CN106434642A - 用于鉴定刀鲚和短颌鲚的引物和分子生物学方法 - Google Patents

用于鉴定刀鲚和短颌鲚的引物和分子生物学方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于鉴定刀鲚和短颌鲚的引物和分子生物学方法，其中该引物包含扩增引物组和延伸引物组；所述扩增引物组的核酸序列如SEQ ID NO：1‑16所示，所述延伸引物组的核酸序列如SEQ ID NO：17‑24所示。该引物组合物能够有效用于刀鲚和短颌鲚物种的鉴定。该分子生物学方法步骤包括：构建待测刀鲚和短颌鲚SNP位点区域核酸测序文库，并对其进行测序获得测序结果；基于所述测序结果，确定所述刀鲚和短颌鲚SNP位点区域核酸序列；然后利用Structure2.3.2软件，绘制群体遗传差异的柱形图和个体遗传差异的柱形图，利用该分析判断物种种类。该方法步骤简便、准确、高效且费用低廉。

Description

用于鉴定刀鲚和短颌鲚的引物和分子生物学方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于鉴定刀鲚和短颌鲚的引物和分子生物学方法。
背景技术
长江刀鲚是长江中一种重要的渔业资源，也是长江特有的一种名贵水产品。而在长江中，同时还分布另一种与之形态极为类似的物种短颌鲚。短颌鲚的口感和价值，与刀鲚相差较大。市面上常常利用短颌鲚个体来冒充刀鲚出售，而由于两者主要区别的下颌部分，差距较小难以辨别，而且往往由于刺网的捕捞破损而更加难以甄别；另一方面，由于目前刀鲚尚未实现人工繁育，养殖需要依赖长江中捞取的苗种，而刀鲚和短颌鲚的苗种常常出现在同一区域混杂生存而难以区分，常常要等养到较大个体才可以区分剔除，增加了养殖的成本。
现有技术中，通常采用线粒体DNA技术对刀鲚、凤鲚和短颌鲚基因甄别，但是此方法主要存在以下缺陷：首选经遗传学调查显示，刀鲚和凤鲚差异较大，较易使用线粒体基因序列加以区别，而刀鲚和短颌鲚是姐妹种，分化时间短，线粒体差异不明显，甚至还有一定的遗传渐渗现象，因此，不适合使用线粒体基因组序列对这两者进行辨别。其次，线粒体是母系遗传，其序列只能反应其母系祖先的特征，而长江中由于这两者具有共分布区和遗传渐渗现象，有可能使得鉴定产生错误。同时，一些水系的短颌鲚的遗传背景与长江刀鲚更加接近，因此仅适用线粒体基因序列分析，很难区别其物种归属。另一方面，线粒体序列测定如序列数据较少，信息量少，如序列数据较多，信息量大，费用也较大。
为了解决以上存在的问题，人们一直在寻求一种理想的技术解决方案。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鉴别效率高、敏感度高、方便快捷且、费用低廉的用于鉴定刀鲚和短颌鲚的引物和分子生物学方法，以解决上述问题。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种引物组合物，它包含扩增引物组和延伸引物组；所述扩增引物组的核酸序列如SEQ ID NO：1-16所示，所述延伸引物组的核酸序列如SEQ ID NO：17-24所示。
本发明还提供一种所述的引物组合物的应用，所述引物组合物用于鉴定刀鲚和短颌鲚。
本发明还提供一种构建包括待测刀鲚和短颌鲚的SNP位点区域核酸测序文库的方法，包括以下步骤：
利用扩增引物组对包含SNP位点区域的待测刀鲚和短颌鲚核酸样本进行第一PCR扩增，获得第一扩增产物，分别利用磷酸化酶和外切酶对所述第一扩增产物进行纯化；
利用延伸引物组对纯化后的所述第一扩增产物进行延伸反应，获得延伸产物，采用磷酸化酶对所述延伸产物进行纯化，纯化后的所述延伸产物构成所述待测刀鲚和短颌鲚SNP位点区域核酸测序文库；
其中，所述扩增引物组的核酸序列如SEQ ID NO：1-16 所示，所述延伸引物组的核酸序列如SEQ ID NO：17-24所示。
