腔内施用或经由喷雾施用对照(PBS)或MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)。在博来霉素递送后第21天,来自利用MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)或对照(PBS)处理的博来霉素小鼠的肺组织被分离、固定、包埋在石蜡中、并且切片用于染色。简略地,利用戊巴比妥钠注射(120mg/kg)处死小鼠并且打开胸腔。结扎右主支气管并且移除右肺。气管被插管并且左肺在21cm H2O压力下灌注有4%甲醛。组织块然后被包埋在石蜡中,并且制备4-mm切片,并且利用苏木精和伊红(H&E;用于病理学检查)或利用马逊三色(用于胶原染色)进行染色。
如图11中所示,来自PBS处理的小鼠的肺切片展示出正常肺结构(NL)和气道(AW)。相比之下,来自博来霉素小鼠(第21天)的肺切片揭示出变窄的气道(AW)结构,其具有肺组织中纤维变性病灶(FF)的形成(上小图;苏木精和伊红(H&E)染色)和增加积聚的胶原(下小图中的箭头;马逊三色染色),其令人联想起在IPF患者中发现的那些。然而,经由喷雾施用或腹膜内施用MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)在博来霉素小鼠的肺中显著地减少纤维变性位置形成的发展(上小图,MMI-0100(NEB)和MMI-0100(IP))和减少胶原积聚(下小图,MMI-0100(NEB)和MMI-0100(IP))。
接着,通过计算来自羟脯氨酸浓度的胶原的常量转化因子(7.5),定量地分析博来霉素损伤的小鼠的肺中的总胶原水平(图12)(Neuman R.和Logan M,JBiol Chem.,186(2):549-56,1950,其通过引用并入)。如图12中所示,在炎性后/预纤维变性阶段期间,与博来霉素对照相比,喷雾(BLEO+NEBULIZED)和全身(BLEO+IP)施用MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)二者显著地降低胶原沉积。
实施例6.MK2肽抑制剂在特发性肺纤维化预防模型中的剂量应答数据
接着,使用特发性肺纤维化的博来霉素小鼠模型(预防模型),体内检查增加剂量的MK2肽抑制剂对的胶原沉积的作用。简略地,C57-BL/6小鼠在第0天经历博来霉素损伤。从第7天开始和持续至第21天,小鼠经由腹膜内(IP)注射每天施用25、50或75μg/kg的MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)或MMI-0200(YARAAARQARAKALNRQLGVA;SEQID NO:19)。如图13中所示,马逊蓝色三色染色揭示出利用MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)处理的博来霉素损伤的小鼠的肺中的胶原水平的降低,这表明MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)可以以剂量依赖的方式保护免于由于博来霉素损伤造成的肺中的纤维化。这些数据表明MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)甚至在较高的剂量下保持其作为纤维化预防性(fibroprotective)化合物的潜能。
相比之下,利用MMI-0200(YARAAARQARAKALNRQLGVA;SEQ ID NO:19)处理博来霉素损伤的小鼠在测试的剂量下没有减少,反而增加肺中的胶原沉积。然而,此结果与涉及MK2基因敲除小鼠和MK2-/-小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的先前研究一致,其中所有MK2活性被消除,其展示出恶化的纤维化表型(Liu等.,Am JRespir Cell Mol Biol,37:507-517,2007)。
不受限于理论,这些结果表明(1)所述发明的MK2抑制肽可以展示出针对具体组的激酶的抑制活性谱;(2)MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)和MMI-0200(YARAAARQARAKALNRQLGVA;SEQ ID NO:19)可以区别地抑制MK2和其它激酶,这取决于应用的剂量,其有助于此抑制活性谱;(3)成肌纤维细胞形成和/或迁移也可能是纤维化的修复期的一部分,而不是纤维化的活性伤害;和(4)某一水平的MK2活性因此对发生的该过程是必需的(Liu等.,Am J Respir Cell Mol Biol,37:507-517,2007)。
此外,所述发明的MK2抑制肽源自MK2下游靶标HSPB1的底物结合位点。因此,它们可以竞争性抑制MK2向HSPB1的激酶活性。不受限于理论,MMI-0200(YARAAARQARAKALNRQLGVA;SEQ ID NO:19)对纤维化的差异效应可以归因于其序列差异、其与HSPB1结合位点的同源性、其对MK2激酶活性向不同的靶蛋白结合位点的差异抑制、或其组合。
实施例7.施用MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)有效地阻断特发性肺纤维化预防模型中的系统性T-细胞活化
最近的研究强调了T淋巴细胞在博来霉素诱导的纤维化中的关键作用(Wilson,M.等,The Journal of Experimental Medicine,207(3):535-552,2010)。因此,为了调查脾(全)T细胞在利用MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)处理的博来霉素损伤的小鼠中的功能性作用,自体混合淋巴细胞反应(MLR)如先前描述的进行(Wilkes,D.等,Journal of Leukocyte Biology,64(5):578-586,1998,其通过引用并入本文)。具体地,在测定中检查C57BL/6纯化抗原呈递细胞诱导C57BL/6T淋巴细胞中的增殖的能力。
C57-BL/6小鼠在第0天经历博来霉素损伤。在第7天直到第21天,小鼠通过腹膜内(IP)注射或喷雾器(NEB)每天施用50μg/kg/天的MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQID NO:1)。脾T细胞被分离,并单独地或在存在自体抗原呈递细胞(来自C57-BL/6小鼠的APC)的情况下培养或利用针对CD3(α-CD3)的抗体刺激48h。然后,利用磨碎的腺苷放射性标记细胞16h并且评估增殖速率。
如图14中所示,不管如何处理,T细胞单独地展示出非常低的增殖能力。然而,当T细胞与自体抗原呈递细胞(即,从C57-BL/6小鼠分离的APC)共培养时,博来霉素损伤的小鼠的增殖能力比对照小鼠高。有趣地,在存在抗原呈递细胞的情况下看到的来自博来霉素处理的小鼠的T细胞的增殖通过全身施用MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)显著地减少,但是如期望的,不是通过吸入模式。这些数据表明MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)对脾T细胞活化的抑制,并且指示MK2抑制肽为纤维化预防性的。
