CN106434608A - 一种浒苔蛋白酶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种浒苔蛋白酶的制备方法，该方法包括：选择原料、高压清洗、漏水剪切、添加蛋白酶抑制剂榨汁、加入抽提液和缓冲液放入捣碎机制备粗抽提液、固体硫酸铵离心、乙酸溶液透析脱盐、加入罗氏蛋白酶抑制剂冰浴冷却、加入氯丁橡胶cr322搅拌离心、用碳酸氢钠纯化、n‑乙酰‑l‑半胱氨酸溶液结晶、冷冻离心收集结晶、成品保存。有效保证浒苔蛋白酶活力和纯度。本发明的可广泛应用在洗涤工业、食品工业、纺织工业、皮革工业、纸浆工业、饲料、石油天然气钻井、临床医药、农业、林业、畜牧业等行业。并在的应用中具有减少耗能，减少化学品、快速环保的优良效果。

Description

一种浒苔蛋白酶的制备方法

技术领域

本发明涉及一种植物蛋白酶，尤其涉及一种浒苔蛋白酶的制备方法。

背景技术

近年来，植物蛋白酶在洗涤工业、食品工业、纺织工业、皮革工业、纸浆工业、饲料、石油天然气钻井、临床医药、农业、林业、畜牧业等行业的中广泛应用，植物蛋白酶具有减少耗能，减少化学品、快速环保等优良效果，其应用也越来越受到人们的关注。

植物蛋白酶的制备以植物质为原料，进行蛋白酶制备。常用的植物蛋白酶植物质多采用绿色谷物、草类、未成熟的谷物和树叶等。浒苔蛋白酶的优势在于能够与海洋经济很好的结合，原料价格低，有助于更好的对浒苔原料进行综合利用，实现产生价值最大化。浒苔细胞培养可以不受地域、土地、气候、季节等自然条件的限制，在工业化条件下，可实现全年生产。浒苔生长的倍增时间一般为15h-60h，生产周期为8-15d，与木瓜、大蒜、紫草等相比，浒苔大大缩短了生产周期。

现有技术中还没有一种浒苔蛋白酶的制备方法。

发明内容

在下文中给出关于本发明的简要概述，以便提供关于本发明的某些方面的基本理解。应当理解，这个概述并不是关于本发明的穷举性概述。它并不是意图确定本发明的关键或重要部分，也不是意图限定本发明的范围。其目的仅仅是以简化的形式给出某些概念，以此作为稍后论述的更详细描述的前序。

本发明实施例的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供一种浒苔蛋白酶的制备方法。该方法能够与海洋经济很好的结合，具有原料价格低，有助于更好的对浒苔原料进行综合利用，实现产生价值最大化的优点。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

本发明提供一种浒苔蛋白酶的制备方法，包括以下步骤：

（1）选择浒苔，并清洗打捞的浒苔；

（2）将打捞的浒苔剪切，然后加入蛋白酶抑制剂进行榨汁，得到浒苔汁液；所述蛋白酶抑制剂的加入量为浒苔汁液重量的1%-3%；

（3）将浒苔汁液放入捣碎机，给捣碎机加入抽提液和缓冲液，捣碎抽提后，将悬浮液过滤，得到的滤液为浒苔蛋白酶的粗抽提液；

所述抽提液制备方法：按照1L蒸馏水加入0.5-2g的NaCI，配置NaCI溶液，在配置好的氯化钠NaCI溶液中加入0.1-0.3g氯化钾；按照1L蒸馏水配置的所述抽提液用于加入100克的浒苔汁液中；

所述缓冲液制备方法：按照1L蒸馏水加入0.3-1.5g三羟甲基甲烷，配置三羟甲基甲烷溶液，按照1L蒸馏水配置的所述缓冲液用于加入100克的浒苔汁液中；

（4）在0-2℃将固体硫酸铵加入所述的粗抽提液中，搅拌，至溶液饱和度35-45%，离心后弃上清夜，得到浒苔蛋白酶溶液；

（5）将浒苔蛋白酶溶液装入透析袋中，将透析袋浸泡在0.5-2mol/L乙酸溶液中进行脱盐处理；

（6）给脱盐处理后的浒苔蛋白酶溶液中加入罗氏蛋白酶抑制剂，冰浴冷却，再加入氯丁橡胶，搅拌，离心，得沉淀，沉淀再用NaHC0₃洗脱，搅拌，离心后再次得到沉淀；

所述蛋白酶抑制剂用量为：每100克的浒苔汁液中对应加入0.05-0.1ml蛋白酶抑制剂；

所述氯丁橡胶的用量为：每100克的浒苔汁液中对应加入20-30mg氯丁橡胶；

所述NaHC0₃的用量为：每100克的浒苔汁液中对应加入5-10g NaHC0₃；

（7）将步骤（6）最终得到的沉淀溶解于N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，在23-25℃室温下放置60-120min生成结晶，所得到的结晶为浒苔蛋白酶；

所述N-乙酰-L-半胱氨酸溶液按照100mL蒸馏水加入0.1-0.3gN-乙酰-L-半胱氨酸配置N-乙酰-L-半胱氨酸溶液，按照100mL蒸馏水配置的所述N-乙酰-L-半胱氨酸溶液用于加入100克的浒苔汁液中。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明可广泛应用在洗涤工业、食品工业、纺织工业、皮革工业、纸浆工业、饲料、石油天然气钻井、临床医药、农业、林业、畜牧业等行业。并在的应用中具有减少耗能，减少化学品、快速环保的优良效果。