基于上述，制得所述包含SNP位点区域的待测刀鲚和短颌鲚核酸样本步骤包括：首先取待鉴定样品的肌肉或者活体尾鳍尖部组织；然后采用酚氯仿法、高盐法或层析柱法提取待测刀鲚和短颌鲚样品的DNA。
基于上述，构建包括待测刀鲚和短颌鲚的SNP位点区域核酸测序文库的方法中，按照20微升反应体系计算，所述第一PCR扩增的反应体系为：
试剂 体积（微升）
Primer Mix 4
MgCl 1.6
dNTP Mix 0.4
ExTaq酶 10
待测刀鲚和短颌鲚DNA 2
ddH2O 补至20
所述第一PCR 扩增的反应程序为：
基于上述，所述构建包括待测刀鲚和短颌鲚的SNP位点区域核酸测序文库的方法中，按照10 微升反应体系计算，所述延伸反应的反应体系为：
试剂 体积（微升）
SNaPshot MultiplexKit 5
多重第一扩增产物 2
延伸引物组 1
ddH 2O 补至10
所述延伸反应的反应程序为：
本发明还提供一种利用上述引物组合鉴定刀鲚和短颌鲚的分子生物学方法，包括以下步骤：
首先取待测刀鲚和短颌鲚样品的肌肉或者活体尾鳍尖部组织，然后采用酚氯仿法、高盐法或层析柱法提取待测刀鲚和短颌鲚样品的DNA；
然后利用扩增引物组对包含SNP位点区域的待测刀鲚和短颌鲚核酸样本进行第一PCR扩增，获得第一扩增产物；利用磷酸化酶和外切酶对所述第一扩增产物进行纯化；
利用延伸引物组对纯化后的所述第一扩增产物进行延伸反应，获得延伸产物；采用磷酸化酶对所述延伸产物进行纯化；
最后对纯化后的延伸产物进行测序，获得测序结果；基于所述测序结果，确定所述待测刀鲚和短颌鲚SNP位点区域核酸序列；基于所述刀鲚和短颌鲚SNP位点区域核酸序列，利用Structure软件，绘制群体遗传差异的柱形图和个体遗传差异的柱形图，利用该分析判断所述待测刀鲚和短颌鲚物种种类；
其中，所述扩增引物组的核酸序列如SEQ ID NO：1-16 所示，所述延伸引物组的核酸序列如SEQ ID NO：17-24所示。
基于上述，所述的利用上述引物组合鉴定刀鲚和短颌鲚的分子生物学方法中，分别采用ABI3730xl及GeneMapper4.0对来所述待测刀鲚和短颌鲚SNP位点区域核酸测序文库进行测序和分析统计。
本发明相对现有技术具有突出的实质性特点和显著的进步，具体的说，仅选取8个SNP位点进行样品鉴定即可有效的区分刀鲚和短颌鲚物种，达到物种鉴定的良好效果。同时由于SNP分型是按照反应孔计费，而每个孔同时容纳的检测位点的多少是根据位点的相互位置关系来确定的，本发明选取的8个位点能够满足在一个反应孔完成SNP分型的技术要求，每个孔即可鉴定1个样品，可以实现单次96-384个样品的反应，鉴定效率高；并且本发明的鉴定结果的软件可视化分析，方便快捷，结果直观、易读。同时，利用本发明提供的分子生物学方法可降低鉴定刀鲚和短颌鲚的鉴定费用。
附图说明
图1为实施例1从选自洞庭湖的39个样品中任选的1个样本测试的8个SNP位点在分型峰图中的位置分布。
图2为实施例1中利用结构分析软件得到的选自洞庭湖中39个样本个体遗传组成柱状图。
图3为实施例2从选自潘阳湖的39个样品中任选的1个样本测试的8个SNP位点在分型峰图中的位置分布。
图4为实施例2中利用结构分析软件得到的选自潘阳湖中39个样本个体遗传组成柱状图。
图5为实施例3中选自芜湖9个样本选中任选1个样本测试的8个SNP位点在分型峰图中的位置分布。
图6为实施例3中利用结构分析软件得到的9个选自芜湖样本个体遗传组成柱状图。
图7为实施例4中选自太湖40个样本选中任选1个样本测试的8个SNP位点在分型峰图中的位置分布。
图8为实施例4中利用结构分析软件得到的40个选自太湖样本个体遗传组成柱状图。
图9-图10为实施例5中选自某养殖场20个样本选中任选2个样本测试的8个SNP位点在分型峰图中的位置分布。