还通过利用针对α-CD3的抗体多克隆T细胞活化剂刺激细胞来确认T细胞的活力。与处理组无关,α-CD3诱导细胞的强健增殖。对多克隆活性剂的增殖反应表明MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)肽抑制剂不影响脾T细胞的功能性质,并且在此特定剂量下施用MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)不存在毒性。此外,缺少对雾化的MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)的脾T细胞应答表明在此肽递送模式的情况下发生的极少的全身分布。
实施例8.全身或雾化的MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)处理在纤维变性后阶段保护博来霉素损伤的肺
如图10中描述的,典型的博来霉素模型已经广泛地用于预纤维变性阶段中的文献中以测试任意介入的功效。由于雾化和全身施用MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQID NO:1)二者显著地保护肺免于博来霉素诱导的纤维化,在纤维变性后阶段进一步检查全身(腹膜内)或局部(雾化)施用MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)在治疗博来霉素损伤的肺中的作用,药物介入在第14天开始,这是当肺被显著地纤维化的时间点(图15)(Pottier,N.等,American Journal of Respiratory and Critical CareMedicine,176(11):1098-1107,2007,其通过引用并入本文)。此模型中显示的疤痕化肺的救护是临床相关的,只要IPF患者的肺在诊断时已经是疤痕化的。
更具体地,通过气管内递送大约0.025U的博来霉素(溶解于PBS)至C57BL/6小鼠来诱导肺中的纤维变性位置。为了检查MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)在预纤维变性后阶段中的博来霉素损伤的肺的治疗的功效,从博来霉素递送后第14天开始直到博来霉素递送后第28天,每天腹腔内施用或经由喷雾施用对照(PBS)或MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)至小鼠。在博来霉素递送后第28天,利用MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)或对照(PBS)处理的博来霉素小鼠的肺组织被分离、固定、包埋在石蜡中、并且切片用于染色。利用戊巴比妥钠注射(120mg/kg)处死小鼠并且打开胸腔。结扎右主支气管并且移除右肺。气管被插管并且左肺在21cm H2O压力下灌注有4%甲醛。组织块然后被包埋在石蜡中,并且制备4-mm切片,并且利用苏木精和伊红(H&E;用于病理学检查)或利用马逊三色(用于胶原染色)进行染色。
如图16中所示,不管药物施用的模式,即,无论腹膜内递送或局部应用至肺,MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)处理“救护”严重疤痕化肺。采用组织学评估检查肺架构(苏木精和伊红(H&E)染色,上小图)和胶原分布(马逊蓝色三色染色,下小图)。组织化学结果显示虽然博来霉素损伤的肺是严重疤痕化的,但是MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)处理的小鼠具有更清楚的肺实质。
接着,通过使用整个左肺的标准的羟脯氨酸测定来定量地测定胶原沉积。通过分析博来霉素损伤后第28天的鼠肺中的羟脯氨酸浓度来评估总胶原(可溶的和不可溶的)沉积。从博来霉素损伤后第14天开始,通过腹膜内注射(IP)或喷雾器(NEB)以50μg/kg/天的剂量施用MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1))。
如图17中所示,与基线相比,在博来霉素损伤后第28天和开始MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)处理时,MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)处理显著地停滞胶原沉积的进一步进展。这是显著的,因为虽然当前的文献显示了药物研发中的有效预防,但是当IPF患者被诊断时,存在已经存在的纤维化。这些结果还表明MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)具有有效地停止或减慢疾病的进一步进展和改善生活质量的潜能;并且MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ IDNO:1)肽如果在较高的剂量下使用和/或持续更长的治疗周期可以导致肺组织学和病理学中甚至更大的改善,并且减少纤维化。
实施例9.全身或局部施用MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)与特发性肺纤维化的博来霉素小鼠模型中减少活化的MK2相关
如上面讨论的,MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)和其功能等价物在肺中的主要靶标之一是MK2激酶,其在受影响的肺中引发炎性和纤维变性反应。因此,为了进一步验证MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)的体内作用,在未处理的博来霉素损伤的小鼠以及MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)处理的小鼠中检查活化的MK2(磷酸化-Thr334-MAPKAPK2)的水平。
简略地,C57-BL/6小鼠在第0天经历博来霉素损伤。在博来霉素损伤后第14天直到第28天,小鼠通过腹膜内(IP)注射或喷雾器(NEB)每天施用50μg/kg的MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)。福尔马林固定的肺组织切片针对磷酸化-Thr334MK2进行免疫染色。对照染色利用生物素化的二次IgG抗体。链亲和素缀合的辣根过氧化物酶与3,3’-二氨基联苯胺一起用作底物,并且利用苏木精复染细胞核。然而,博来霉素小鼠显示了如果不处理活化的MK2存在(黑色结节)中可视的增加,最特别地在显著的胶原沉积的区域中,利用MMI-0100处理的小鼠展示出与正常组织相似的活化的MK2存在,而且这样的分布集中于外周气道和血管区域。
如图18中所示,不论递送模式,即,或者全身施用或者局部施用,与对照相比,雾化或气管内施用MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)与博来霉素小鼠模型中降低的磷酸化-Thr334-MAPKAPK2染色(MK2的活化形式)相关联。
实施例10.MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)下调特发性肺纤维化治疗模型中的炎性细胞因子
MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)可以通过其抑制肺中的纤维化形成的一种潜在机制是通过降低促炎细胞因子的局部浓度,并且从而制止单核细胞的募集和通过肺中的巨噬细胞的细胞外重构(例如,增加胶原沉积、增加细胞粘附和迁移、降低基质降解)。为了探索这种可能性,通过在利用MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ IDNO:1)腹膜内治疗或经由喷雾治疗后测量白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平的变化,检查MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)肽抑制促炎细胞因子的产生的能力。
