CN106434652A - 一种适用于谷氨酸棒杆菌的外源启动子及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种适用于谷氨酸棒杆菌的外源启动子，其能解决谷氨酸棒杆菌外源蛋白表达水平低的技术问题，本发明还提供了该外源启动子的应用。一种适用于谷氨酸棒杆菌的外源启动子，其核酸序列如SEQ ID NO:2所示或与其互补的核苷酸序列。

Description

一种适用于谷氨酸棒杆菌的外源启动子及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程和代谢工程技术领域，具体涉及一种适用于谷氨酸棒杆菌的外源启动子及其应用。
背景技术
谷氨酸棒杆菌是一种非致病性的革兰氏阳性菌，广泛用于工业生产氨基酸、有机酸、高级醇等工业产品；同时，谷氨酸棒杆菌无内毒素并且胞外无水解酶活性,其能够分泌正确折叠的有生物活性功能蛋白质，所以谷氨酸棒杆菌也是一种表达外源蛋白的极为有利的宿主。
启动子是一段控制基因起始转录的重要DNA序列，位于转录起始位点上游。而基因的mRNA转录水平是最终蛋白表达水平的主要影响因素之一，有研究通过大量的分析证明在控制蛋白表达水平的序列各种区域中，启动子区域的影响力超过45%，是最重要的序列区域。因此，一个强效的启动子通过使携带基因序列的mRNA高转录，从而实现高水平蛋白表达。
对于谷氨酸棒杆菌而言，人们目前依旧局限于应用cspB，trc，tac等有限的启动子，其中应用tac启动子谷氨酸棒杆菌的外源蛋白表达水平较高，但仍然无法满足人们对外源蛋白日益增长的需求。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种适用于谷氨酸棒杆菌的外源启动子，其能解决谷氨酸棒杆菌外源蛋白表达水平低的技术问题，本发明还提供了该外源启动子的应用。
一种适用于谷氨酸棒杆菌的外源启动子，其核酸序列如SEQ ID NO:2所示或与其互补的核苷酸序列。
一种表达载体，其包括所述外源启动子。
一种外源蛋白表达系统，其包括谷氨酸棒杆菌和所述表达载体。
上述外源启动子、表达载体或外源蛋白表达系统在外源蛋白表达中的应用。
本发明的上述外源启动子包括如SEQ ID NO:1所示的枯草芽孢杆菌的yewA启动子、yewA基因开放阅读框前38 bp的核酸序列以及谷氨酸棒杆菌保守SD序列（15bp），其中，yewA基因开放阅读框前38 bp的核酸序列与谷氨酸棒杆菌保守SD序列的前13 bp的核酸序列构成17个氨基酸的前导肽序列，谷氨酸棒杆菌保守SD序列末尾的碱基TA能够与外源蛋白基因的启示密码子首位的碱基A形成终止密码子，从而前导肽和外源蛋白分别能够单独翻译，形成含有两个基因的操纵自结构，以减少第二个基因，即外源蛋白基因在翻译过程中受到来自于mRNA发卡结构的抑制，从而提高表达水平。并且经实验证实，该启动子能够有效提高外源蛋白的表达。
附图说明
图1为载体p10-A0的质粒图谱
图2为传统启动子及新式启动子结构比较图。
图3为本发明启动子、yewA启动子以及tac启动子构建的不同表达载体蛋白表达的SDS-PAGE分析图。
具体实施方式
本发明中所用到的菌株：枯草芽孢杆菌168、谷氨酸棒杆菌ATCC 13032和大肠杆菌DH5α均购自中国高校微生物资源数据平台。
限制性内切酶Hind III、BamH I、EcoR V，T4 DNA连接酶等购自Thermo公司；Bsa I二型内切酶、Q5超保真聚合酶购自NEB公司；质粒提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒购自Axygen公司；基因组提取试剂盒购自天根公司；Infusion重组试剂盒购自Clontech公司；氯霉素、卡那霉素等抗生素购自上海生物工程有限公司；其余试剂均为国产或者进口分析纯。高速冷冻离心机和PCR热循环仪，美国ThermoFisher公司；Synergy H4酶标仪，美国BioTek公司；恒温金属浴，北京天根公司；Dark Reader，北京达科为生物公司；核酸和蛋白电泳仪，美国Bio-Rad公司。