图11为实施例5中利用结构分析软件得到的选自某养殖场20个样本个体遗传组成柱状图。
图12-图13为实施例6中选自靖江19个样本选中任选2个样本测试的8个SNP位点在分型峰图中的位置分布。
图14为实施例3中利用结构分析软件得到的19个选自靖江样本个体遗传组成柱状图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
本发明提供的鉴定刀鲚和短颌鲚的分子生物学方法，具体包括以下步骤：
1、样本DNA的提取
（1）分别取新鲜或冰冻的不同种群的待测刀鲚和短颌鲚肌肉或者活体的尾鳍尖部组织0.1g，剪碎并置于玻璃匀浆器中，向其中加入1mL的细胞裂解缓冲液匀浆至组织块消失，然后将玻璃匀浆器中的液体置于1.5mL的离心管中，并向离心管加入蛋白酶，混均。在65ºC恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37ºC水浴12-24小时，间歇振荡离心管数次。然后将离心管置于台式离心机以12000rpm/min离心5分钟，取上清液置于第二离心管中。
（2）向第二离心管中加入2倍上清液体积的异丙醇，倒转混均后，将生成的丝状物挑出并晾干，然后用200微升的TE试剂重新溶解所述丝状物。
（3）向溶解有丝状物的TE试剂中加入等体积的酚-氯仿-异戊醇并振荡混均，然后以12000rpm/min转速离心5分钟，取上清液置于第三离心管中。
（4）向第三离心管中加入等体积的氯仿-异戊醇，并振荡混均，然后以12000rpm/min转速离心5分钟，取上清液置于第四离心管中。
（5）向第四离心管中加入一半体积的7.5mol/L的乙酸氨和2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min，然后以12000rpm/min转速离心10分钟，弃上清后，向第四离心管中加入200微升的TE试剂重新溶解沉淀物，即得到刀鲚或短颌鲚的DNA提取液，然后将其置于4ºC保存备用。
2、多重PCR扩增及延伸反应
（1）引物设计
基于筛选的刀鲚和短颌鲚8个SNP位点基因设计能与之配对的扩增引物SEQ ID NO：1-16和延伸引物SEQ ID NO：17-24；
（2）多重PCR扩增反应
首先利用上述扩增引物对DNA提取液进行扩增，获得PCR产物；然后取15微升的PCR产物，并向其中加入5U SAP酶和2U Exonuclease I酶，并将其置于37ºC水浴条件下1小时，然后在75ºC灭活15分钟，对PCR产物进行纯化处理。
具体地，按照20微升反应体系计算，所述第一PCR扩增的反应体系为：
试剂 体积（微升）
Primer Mix 4
MgCl 1.6
dNTP Mix, 0.4
ExTaq 10
待测刀鲚和短颌鲚DNA 2
ddH 2O 补至20
所述第一PCR 扩增的反应程序为：
（3）SNaPshot多重单碱基延伸反应
首先采用本发明设计的延伸引物组对纯化后的PCR产物进行多重单碱基延伸反应，获得延伸产物；然后取10微升的延伸产物，并向其中加入1U SAP酶，并将其置于37ºC水浴条件下1小时，然后在85ºC灭活15分钟，对延伸产物进行纯化处理。
具体地，按照10 微升反应体系计算，所述延伸反应的反应体系为：
试剂 体积（微升）
SNaPshot Multiplex Kit(ABI) 5
多重第一扩增产物 2
延伸引物组 1
ddH 2O 补至10
所述延伸反应的反应程序为：
3、延伸产物核酸测序及群体鉴别
取1微升纯化后的延伸产物置于测序容器中，然后向其中加入0.5微升的Liz1 20 SIZESTANDARD试剂和8.5微升的Hi-Di试剂并进行混匀，并置于95ºC温度下变性5分钟，变性后采用ABI3730XL测序仪进行测序。