白介素-6(IL-6)是多功能细胞因子,其主要作用包括免疫球蛋白合成的增强、T细胞的活化、和急性期蛋白质合成的调节。已经许多不同类型的细胞产生IL-6,包括单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞和成纤维细胞,并且这些细胞中IL-6基因的表达由各种诱导物调节。白介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子(TNF-α)是IL-6基因表达的两种关键的已知诱导物。其它诱导物包括蛋白激酶C的活化剂、钙离子载体A23187、和引起细胞内环AMP(cAMP)水平升高的多种药剂。
肿瘤坏死因子(TNF,也称为TNF-α)是参与系统性炎症的细胞因子,并且是刺激急性期反应的细胞因子组的成员。研究已经显示TNF-α经由细胞内部三种不同的信号传导途径诱导IL-6的表达,即,1)NF-κB途径、2)MAPK途径、和3)死亡信号传导途径。
如图20中所示,在特发性肺纤维化的博来霉素小鼠模型中,气管内(BLEO+MMI-0100(IP))或雾化(BLEO+MMI-0100(NEB))施用MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ IDNO:1)显著地减少TNF-α(A,上小图)和IL-6(B,下小图)二者的血浆水平。
实施例11.全身或局部施用MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)有效地阻断由博来霉素损伤造成的显著疤痕化鼠肺中的成肌纤维细胞活化积聚。
特发性肺纤维化(IPF)的标志是纤维变性病变处成肌纤维细胞的积聚和丰富的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)成肌纤维细胞活化的标志物的表达。此外,活化的成肌纤维细胞部分地负责肺实质的僵化和肺功能的恶化。
因此,在利用MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)全身(经由腹膜内施用)或局部(经由喷雾)处理的博来霉素损伤的小鼠的肺中评估博来霉素损伤的肺中α-SMA的表达水平。如图21中所示,与未处理的博来霉素损伤的肺中α-SMA的水平相比,α-SMA的水平在MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)处理的肺中被显著地减弱。
实施例12.MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)在调节TGF-β1诱导的成肌纤维细胞活化中的体外剂量应答研究
特发性肺纤维化(IPF)的主要标志是存在非典型和凋亡上皮细胞,连同分泌旺盛量的基质蛋白(包括胶原、纤连蛋白和基质金属蛋白酶)的活化的成肌纤维细胞(Horowitz,J和Thannickal,V.,Treatments in Respiratory Medicine,5(5):325-42,2006)。在正常创伤愈合过程中,临时性基质由成肌纤维细胞形成为暂时支架。临时性基质的收缩导致随后的再上皮化和最终的创伤愈合。然而,当活化的成肌纤维细胞耐受凋亡时,由此导致的旺盛的胶原沉积导致基质的稳定化(Tomasek,J.等,Nature Reviews Molecular CellBiology,3(5):349-63,2002)。未受抑制的成肌纤维细胞增殖、活化和耐受凋亡的最终结果导致纤维变性病变以及由胶原沉积造成的稳定的基质,并且因而导致最终畸变的肺架构(Yamashita,C.等,The American Journal of Pathology,179(4):1733-45,2011)。
因此,由于成纤维细胞是参与疤痕形成的关键细胞,所以通过检查在利用TGF-β处理的培养的人胚胎肺成纤维细胞(IMR-90细胞)中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和纤连蛋白的蛋白质水平,评估MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)对成肌纤维细胞活化的作用。如图22和23中所示,MMI-0100(YARAAARQARAKALARQLGVAA;SEQ ID NO:1)以剂量依赖的方式有效地防止由TGF-β诱导的成肌纤维细胞活化,如由α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)(图22)和纤连蛋白(图23)二者的水平的降低显示的。
相比之下,如由成肌纤维细胞活化标志物α-平滑肌肌动蛋白(图21)和纤连蛋白(图23)的蛋白质水平中无变化指示的,测试剂量下的MMI-0200(YARAAARQARAKALNRQLGVA;SEQ ID NO:19)不影响TGF-β介导的成肌纤维细胞活化。不受限于理论,这些结果表明(1)所述发明的MK2抑制肽可以展示出针对具体组的激酶的抑制活性谱;(2)MMI-0100(SEQ IDNO:1)和MMI-0200(SEQ ID NO:19)可以区别地抑制MK2和其它激酶,这取决于应用的剂量,其有助于此抑制活性谱;(3)可能存在调节α-平滑肌肌动蛋白的代偿途径;(4)成肌纤维细胞形成和/或迁移也可能是纤维化的修复期的一部分,而不是纤维化的活性伤害;和(4)某一水平的MK2活性因此对发生的该过程是必需的(Liu等.,Am JRespir Cell Mol Biol,37:507-517,2007)。
此外,所述发明的MK2抑制肽源自MK2下游靶标HSPB1的底物结合位点。因此,它们可以竞争性抑制MK2向HSPB1的激酶活性。不受限于理论,MMI-0200(SEQ ID NO:19)对纤维化的差异效应可以归因于其序列差异、其与HSPB1结合位点的同源性、其对MK2激酶活性向不同的靶蛋白结合位点的差异抑制、或其组合。
实施例13.确定CD44和MK2分别地和组合地在调节小鼠模型中重度肺纤维化(SPF)慢性肺同种异体移植机能障碍(CLAD)的发展中的作用
重度肺纤维化(SPF)和慢性肺同种异体移植机能障碍(CLAD)是特征在于不可逆失去的肺功能和诊断在3-5年内死亡的障碍。IPF是最常见,以及最严重形式的SPF。除IPF之外,SPF可以在其它背景中发生,比如与结缔组织疾病(硬皮病、类风湿性关节炎)或与慢性超敏感性肺炎相关联。
肺移植(LT)是提高IPF中存活的唯一疗法。LT是晚期肺障碍的治疗选择,但是并发排斥,其具有超过全部其它实体器官移植的发生率和严重度(1-6)。长期存活取决于受体保持免于CLAD。CLAD在5年内影响>50%的LT受体(LTR),并且一旦确诊给予>50%的3年死亡率(1-6)。尽管CLAD是长期存活的主要障碍,但是当前不存在CLAD的早期检测、预防或治疗的有效手段(1-6)。
CLAD以前称作闭塞性细支气管炎综合征(BOS),并且是肺移植之后的主要死亡原因。虽然现在利用限制性同种异体移植综合征(RAS)的介绍良好地认识到CLAD的异质性,但是BOS仍被认为是最常见形式的CLAD。