本发明所用载体p19-A0的核酸序列如SEQ ID NO:4所示，其质粒图谱如图1所示，其构建方法参见：刘秀霞, 赵子豪, 孙杨, 等. 谷氨酸棒杆菌内源表达元件的筛选[J].微生物学通报, 2016-05-24 16:42，载体p19-A0含有egfp报告基因。
1、启动子的克隆。
包括以下步骤：
a、枯草芽孢杆菌基因组DNA的获取：通过基因组提取试剂盒提取枯草芽孢杆菌168的基因组DNA。
b、PCR扩增：
PCR扩增条件为：98 °C 、3 min；98 °C 、15 s，72 °C、 3.25 min，30 个循环；72 °C 、2min。反应体系为：10×Buffer 5 μl、dNTPs 4 μl (各2.5 mmol/L)、上下游引物各1 μl(0.2 μmol/L)、Q5 DNA聚合酶0.5 μl (2 U/μl)、模板1 μl，加水至50 μl；
本发明的启动子、yewA启动子（以下分别简称为NPyewA、PyewA）的引物：
yewA-F： TTTTGAAGCTTCTGGTTACCACCATGTCGTATAACCC
yewA-R： CGCCCTTGCTCACCATGACATTTCCCCCTAATTGATTG；
NyewA-F：TTTTGAAGCTTCTGGTTACCACCATGTCGTATAACCC
NyewA-R： CGCCCTTGCTCACCATTAGTTGTCCTCCTTTATGAATAATGAAGATACGAATGAAG；
上述引物5’端分别引入同源臂序列“TTTTGAAGCTTCTGGT”和“CGCCCTTGCTCACCA”，使得扩增后的两条序列与Bsa I酶切线性化后的载体p19-A0两端序列一致，在体外同源重组酶的帮助下，能够发生同源重组，从而使启动子与报告基因egfp无缝连接，构建出含有启动子得EGFP表达质粒；NPyewA通过其下游引物NyewA-R引入yewA基因开放阅读框前38 bp的核酸序列以及谷氨酸棒杆菌保守SD序列，即AAAGGAGGACAACTA序列。其中，NPyewA（对应新式）与PyewA（对应传统）的结构区别如图2所示。
2、表达载体的构建。
含有NPyewA或PyewA的质粒的构建，包括以下步骤：
a、通过II型内切酶Bsa I切割载体p19-A0获得线性质粒；
b、通过Infusion重组试剂盒将启动子与线性质粒在反应液中发生同源重组；
c、将同源重组后获得的反应液转化大肠杆菌DH5α，即可构建出含有不同启动子的EGFP表达质粒；其中含有NyewA的表达质粒简称为pNyewA，含有yewA的表达质粒简称为pyewA。
传统方法使用的酶切位点如EcoR I、BamH I等会干扰启动子的正确测定，而本发明所使用的载体p19-A0避免了这些额外序列的存在和对结果的干扰。
含有tac启动子（简称为Ptac）的阳性对照质粒的构建，包括以下步骤：
a、克隆如SEQ ID NO:3所示的谷氨酸棒杆菌保守SD序列和egfp基因片段，所需的引物为：
SD-EGFP-F: 5‘-CCCAAGCTTAAAGGAGGACAACTAATGGTGAGCAAGGGCG-3’
SD-EGFP-R: 5‘-CCCGGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’
PCR扩增条件与“1、启动子的克隆”中PCR扩增条件相同；
两条引物的“AAGCTT”“GGATCC”分代表构建这一阳性对照质粒所需引入的酶切位点，分别为Hind III和BamH I。
b、Hind III和BamH I双酶切，
c、T4连接。
酶切与连接均按照商品酶试剂的说明书指导进行。
谷氨酸棒杆菌保守SD序列和egfp基因片段与质粒pXMJ19上的Ptac组合，构建组成型表达的阳性对照质粒（简称为pTAC），这一经典的阳性对照代表了的谷氨酸棒杆菌高效表达重组蛋白的水平。
3、转化。
包括以下步骤：
a、通过质粒提取试剂盒分别提取pNyewA、pyewA以及pTAC；
b、转化谷氨酸棒杆菌ATCC 13032。
具体方法为：
（1）谷氨酸棒杆菌感受态细胞的制备