经ABI3730XL测序仪上收集的原始数据用GeneMapper4.0软件进行分析统计。最后，设置分群参数K=2，利用Structure 2.3.2软件绘制群体遗传差异的柱形图和个体遗传差异的柱形图，利用群体遗传差异的柱形图和个体遗传差异的柱形图分析判断样本的物种归属。
实施例1
本实施例本根据发明提供的鉴定刀鲚和短颌鲚的分子生物学方法的具体步骤，对选自洞庭湖中39个样本进行分子生物学鉴定，具体鉴定结果如下：
利用ABI3730XL测序平台，从选自洞庭湖中39个样本中任选的1个样本测试的8个SNP位点在分型峰图中的位置分布如图1所示。
选自洞庭湖中39个样本的遗传组成柱状图如图2所示，柱状图中，黑色组分占大多数的个体即为刀鲚，灰色组分占大多数的个体为短颌鲚。鉴定结果显示，选自洞庭湖中39个样本个体中全部为短颌鲚。
实施例2
本实施例根据本发明提供的鉴定刀鲚和短颌鲚的分子生物学方法，利用ABI3730XL测序平台，对选自潘阳湖中39个样本进行分子生物学鉴定具体操作步骤同实施例1中的测序和鉴定步骤。
从选自潘阳湖的39个样品中任选的1个样本测试的8个SNP位点在分型峰图中的位置分布如图3所示。
选自潘阳湖中39个样本的遗传组成柱状图如图4所示，柱状图中，黑色组分占大多数的个体即为刀鲚，灰色组分占大多数的个体为短颌鲚。鉴定结果显示，选自潘阳湖中39个样本个体中全部为短颌鲚。
实施例3
本实施例根据本发明提供的鉴定刀鲚和短颌鲚的分子生物学方法，利用ABI3730XL测序平台，对选自芜湖样的9个样本进行分子生物学鉴定具体操作步骤同实施例1中的测序和鉴定步骤。
选自芜湖样的9个样本中任选1个样本测试的8个SNP位点在分型峰图中的位置分布如图5所示。
选自芜湖样的9个样本的遗传组成柱状图如图6所示，柱状图中，浅白色组分占大多数的个体即为刀鲚，灰色组分占大多数的个体为短颌鲚。鉴定结果显示，选自芜湖样的9个样本个体中全部为刀鲚。
实施例4
本实施例根据本发明提供的鉴定刀鲚和短颌鲚的分子生物学方法，利用ABI3730XL测序平台，对选自太湖40个样本进行分子生物学鉴定具体操作步骤同实施例1中的测序和鉴定步骤。
选自太湖40个样本中任选1个样本测试的8个SNP位点在分型峰图中的位置分布如图7所示。
选自太湖40个样本的遗传组成柱状图如图8所示，柱状图中，浅白色组分占大多数的个体即为刀鲚，灰色组分占大多数的个体为短颌鲚。鉴定结果显示，选自太湖40个样本个体中全部为刀鲚。
实施例5
本实施例根据本发明提供的鉴定刀鲚和短颌鲚的分子生物学方法，利用ABI3730XL测序平台，对选自某养殖场20个样本进行分子生物学鉴定具体操作步骤同实施例1中的测序和鉴定步骤。
选自某养殖场20个样本任选2个样本测试的8个SNP位点在分型峰图中的位置分布如图9和图10所示。
选自某养殖场20个样本的遗传组成柱状图如图11所示，柱状图中，浅白色组分占大多数的个体即为刀鲚，灰色组分占大多数的个体为短颌鲚。鉴定结果显示，选自某养殖场20个样本存在两个物种的共分布区，分析认为养殖群体的种源由于是从长江下游一带捞苗，且捞苗活动并非一次，因此两个物种在群体里混杂程度较高。
实施例6
本实施例根据本发明提供的鉴定刀鲚和短颌鲚的分子生物学方法，利用ABI3730XL测序平台，对选自某养殖场20个样本进行分子生物学鉴定具体操作步骤同实施例1中的测序和鉴定步骤。
选自靖江19个样本任选2个样本测试的8个SNP位点在分型峰图中的位置分布如图12和图13所示。
选自靖江19个样本的遗传组成柱状图如图14所示，柱状图中，浅白色组分占大多数的个体即为刀鲚，灰色组分占大多数的个体为短颌鲚。鉴定结果显示，选自靖江19个样本存在两个物种的共分布区，因此短颌鲚群体里混杂少量刀鲚。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

Claims (8)