CLAD被认为从引起同种异体移植气道/间质的纤维化的炎症演化。SPF是因呼吸衰竭导致死亡而不管药物治疗的一组障碍。SPF的主要原因是特发性肺纤维化(IPF)。IPF和CLAD共享不间断的细胞外基质(ECM)沉积和缺少对免疫抑制性疗法的应答的特征。此外,存在以下令人信服的证据:SPF和CLAD中间质和细支气管的进行性结疤是肺上皮和下面的间质之间的异常相互干扰的结果。
细胞外基质糖葡胺聚糖透明质酸(HA)在SPF和CLAD中沉积(7、8)。HA是炎症和纤维化的关键调节物(9、10)。CD44是HA的主要细胞表面受体,并且调节HA效应子功能(7、11、12)。
用于预防或治疗CLAD的标准方法涉及增强的免疫抑制。不幸地,这些策略大部分已经失败(1-6)。最近,中性白细胞增多症可以进展为CLAD的观察已经导致减少中性白细胞增多症的策略,包括利用大环内脂治疗。这些策略对于一些但不是大多数LTR起作用,其中大多数发展了CLAD。
由于存在可选的途径,调节这些途径的新策略可以证明对改进LTR中的结果关键。靶向细胞外基质沉积的抗纤维变性方法是否可能在SPF和CLAD二者中有效的是未知的,特别是如果它们也影响炎症。对进展的额外的关键屏障已经没有能力利用临床上安全的药物靶向TGF-β下游信号传导途径。这很可能是由于中和TGF-β对宿主防卫和抗肿瘤监督的有害作用。
活化的MK2在SPF和CLAD中二者也明显地上调。MK2靶向p38远端的TGF-β途径(13、14)。此外,TGF-β是HA产生的有效刺激物,因而关联以协同方式靶向MK2和CD44二者的药物的方法可以能够实现抗纤维变性作用而不负影响宿主防卫。
已经研发了概括了人疾病的关键方面和共享ECM糖葡胺聚糖透明质酸(HA)的显著沉积的特征的SPF和CLAD的小鼠模型。肺成纤维细胞中的HA表达促进浸润性表型的生成,其产生基质并且具有破坏肺架构的潜能。HA的主要细胞表面受体是粘附分子CD44。靶向严重肺纤维化中的CD44使浸润性成纤维细胞表型无效并且废除疾病。
LT中的流行病学研究已经主要地聚焦于对肺同种异体移植的多种“损害”(例如急性排斥(AR)、感染),其已经被认定为CLAD的风险因子。不管这些关联的意义,现实更复杂。许多LTR在损害后恢复正常肺功能,而其他可能永远不恢复或患有进行性机能障碍。当前,不存在预测给定患者的消极结果的方法。而且,此时不存在可获得的使此过程停滞的可靠治疗干预,更不必说逆转此过程。
主要的移植机能障碍(PGD)是LT之后对同种异体移植的首次损害。PGD由于其自身的移植过程(例如缺血再灌注损伤(IRI))出现,并且临床证明在LT后72hr具有低氧血症和放射照相浸润。至少轻度PGD是几乎普遍的(97%)。然而中度或重度PGD在多至30%的LTR中发生(10、20-23)。组织病理学上,PGD谱在轻度急性肺损伤(ALI)至重度弥散性肺泡伤害(DAD)的范围内。直接归因于重度PGD的死亡率可以高达40%(20)。PGD还对长期LT结果,包括CLAD的更大风险以及PGD的增加的严重度,具有“间接”作用(1-6、20)。此关联在2000年7月和2008年1月之间的移植的LT队列中被探索。此队列包括279例LTR;174(62%)例双侧和105(38%)例单侧LTR。在LT后72hr(T72),患者被分类为:无PGD(n=152),如果它们自始至终评分为0或1;短暂的PGD(n=76),在第一个48hr中评分≥2但是在72hr时评分0或1;或延长的PGD(n=46),在72hr时评分≥2。通过PGD种类构建和分层免于CLAD的Kaplan-Meier曲线。LT后5年中CLAD的发病率跨越具有转为最差的延长的PGD的组明显不同(P<0.05)(未显示)。在CLAD被认为是竞争风险前,使用具有死亡的原因特异性(cause specific)回归模型扩展在此发现。在此模型中,延长的PGD是CLAD的强烈风险因子(原因特异性HR 4.19,95%CI2.05-8.54,p<0.0001)。这些数据确认LT后围手术期PGD对长期结果的LT间接后果。
ALI与肺中重度炎症相关联。我们假设肺同种异体移植中提高的炎性环境将LTR置于具有任意损害的同种异体移植机能障碍的增加的风险下。LTR遭受的第一个损害是缺血再灌注损伤(IRI),并且具有由供体肺和宿主之间的相互作用造成的升高的炎性环境的那些将处于PGD以及CLAD的风险下。此外,此提高的炎性环境部分地由诱导具体的促炎途径的HA片段经由CD44→CCR2/受体生物学轴MMP-9和TGF-β驱动。这导致进一步的HA片段积聚和慢性炎性循环的永存,其导致CLAD形式的同种异体移植纤维组织形成。
根据一个实施方式,通过靶向SPF和CLAD的小鼠模型(其概括人疾病(UH2)的要素并且在从患有SPF和CLAD二者的患者分离的成纤维细胞中)中的CD44和MK2减少SPF和CLAD二者的病理的方法包括将靶向CD44(其已经显示调节炎症和纤维化二者)的全身途径与使用MK2抑制剂(MK2i)的吸入途径结合,所述MK2抑制剂(MK2i)靶向关键的信号传导途径(TGF-β)以靶向不间断的纤维化中的协同和非冗余途径。这些治疗靶标主要地涉及单核吞噬细胞、上皮细胞和成纤维细胞途径。此外,CD44和MK2似乎调节浸润性成纤维细胞的攻击行为,其可以是不间断的纤维化的基本特征。
(1)升高的支气管肺泡灌洗液(BALF)浓度的HA与PGD相关联
与PGD HA相关联的升高的BALF浓度的HA是ECM的主要组分(10、21)。它可以在通常下调炎症的正常生理条件下作为高分子聚合物(HMW-HA)存在。然而,在组织不良应激/损伤期间,HMW-HA还可以经历导致低分子量种类(LMW-HA)的积聚的动态变化,其可以使慢性炎症保持(12、23-25)。为了调查PGD期间的此过程,评估LT后第一个24小时内从上面描述的队列收集的BALF样本,其被递送至我们的研究实验室进行IRB批准的肺同种异体移植机能障碍的生物学机制的研究。78个BALF样品可以用于分析;20个无PGD,36个短暂的PGD,和14个延长的PGD。在LT后第一个24小时中测量的BALF HA浓度与延长的PGD显著地相关联(图26)。我们承认本文使用的ELISA不能区分LMW-HA与HMW-HA。然而,未来建议的研究将使用浓缩的BALF的琼脂凝胶电泳来可视化和半定量化高与低MW-HA。尽管如此,这些发现支持HA驱动提高的炎性环境的潜在作用,在损害期间,IRI导致PGD。
CD44是HA的主要的细胞表面结合蛋白;因而,PGD活检样品通过免疫组织化学(IHC)评估CD44表达。CD44在支气管与肺泡上皮细胞、浸润性单核细胞、肺泡巨噬细胞(AM)和成纤维细胞上表达(图27)。总之,这些数据表明HA和CD44之间的相互作用可以代表PGD以及CLAD的发病机理中的关键途径。
(2)BALF TGF-β浓度关联MMP-9和前胶原并且与CLAD的发展相关联
HA与CD44的相互作用被报道通过多种细胞类型增加潜伏性TGF-β表达(10、21、22)。因而我们通过Luminex评估酸化BALF以及前胶原中活性TGF-β的蛋白质浓度,并且发现如HA所见的相同的趋势(未显示)。重要地,TGF-β关联前胶原(未显示)以及MMP-9(未显示)。PGD样品中TGF-β的细胞来源是支气管上皮细胞、浸润性单核细胞和肺泡巨噬细胞(AM)(CIP图3A&B)。受体,TGF-βR1主要在成纤维细胞、浸润性单核细胞、AM和支气管上皮细胞上表达(图28C、D、E)。op后第0天BALF样品中TGF-β的ROC分析证明TGF-β>122pg/ml对发展具有0.75的AUC的CLAD具有敏感性=0.70,特异性=0.78,这表明BALF TGF-β作为生物标记物的潜在利用。与那些具有TGF-β<122pg/ml的45%相比,具有BALF TGF-β>122pg/ml的患有或未患有PGD的任何患者具有80%的可能性在3年内发展CLAD。除其预后能力之外,根据一个实施方式,TGF-β也可以用作生物标记以鉴定LTR,其将最得益于抗CD44和/或MK2抑制剂治疗。这些数据加强了研发拮抗TGF-β下游信号传导的药物的重要性。