将在培养基平板上火化后的谷氨酸棒杆菌挑取接种至BHI培养基中，于30°C、230 rpm条件下过夜培养，将菌液转接至含有3%甘氨酸、0.1%Tween 80和0.5%葡萄糖的LB液体培养基的250 ml三角瓶中，控制其初始OD600为0.3，于30°C、230 rpm条件下培养4-6 h，至OD600达到0.6-0.9。再将菌液转移至无菌离心管中，冰上放置15 min。以下操作均在低温，无菌条件下进行。
4°C、4000 rpm离心5min，去上清，收集菌体，用预冷的10%甘油重悬菌体，悬浮式用移液枪小心的吹打。重复上述离心，去上清步骤3次，用1.5 ml 10%甘油重悬细胞，分装至1.5ml 离心管中，每管装100 μl，保存于-80 °C备用。
（2）谷氨酸棒杆菌感受态的电击转化
将感受态细胞从-80 °C冰箱中去除，至于冰上融化，添加10μl重组质粒后轻轻混匀，转移至预冷的0.1 cm电击杯中，于1.8 kv，200 Ω，25 μF条件下电击细胞。电击后立即加入含1.85%脑心浸出液的9.2%山梨醇的LB液体培养基1 ml，混匀，转入1.5 ml离心管中，于46°C水浴6 min，30°C，150 rpm振荡培养2 h。然后将菌液浓缩后涂布于含有1.85%脑心浸出液的9.2%山梨醇的LB固体培养基上，于30°C培养48h。
4、启动子的活性测定。
包括以下步骤：
a、培养，将“2、表达载体的构建”中构建的含有pNyewA、pyewA或pTAC的谷氨酸棒杆菌分别接种到2 ml 含有10 mg/L氯霉素的脑心浸出液（BHI）培养基中，30 °C、230 r/min培养过夜，然后按照1:100的比例稀释转接到新的2 ml BHI培养基中，使用高通量24孔深孔培养板，在相同的条件下培养24小时；
b、菌体收集，将培养好的菌液迅速置于冰上预冷，离心收集菌体，用PBS缓冲液清洗两次，重悬；
c、EGFP表达量测定：单位菌体的EGFP表达量定义为荧光强度F与样品OD600的比值，使用多功能酶标仪测量OD600和荧光强度，其结果如下表所示。
5、启动子NPyewA中SD序列单独应用的效果分析。
通过改变PCR下游引物yewA-R的方法将传统启动子PyewA末端的自身SD序列替换为新式启动子NPyewA所应用的保守SD序列，以形成启动子CPyewA，用于判断新式启动子表达效果的提升是否仅仅来自于这一保守SD序列。
所使用新下游引物为CyewA-R：TTTGGTCTCACCATTAGTTGTCCTCCTTTTGTTGAAATTTGGCCAGAGC
上游引物为yewA-F，按照相同的处理方法PCR之后，将PCR产物，即启动子CPyewA插入探测载体之中，并且测定该启动子的活性。结果发现，含有启动子CPyewA的谷氨酸棒杆菌按照相同条件培养后，所测得的荧光强度为20716 RFU/OD，明显低于新式启动子NPyewA。
上述实验结果证明：
PyewA及NPyewA与蛋白编码序列直接相连后即可启动蛋白表达，并且可以在不添加任何化学诱导剂或者物理诱导条件的情况下组成型表达重组蛋白；
在绿色荧光蛋白报告基因的评测下，本发明的NPyewA的表达效果与传统形式的PyewA相比明显提升，并且这种提升不是单纯的使用保守的谷氨酸棒杆菌SD序列所造成的，而需要结合本发明所述的新式启动子结构，构建出NPyewA才能发挥出更高的表达效果。同时这一启动子的活性明显超过人们常用的经典Ptac。
此外，通过SDS-PAGE分析，含有不同载体的谷氨酸棒杆菌的EGFP蛋白表达测试结果如图3所示。其中，含有pNyewA的谷氨酸棒杆菌所对应的EGFP蛋白条带颜色深于含有pyewA或pTAC的谷氨酸棒杆菌所对应的EGFP蛋白条带颜色，亦印证了NPyewA的蛋白表达水平高于PyewA、Ptac的蛋白表达水平。

Claims (4)

1.一种适用于谷氨酸棒杆菌的外源启动子，其核酸序列如SEQ ID NO:2所示，或与其互补的核苷酸序列。
2.一种表达载体，其包括如权利要求1所述的外源启动子。
3.一种外源蛋白表达系统，其包括谷氨酸棒杆菌和如权利要求2所述的表达载体。
4.如权利要求1所述的外源启动子、如权利要求2所述的表达载体或如权利要求3所述外源蛋白表达系统在外源蛋白表达中的应用。
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