1.一种引物组合物，其特征在于，它包含扩增引物组和延伸引物组；所述扩增引物组的核酸序列如SEQ ID NO：1-16所示，所述延伸引物组的核酸序列如SEQ ID NO：17-24所示。
2.一种权利要求1所述的引物组合物的应用，其特征在于，所述引物组合物用于鉴定刀鲚和短颌鲚。
3.一种构建包括待测刀鲚和短颌鲚的SNP位点区域核酸测序文库的方法，包括以下步骤：
首先利用权利要求1所述的扩增引物组对包含SNP位点区域的待测刀鲚和短颌鲚核酸样本进行第一PCR扩增，获得第一扩增产物，分别利用磷酸化酶和外切酶对所述第一扩增产物进行纯化；
然后利用权利要求1所述的延伸引物组对纯化后的所述第一扩增产物进行延伸反应，获得延伸产物，采用磷酸化酶对所述延伸产物进行纯化，纯化后的所述延伸产物构成所述待测刀鲚和短颌鲚SNP位点区域核酸测序文库；
其中，所述扩增引物组的核酸序列如SEQ ID NO：1-16 所示，所述延伸引物组的核酸序列如SEQ ID NO：17-24所示。
4.根据权利要求3所述的构建包括待测刀鲚和短颌鲚的SNP位点区域核酸测序文库的方法，其特征在于，制得所述包含SNP位点区域的待测刀鲚和短颌鲚核酸样本步骤包括：首先取包括待测刀鲚和短颌鲚样品的肌肉或活体尾鳍尖部组织；然后采用酚氯仿法、高盐法或层析柱法提取待测刀鲚和短颌鲚样品的DNA。
5.根据权利要求4所述的构建包括待测刀鲚和短颌鲚的SNP位点区域核酸测序文库的方法，其特征在于，按照20微升反应体系计算，所述第一PCR扩增的反应体系为：
试剂 体积（微升） Primer Mix 4 MgCl 1.6 dNTP Mix 0.4 ExTaq酶 10 待测刀鲚和短颌鲚DNA 2 ddH2O 补至20
所述第一PCR扩增的反应程序为：
。
6.根据权利要求4或5所述的构建包括待测刀鲚和短颌鲚的SNP位点区域核酸测序文库的方法，其特征在于，按照10 微升反应体系计算，所述延伸反应的反应体系为：
试剂 体积（微升） SNaPshot Multiplex Kit 5 多重第一扩增产物 2 延伸引物组 1 ddH 2O 补至10
所述延伸反应的反应程序为：
。
7.一种利用上述引物组合鉴定刀鲚和短颌鲚的分子生物学方法，包括以下步骤：
首先取待测刀鲚和短颌鲚样品的肌肉或者活体尾鳍尖部组织，然后采用酚氯仿法、高盐法或层析柱法提取待测刀鲚和短颌鲚样品的DNA；
然后利用权利要求1所述的扩增引物组对包含SNP位点区域的待测刀鲚和短颌鲚核酸样本进行第一PCR扩增，获得第一扩增产物；利用磷酸化酶和外切酶对所述第一扩增产物进行纯化；
利用权利要求1所述的延伸引物组对纯化后的所述第一扩增产物进行延伸反应，获得延伸产物；采用磷酸化酶对所述延伸产物进行纯化；
最后对纯化后的延伸产物进行测序，获得测序结果；基于所述测序结果，确定所述待测刀鲚和短颌鲚SNP位点区域核酸序列；基于所述刀鲚和短颌鲚SNP位点区域核酸序列，利用Structure软件，绘制群体遗传差异的柱形图和个体遗传差异的柱形图，利用该分析判断所述待测刀鲚和短颌鲚物种种类；
其中，所述扩增引物组的核酸序列如SEQ ID NO：1-16 所示，所述延伸引物组的核酸序列如SEQ ID NO：17-24所示。
8.根据权利要求7所述的利用上述引物组合鉴定刀鲚和短颌鲚的分子生物学方法，其特征在于，分别采用ABI3730xl及GeneMapper4.0对来所述待测刀鲚和短颌鲚SNP位点区域核酸测序文库进行测序和分析统计。
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CN114317770A (zh) * 2021-12-27 2022-04-12 上海市水产研究所（上海市水产技术推广站） 与长江刀鲚生长相关的snp分子标记及其检测引物和应用

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