(3)BALF CCL2浓度预测CLAD的发展
初步体外研究证明与HMW-HA或无刺激相比(未显示),从周围血分离并且利用LMW-HA刺激的单核细胞显示了显著增加表达的CCL2和CCR2。这指引我们评估op后第0天的BALFCCL2浓度。类似于HA,升高的CCL2与延长的PGD相关联(未显示)。CCL2的细胞来源是支气管上皮细胞、AM和浸润性单核细胞(图29A&B)。CCL2的主要受体是CCR2,其由浸润性单核细胞在气管周围和间质内表达(图29C)。这表明HA正在上调CCR2/受体生物学轴,其在气管周围和间质中发生CLAD的区域表达CCR2的单核细胞的募集和停留是重要的。重要地,与那些低于中值的5年内42%相比(未显示),大于中值(1.79ng/ml)的BALF CCL2浓度具有78%的可能性在5年内发展CLAD。共同地,我们的数据表明LT 24hr内HA、TGF-β、MMP-9(经由将潜伏性TGF-β转化为活性TGF-β)、和CCL2部分地负责提高的炎性环境,其在导致PGD的IRI期间得到增加。此炎性环境随着从PGD恢复“部分地”消除,然而其持久性将LTR置于CLAD的风险下。
(4)p-MK2在患有PGD的人中的上皮、单核细胞和成纤维细胞中表达
我们怀疑慢性炎症部分地因上皮、单核吞噬细胞和成纤维细胞上HA与CD44的相互作用发生。然而,HA还与其它HA结合蛋白比如CD168相互作用(7、26、27)。重要地,经由CD168的HA的信号传导途径不同于CD44并且涉及p-3途径(28)。抑制p-38信号传导对纤维增殖性障碍具有深刻影响;然而其体内用途受限于肝毒性。MK2是p-38的下游并且MK2抑制剂用途不与肝毒性相关联(29)。MK2途径调节TGF-β并且已经涉及炎症和纤维化(29)。重要地,在人PGD期间,我们发现上皮、AM、浸润性单核细胞和成纤维细胞具有p-MK2的细胞核和细胞质染色(未显示),其与在PGD和CLAD的发病机理起作用的关键细胞中的此途径的活性一致。此外,考虑到人生物学的复杂度,预防/治疗疾病比如CLAD的最有效的方法可能需要靶向多种途径(例如HA-CD44和可选的HA-CD168→MK2途径)。
(5)临床前动物实验
关于动物实验,利用异位气管移植(HTT)模型生成我们的初步数据中的一些(使用在小鼠中发现的最严格的MHC I/II类不同组合错配:BALB/c(H-2d)气管皮下移植入C57BL/6(H-2b)小鼠的上背(同种异体移植),和C57BL/6→C57BL/6小鼠(同系移植))。
人肺异型损伤(alloinjury)的最佳可获得的模型是鼠原位左单LT(mOLT)模型。未处理的此模型导致早期弥漫性肺同种异体移植炎症/排斥和稍晚的严重实质纤维化。晚期排斥的肺相对于BOS更接近地类似于CLAD的限制性同种异体移植综合征(RAS)表型,虽然发生一些闭塞性细支气管炎(OB)病变。
使用mOLT模型品种组合(C57BL/10→C57BL/6)将证实该发现,其已经描述为具有更显著的OB病变(30)以及与发现相同的RAS。
(a)在排斥期间来自同种异体移植物的增加的HAS-2、CD44、CD168、CCL2、CCR2、MMP-9、TGF-β和MK2表达。
基于人数据,探索动物排斥模型以确定是否存在起作用的相似的生物学。使用HTT模型,评估第14天时间点,因为这些同种异体移植物具有最高的炎症和早期纤维闭塞,但是协同控制是正常的。使用全移植物匀浆,发现与通过qPCR的协同控制相比,负责从同种异体移植物产生HA(31)、CD44、CD168、MMP-9、CCL2、CCR2、TGF-β和MK2的HA合酶2(HAS-2)增加(图30)。第7天使用mOLT同种异体移植模型的确证研究证明CD44由浸润性单核细胞和AM表达,并且p-MK2发现于淋巴细胞、单核吞噬细胞和上皮细胞(未显示)。
(b)抗CD44Ab与MK2抑制剂(MK2i)结合明显地减少完全不匹配的mOLT模型中的排斥。
基于表明这两条途径与CLAD相关联的我们的人和动物模型,进行给予供体(第-2、-1天)和受体(第-2、-1、0、1、2、3、4天)的抗CD44Ab结合MK2i的体内被动免疫,并且与适当对照处理的小鼠相比,在第5天评估肺同种异体移植物。抗CD44+MK2i处理显著地减少从Grade A(3/4)(重度血管周围浸润)至A(1/2)(轻度血管周围浸润)的血管排斥异己从GradeB2R(具有上皮细胞损伤的高级浸润)至Grade B0(基本上无排斥)的气道排斥,其确认这些途径在排斥期间的重要性(图31)。据我们所知,这将是涉及潜在可转移疗法(potentiallytranslatable therapy)的第一次研究,所述疗法可以用于人,其减弱攻击性鼠模型系统中的排斥而不需要其它同步免疫抑制药物。
(c)CD44缺陷型小鼠中减少的肺纤维化
为了表征透明质酸合酶2(HAS2)在疾病发病机理中的作用,靶向人HAS2表达至α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)-表达细胞来生成转基因小鼠系。ASMA-HAS2转基因小鼠正常发育并且展示出基线处的大气道和血管周围的HA的增加。在博来霉素损伤之后,它们在损伤后在肺间质和肺泡空间二者中积聚增加浓度的HA,并且展示出死亡率的明显增加(7)。
ASMA-HAS2转基因小鼠在WT中的纤维变性反应减弱的时间点(28天)展示出无休止的纤维化和微观的蜂窝样。这些转基因小鼠中纤维化的增加取决于CD44的存在。在ASMA-HAS2转基因小鼠与CD44缺陷型小鼠杂交的博来霉素模型中存在减少的肺纤维化(图32),这表明CD44在肺纤维化中起作用。
(d)抗CD44Ab减少ASMA-HAS2转基因小鼠中的肺纤维化。
CD44是粘附分子,其遍在地表达并且已经显示在细胞募集、迁移和肿瘤细胞转移中起重要作用(32)。CD44是主要的HA受体并且对巨噬细胞清除来自炎症位点的HA是必需的(12)。CD44在博来霉素诱导的肺损伤之后被上调(7)。采用利用抗CD44中和Ab的两种治疗方案:预防性(在博来霉素之前12h或之后5d腹膜内给予Ab)(图33A)或治疗性(在博来霉素损伤后第7、14和21天)(图33B)。利用两种方案,肺胶原积聚在ASMA-HAS2转基因小鼠中显著地减少(图33)。
(e)活化的MK2在IPF对非IPF中区别地表达
为了确认MK2在IPF中的临床相关性,利用针对活化的MK2的抗体,通过免疫组织化学分析来自IPF和非IPF患者活组织检查的肺组织外植体中的活化的MK2表达。与来自未患有IPF的患者的活检组织相比,更高水平的活化的MK2表达在IPF肺,特别在成纤维细胞和上皮中(33)。
(f)肺纤维化的博来霉素模型中的活化的MK2表达。
如上所述,调查博来霉素损伤后博来霉素损伤的小鼠的肺中活化的MK2的时序表达。观察到与PBS滴注的小鼠相比,博来霉素损伤后第7和14天时活化的MK2的强烈表达(33)。
(g)治疗量的氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的多肽MK2i改善肺纤维化
如上面的实施例中描述的,此肺纤维化的博来霉素模型被用于调查每天施用的MK2抑制剂MMI-0100在治疗或逆转已经建立的纤维化中的功效。C57Bl/6小鼠接受气管内博来霉素滴注(0.025U;第0天),接着经由局部(吸入)或全身(腹膜内)途径施用的MMI-0100(37.5μg/kg)。MMI-0100或PBS每天给药持续14d,从博来霉素损伤后第14天开始。无论局部或全身递送,纤维化的进展被MMI-0100抑制,如通过胶原沉积,成肌纤维细胞分化和活化的MK2表达确定的(33)。
实验设计
施用鼠HTT模型获得的这些数据证明气道同种异体移植物具有增加表达的HAS-2、CD44和MK2以及其下游介体、CCR2/受体生物学轴MMP-9和TGF-β。mOLT模型证明利用两种途径(CD44&MK2)的抑制排斥的减弱,其表明这些级联参与排斥并且可以转化为预防/治疗人中的CLAD的治疗性选择。
HA-CD44途径在排斥期间的作用:从第-2天开始并且每天直到第3、7、14和28天采集肺同种异体移植物,我们将仅在受体(随后仅供体,然后供体和受体)中使用抗CD44Ab进行体内中和研究。我们将尝试不同的浓度和开始时间,希望在LT(供体、受体或二者)之前12hr开始药物将是有效的,因而使得其易于转移至人临床领域。还将利用CD44-/-小鼠:BALB/c→CD44-/-C57BL/6、CD44-/-BALB/c→C57BL/6、CD44-/-BALB/c→CD44-/-C57BL/6进行实验,其将确定供体对受体CD44在排斥过程中的作用(对临床药物递送靶标重要)。肺将被采集用于病理学评分(A&B Grading),其由肺病理学家以及下游介体(HA、CD168、CCL2、CCR2、MMP-9、TGF-β、TGF-βR1、MK2/p-MK2)以及炎症变化(同种异体移植消化物的流式细胞术)和纤维组织形成(胶原、HP和αSMA染色)进行。
MK2i在排斥期间的作用:我们将进行如上面概述的类似的实验,使用吸入或i.p.递送的MK2i以及MK2-/-小鼠。由于使用mOLTx模型的我们的免疫组织化学研究展示了p-MK2的淋巴细胞系,我们将在Rag1-/-s/p LT中进行T-细胞(和T-细胞亚群)AT实验(例如使用MK2i处理的T细胞或MK2-/-T细胞和亚群)。
抗CD44和MK2i在排斥期间的作用:我们将经由联合疗法和组合敲除小鼠进行如上面概述的类似的实验。
确定抗人源化CD44抗体在调节ASMA-HAS2小鼠的纤维变性表型中的作用:我们将测试人源化抗CD44抗体在我们的肺纤维化的小鼠模型中的功效。8-10周龄的ASMA-HAS2+小鼠和WT同窝对照将利用1.25-5U/kg的IT博来霉素处理,并且将i.p.施用抗CD44中和Ab或同种型对照。抗体将在博来霉素损伤时和7天间隔直到第21天施用。将在第28天进行分析。此外,将进行治疗试验,由此抗体在博来霉素处理后第7天和7天间隔直到第28天施用,并且将在第35天进行胶原含量的分析。数据显示将包括三色染色、羟脯氨酸含量、和αSMA染色。
确定MK2抑制在调节ASMA-HAS2小鼠的纤维变性表型中的作用:
8-10周龄的ASMA-HAS2小鼠和WT小鼠8-10将利用1.25-5U/kg的IT博来霉素处理,并且将i.p.施用MK2i。MK2i将在博来霉素损伤时每天直到第21天施用。将在第28天进行分析。此外,将进行治疗试验,由此MK2i将在博来霉素处理后第7天直到第28天每天施用,并且将在第35天进行胶原含量的分析。数据显示将包括三色染色、羟脯氨酸含量、αSMA染色、和BAL与肺组织中的HA含量。
抗CD44和MK2i在肺纤维化中的作用:8-10周龄的ASMA-HAS2+小鼠和WT对照将利用1.25-5U/kg的IT博来霉素处理,并且将联合施用抗CD44Ab和MK2抑制剂。数据显示将包括第21和28天的三色染色、羟脯氨酸含量、和αSMA染色。
实施例14.确定CD44和MK2在调节浸润性成纤维细胞的发育和调节在从患有IPF和CLAD的患者分离的成纤维细胞中的基质产生的作用。
成纤维细胞在调节组织重构中是关键的效应细胞。在组织损伤和重构的位点处,也存在成肌纤维细胞的积聚(34)。虽然相当的证据已经积累了对成纤维细胞表达αSMA至关重要的限定的介体比如TGF-β(35、36)和PDGF(37),并且假设了收缩功能,不存在体内证据证明控制αSMA-表达细胞调节组织纤维化的长期性。我们已经基于癌症转移模型研发了进行性肺纤维化的新型模型。HA由间充质细胞和各种肿瘤细胞产生,并且已经表明通过与其关联细胞表明受体CD44的相互作用有助于肿瘤转移(38、39)。我们假设纤维变性成纤维细胞获得对进行性纤维发生至关重要的浸润性表型,并且CD44在调节该过程中其关键作用。我们利用测定系统,其中成纤维细胞被评估其自发地浸润基质胶(Matrigel)(具有基底膜成分的复合基质)的能力。此测定已经用于分析癌症细胞的转移潜能(40)。
(a)浸润性表型。
我们已经假设IPF的基本特征是已经发展出促进基质浸润的基因程序的浸润性成纤维细胞表型的发展。为了确定从重度进行性和破坏性纤维化的ASMA-HAS2转基因小鼠模型获得的数据是否与人肺纤维化相关,我们分离从患有IPF的患者分离原代肺成纤维细胞并且分析它们的浸润能力。与从正常肺组织分离的成纤维细胞相比,我们发现IPF成纤维细胞的浸润能力的显著增加(图34)。
(b)抗CD44Ab阻断纤维化。
在肺损伤时全身施用抗CD44封闭性抗体或同种型匹配的对照。我们发现肺胶原积聚在存在抗CD44Ab的情况下在ASMA-HAS2转基因小鼠中显著地减少(图35)。
(c)抗CD44Ab抑制IPF成纤维细胞浸润。
我们利用识别人CD44的抗CD44Ab(由Hoffman LaRoche提供)处理IPF成纤维细胞,并且证明了浸润的明显减少(图36)。这些数据表明无休止的肺纤维化取决于由HA和CD44调节的基质浸润性成纤维细胞表型。
(d)抗CD44Ab抑制小鼠成纤维细胞浸润。
为了确定CD44在成纤维细胞浸润中的作用,我们检查了博来霉素处理后从CD44缺失小鼠分离的成纤维细胞的浸润能力,并且发现了受损的浸润能力(未显示)。类似的结果由从ASMA-HAS2+/CD44–/–小鼠分离的成纤维细胞发现(图37A)。此外,利用抗CD44Ab治疗从博来霉素激发的野生型C57Bl/6J小鼠分离的成纤维细胞减弱成纤维细胞浸润(图37B)。
(e)MK2i抑制小鼠成纤维细胞浸润。
为了确定MK2在成纤维细胞浸润中的作用,我们利用MK2抑制剂(MK2i或MMI-0100)处理来自WT或ASMA-HAS2的成纤维细胞。在8μm处,MK2i显著地减少成纤维细胞浸润(图41)。
(f)MK2i抑制人IPF成纤维细胞浸润。
MK2抑制剂(MK2i)能够抑制IPF成纤维细胞的浸润能力(图39)。
实验设计
A)确定CD44在浸润表型中的作用:将从患有IPF和CLAD的患者分离人成纤维细胞,并且将实施基质胶浸润测定。我们已经拥有IPF成纤维细胞(7、41),并且更多的将在外科肺活检查时或在移植时从肺外植体获得。来自CLAD患者的成纤维细胞将入先前描述的从BALF(42)以及在CLAD的再移植期间从肺外植体获得。人源化抗CD44Ab和同种型对照Ab将被添加至培养物(上部小室),并且将评估成纤维细胞的浸润。将测试Ab的多种剂量和治疗时机以发现最佳Ab剂量和持续时间。
B)测定MK2在浸润表型中的作用:从患有IPF和CLAD的患者分离的成纤维细胞将经历基质胶浸润测定。MK2i将被添加至培养物(上部小室),并且将评估成纤维细胞的浸润。将测试抑制剂的多种浓度和治疗时机以发现最佳剂量和持续时间。
C)成纤维细胞浸润中的抗CD44和MK2i:从患有IPF和CLAD的患者分离的成纤维细胞将经历基质胶浸润测定。将对抗CD44Ab和MK2i组合进行成纤维细胞浸润能力的测试。
D)测定CD44在基质产生中的作用:将利用人源化抗CD44Ab和同种型对照Ab处理从患有IPF和CLAD的患者分离的成纤维细胞。将收集上清液和细胞团以通过HA ELISA测定HA产生,通过ELISA测定胶原释放,胶原和纤连蛋白蛋白质表达将通过蛋白质印迹测定。
E)测定MK2在基质产生中的作用:将利用MK2i处理从患有IPF和CLAD的患者分离的成纤维细胞。将收集上清液和细胞团以通过HA ELISA测定HA产生,通过ELISA测定胶原释放,胶原和纤连蛋白蛋白质表达将通过蛋白质印迹测定。
F)成纤维细胞浸润中的抗CD44和MK2i:将利用抗CD44和MK2i组合处理从患有IPF和CLAD的患者分离的成纤维细胞。将收集上清液和细胞团以通过HA ELISA测定HA产生,通过ELISA测定胶原释放,胶原和纤连蛋白蛋白质表达将通过蛋白质印迹测定。
实施例15.通过从重度肺纤维化和CLAD的小鼠模型二者分离的AT2细胞和从患有IPF的患者分离的原代AT2细胞和从患有CLAD的患者分离的支气管上皮细胞,确定MK2在抑制成纤维细胞的活化中的作用。
当前的教条表明肺纤维化是上皮间充质障碍(18)。已知当上皮细胞损伤时,细胞因子和其它物质被释放入BAL流体。然而,极少知道损伤的上皮细胞如何活化成纤维细胞和成肌纤维细胞。最近的研究表明损伤的上皮细胞产生活化成纤维细胞的因子以产生可以有助于进行性肺纤维化的基质和潜在地发展阻塞性效应子功能(45)。损伤的肾上皮细胞还可以释放包含TGF-β的外来体,其导致成纤维细胞活化(46)。通过电子显微镜的早期经典研究揭示AEC1细胞不与成纤维细胞接触,而AEC2细胞通过其足突与成纤维细胞相互作用(47)。当肺损伤时,存在上皮间质性细胞接触的增加,其与更不连续的基底膜相关联(47),这表明瞬时细胞接触的增加反映涉及AEC2完整性和分化的直接的细胞间信号,并且这还可以提供用于的成纤维细胞活化的手段。鉴定可以“镇静(quiet)”或“抚慰(sooth)”损伤的上皮的药物将是领域中的重要突破。
MK2可以通过TGF-β刺激在成纤维细胞中活化,并且通过博来霉素损伤在肺中活化(33)。局部和全身MK2抑制阻止博来霉素诱导的纤维化,并且通过抑制性SMAD和IL-1β的调节改善已经建立的纤维化(33)。MK2i也抑制成肌纤维细胞分化和促炎细胞因子产生(33)。
我们假设MK2可以通过损伤的上皮细胞参与成纤维细胞的活化,并且我们已经研发出评估小鼠和人二者中的活化的工具。这由最近的数据支持:YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)被间皮细胞摄取并且抑制TFG-β诱导的细胞因子释放(16)。
(a)损伤的原代AEC2细胞活化间充质细胞。
最近研发出共培养系统以确定损伤的原代AEC2细胞是否可能活化成纤维细胞。使用插入式细胞培养皿测定系统实施最初的实验,其中原代AEC2细胞从具有/不具有博来霉素处理(第7天)的小鼠分离,并且铺覆在插入式细胞培养皿的上部小室中,并且来自WT小鼠的原代肺成纤维细胞被铺覆在下部小室中。损伤的AEC2能够活化成纤维细胞,如通过增加表达的α-SMA、胶原I和纤连蛋白测定的(图15)。这些数据与以下最近的报道一致:损伤的肾上皮细胞产生增加数目的包含TGF-β的外来体以活化成纤维细胞(46)。活化因子是未知的,但是测定系统是稳健的。
(b)人AEC2细胞的分离。
最近已经证明小鼠中的AEC2细胞是干细胞;分离人AEC2细胞的流式分选方法已经被研发,并且将被利用(46)。
实验设计:
在插入式细胞培养皿共培养实验中,AEC2细胞将被铺覆在插入式细胞培养皿插件(insert)上而且成纤维细胞在下部小室中。在共培养上皮细胞和成纤维细胞后24小时,MK2i将被添加至下部小室。在实验结束时,将移除上部小室,并且将收集上清液和成纤维细胞用于分析。将利用蛋白质印迹和/或ELISA测量基质分子(Col1、透明质酸和FN),并且将利用α-SMA免疫荧光染色和蛋白质印迹评估成肌纤维细胞分化。
A)博来霉素损伤的AEC2细胞:原代AEC2细胞将在博来霉素后7天从博来霉素损伤的小鼠肺分离(48),并且原代小鼠肺成纤维细胞将从未处理的健康小鼠分离。MK2i将在共培养后24小时以多种浓度添加至下部小室。将通过基质蛋白表达和成肌纤维细胞分化评估MK2i对成纤维细胞活化的抑制作用。
B)来自CLAD的细支气管上皮细胞:原代细支气管上皮细胞将从原位左单LT(mOLT)模型纯化(48),并且原代小鼠肺成纤维细胞将从未处理的健康小鼠分离。MK2i将在共培养后24小时添加至下部小室。将通过基质蛋白表达和成肌纤维细胞分化评估MK2i对成纤维细胞活化的抑制作用。
C)IPF AEC2:原代人AEC2细胞将在LT时从IPF外植体肺分离(48)。MK2i将在共培养后24小时添加至下部小室。将通过基质蛋白表达和成肌纤维细胞分化评估MK2i对成纤维细胞活化的抑制作用。
D)细支气管上皮细胞from CLAD:原代细支气管上皮细胞将被纯化并且铺覆在插入式细胞培养皿插件上,并且原代人肺成纤维细胞将铺覆在下部小室中。MK2i将在共培养后24小时添加至下部小室。将通过基质蛋白表达和成肌纤维细胞分化评估MK2i对成纤维细胞活化的抑制作用。
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虽然已经参考其具体实施方案描述了所述发明,但是本领域技术人员应当理解,可以做出多种改变并且可以进行等价物替换,而不背离本发明的真实精神和范围。此外,对于所述发明的客观精神和范围,可以进行很多修改以适应具体的情况、材料、物质组成、过程、过程步骤或多个步骤。所有这样的修改都意欲落入所附权利要求的范围内。
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Claims (43)
1.在肺移植后减弱肺同种异体移植机能障碍的方法,包括施用组合物,所述组合物包括
a.抗体组分,其包含治疗量的抗CD44抗体;和
b.MK2抑制剂(MK2i)组分,其包含治疗量的氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQID NO:1)的MK2抑制剂(MK2i)多肽,或在功能上等价于其治疗结构域的选自氨基酸序列KALARQLAVA(SEQ ID NO:8)的多肽、氨基酸序列KALARQLGVA(SEQ ID NO:9)的多肽和氨基酸序列KALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的多肽的至少一个肽,或其功能等价物,和药学上可接受的载体;
其中所述组合物对协同地减少所述肺同种异体移植机能障碍的至少一种病理有效。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述肺同种异体移植机能障碍特征在于与正常健康对照对象的组织中的促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的活性相比,所述组织中促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的异常活性。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述肺同种异体移植机能障碍是原发性移植机能障碍。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述肺同种异体移植机能障碍是慢性肺同种异体移植机能障碍。
5.根据权利要求1所述的方法,其中全身施用所述组合物的所述抗CD44抗体组分。
6.根据权利要求1所述的方法,其中全身施用或通过吸入施用所述MK2i组分。
7.根据权利要求1所述的方法,其中所述同种异体移植机能障碍特征在于炎症。
8.根据权利要求1所述的方法,其中当与对照比较时,所述组合物对下列有效:(i)调节TGFβ、CCL2、透明质酸和MMP9中的至少一个;(ii)降低TNFα、IL6或其组合的血浆水平;(iii)减弱α-平滑肌肌动蛋白的表达;(iiv)阻止TGFβ诱导的成肌纤维细胞活化;(v)抑制成纤维细胞浸润;或其组合。
9.根据权利要求1所述的方法,其中所述多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物是氨基酸序列FAKLAARLYRKALARQLGVAA(SEQ ID NO:3)。
10.根据权利要求1所述的方法,其中所述多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物是氨基酸序列KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA(SEQ ID NO:4)。
11.根据权利要求1所述的方法,其中所述多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物是氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLAVA(SEQ ID NO:5)。
12.根据权利要求1所述的方法,其中所述多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物是氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVA(SEQ ID NO:6)。
13.根据权利要求1所述的方法,其中所述多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物是氨基酸序列HRRIKAWLKKIKALARQLGVAA(SEQ ID NO:7)。
14.根据权利要求1所述的方法,其中所述载体选自控释载体、延释载体、缓释载体、和长期释放载体。
15.根据权利要求1所述的方法,其中所述药物组合物的所述MK2i组分是干粉的形式。
16.根据权利要求15所述的方法,其中所述干粉包括具有1至5微米的质量中值空气动力学直径(MMAD)的微粒。
17.根据权利要求1所述的方法,其中经由吸入装置施用所述治疗量的所述药物组合物的所述MK2i组分。
18.根据权利要求17所述的方法,其中所述吸入装置是喷雾器。
19.根据权利要求17所述的方法,其中所述吸入装置是定量吸入器(MDI)。
20.根据权利要求17所述的方法,其中所述吸入装置是干粉吸入器(DPI)。
21.根据权利要求17所述的方法,其中所述吸入装置是干粉喷雾器。
22.用于治疗特征在于对象的组织中异常的成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积的重度肺纤维化的方法,包括:
向所述对象施用药物组合物,所述药物组合物包括
a.抗体组分,其包含治疗量的抗CD44抗体;
b.MK2抑制剂组分,其包含治疗量的氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的MK2抑制剂(MK2i)多肽,或在功能上等价于其治疗结构域的选自氨基酸序列KALARQLAVA(SEQ ID NO:8)的多肽、氨基酸序列KALARQLGVA(SEQ ID NO:9)的多肽和氨基酸序列KALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的多肽的至少一个肽,或其功能等价物,和药学上可接受的载体;
其中所述组合物对协同地减少所述对象的组织中的所述成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积有效。
23.根据权利要求22所述的方法,其中所述重度肺纤维化是特发性肺纤维化。
24.根据权利要求22所述的方法,其中重度肺纤维化由施用博来霉素造成。
25.根据权利要求22所述的方法,其中重度肺纤维化进一步特征在于所述组织中的炎症。
26.根据权利要求25所述的方法,其中所述炎症由选自肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和白介素-1β(IL-1β)的至少一种细胞因子介导。
27.根据权利要求22所述的方法,其中所述组织中的所述异常的成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积特征在于与正常健康对照对象的所述组织中的促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的活性相比,所述组织中促分裂原活化蛋白激酶-活化的蛋白激酶2(MK2)的异常活性。
28.根据权利要求22所述的方法,其中所述重度肺纤维化特征在于选自以下的至少一种病理:与正常健康对照对象相比,肺间质中细胞外基质蛋白的异常沉积、肺中成纤维细胞增殖的异常促进、成肌纤维细胞分化的异常诱导、和成肌纤维细胞附着至细胞外基质的异常促进。
29.根据权利要求22所述的方法,其中全身施用所述组合物的所述抗CD44抗体组分。
30.根据权利要求22所述的方法,其中全身施用或通过吸入施用所述MK2i组分。
31.根据权利要求22所述的方法,其中所述多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物是氨基酸序列FAKLAARLYRKALARQLGVAA(SEQ ID NO:3)。
32.根据权利要求22所述的方法,其中所述多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物是氨基酸序列KAFAKLAARLYRKALARQLGVAA(SEQ ID NO:4)。
33.根据权利要求22所述的方法,其中所述多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物是氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLAVA(SEQ ID NO:5)。
34.根据权利要求22所述的方法,其中所述多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物是氨基酸序列YARAAARQARAKALARQLGVA(SEQ ID NO:6)。
35.根据权利要求22所述的方法,其中所述多肽YARAAARQARAKALARQLGVAA(SEQ ID NO:1)的功能等价物是氨基酸序列HRRIKAWLKKIKALARQLGVAA(SEQ ID NO:7)。
36.根据权利要求22所述的方法,其中所述载体选自控释载体、延释载体、缓释载体、和长期释放载体。
37.根据权利要求11所述的方法,其中所述药物组合物的所述MK2i组分是干粉的形式。
38.根据权利要求37所述的方法,其中所述干粉包括具有1至5微米的质量中值空气动力学直径(MMAD)的微粒。
39.根据权利要求22所述的方法,其中经由吸入装置施用所述治疗量的所述药物组合物的所述MK2i组分。
40.根据权利要求39所述的方法,其中所述吸入装置是喷雾器。
41.根据权利要求39所述的方法,其中所述吸入装置是定量吸入器(MDI)。
42.根据权利要求39所述的方法,其中所述吸入装置是干粉吸入器(DPI)。
43.根据权利要求39所述的方法,其中所述吸入装置是干粉喷雾器。
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