2、浒苔蛋白酶能够与海洋经济很好的结合，原料价格低，制备工艺简单，有助于更好的对浒苔原料进行综合利用，实现产生价值最大化。

3、浒苔细胞培养可以不受地域、土地、气候、季节等自然条件的限制，在工业化条件下，可实现全年生产。

4、浒苔蛋白酶具有生物降解性，一定程度上缓解给环境带来的污染。

5、浒苔蛋白酶的制备技术带动浒苔的综合利用，使其高效地转化为洗涤、食品、饲料、纺织和各类物质的化学品。

6、制备工艺具有酶的活力和纯度较高，浒苔蛋白酶活力＞230万单位/克。

7、有利促进海洋经济发展。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明做进一步的说明：

实施例1

一种浒苔蛋白酶的制备方法，包括以下步骤：

（1）选择浒苔，并清洗打捞的浒苔；

（2）将打捞的浒苔剪切，然后加入a2-巨球蛋白进行榨汁，得到浒苔汁液；取100克浒苔汁液中含有1克a2-巨球蛋白；

（3）将100克浒苔汁液放入捣碎机，给捣碎机加入抽提液和缓冲液，捣碎抽提后将悬浮液过滤，得到的滤液为浒苔蛋白酶的粗抽提液；

所述抽提液制备方法：将1L蒸馏水加入0.5g的NaCI，配置NaCI溶液，在配置好的氯化钠NaCI溶液中加入0.3g氯化钾；

所述缓冲液制备方法：将1L蒸馏水加入1.5g三羟甲基甲烷，配置三羟甲基甲烷溶液；

（4）在0℃，将固体硫酸铵加入所述的粗抽提液中，搅拌，至溶液饱和度35%，离心后弃上清夜，得到浒苔蛋白酶溶液；

（5）将浒苔蛋白酶溶液装入透析袋中，将透析袋浸泡在0.5ml/L乙酸溶液中进行脱盐处理；

（6）给脱盐处理后的浒苔蛋白酶溶液中加入0.05g罗氏蛋白酶抑制剂，冰浴冷却，再加入20mg氯丁橡胶，搅拌，离心，得沉淀，沉淀再用5g浓度为60%的NaHC0₃溶液洗脱，搅拌，离心后再次得到沉淀；

（7）将步骤（6）最终得到的沉淀溶解于N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，在25℃室温下放置100min生成结晶，所得到的结晶为浒苔蛋白酶；其中，N-乙酰-L-半胱氨酸溶液为100mL蒸馏水加入0.1gN-乙酰-L-半胱氨酸配置N-乙酰-L-半胱氨酸溶液。

实施例2

一种浒苔蛋白酶的制备方法，包括以下步骤：

（1）选择浒苔，并清洗打捞的浒苔；选择的浒苔为：打捞后到使用≤2天，自然温度打捞后，浒苔的加工温度30℃；通过100kpa高压水清洗浒苔，去除沙石，时间20-30分钟。

（2）对清洗的浒苔进行自然漏水处理：

将冲洗后的浒苔平整堆放在漏水架上，每层漏水架设置接水底盘，每层浒苔厚度15-25cm，所述剪切的浒苔的长度和宽度为1-1.5cm；将打捞的浒苔剪切，然后加入B.M.综合酶片进行榨汁，得到浒苔汁液；B.M.综合酶片的加入量为浒苔汁液重量的2%，即100克浒苔汁液加入2克蛋白酶抑制剂；

（3）将100克浒苔汁液加入2克B.M.综合酶片放入waringblender高速组织捣碎机，给捣碎机加入抽提液和缓冲液，温度0℃-5℃，间隙式操作5s，重复10次捣碎抽提，悬浮液用布氏漏斗过滤，用美蓝染色法测定浒苔细胞破碎程度，过滤后得到的滤液为浒苔蛋白酶的粗抽提液；

所述抽提液制备方法：将1L蒸馏水加入1g的NaCI，配置NaCI溶液，在配置好的NaCI溶液中加入0.2g氯化钾；

所述缓冲液制备方法：将1L蒸馏水加入0.8g三羟甲基甲烷，配置三羟甲基甲烷溶液；

（4）将固体硫酸铵磨碎成均匀细粒，在1℃下搅拌下分批加入所述的粗抽提液至饱和度40%，离心，弃上清夜，沉淀为澄清的浒苔蛋白酶溶液。

（5）将浒苔蛋白酶溶液装入透析袋中，将玻璃纸透析袋浸泡在0.7ml/L乙酸溶液中进行脱盐处理，浸泡的时间为1.5h；

（6）给脱盐处理后的浒苔蛋白酶溶液中加入0.08ml罗氏蛋白酶抑制剂，冰浴冷却10min，再加入25mg氯丁橡胶CR322，搅拌6min，离心，得沉淀，沉淀再用8g50%的NaHC0₃溶液洗脱，搅拌10min，离心后再次得到沉淀；

（7）将步骤（6）最终得到的沉淀溶解于N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，在25℃室温下放置100min生成结晶，结晶在4℃的条件下放置10h，结晶长大，冷冻离心收集结晶，所得到的结晶为浒苔蛋白酶；

所述N-乙酰-L-半胱氨酸溶液的制备：100mL蒸馏水加入0.2gN-乙酰-L-半胱氨酸配置N-乙酰-L-半胱氨酸溶液；

（8）保存结晶：0℃下冰箱保存，液态浒苔蛋白酶pH5-10于-5℃下稳定，pH≤8时稳定性有所增加，可保存6-12个月。

实施例3

一种浒苔蛋白酶的制备方法，包括以下步骤：

（1）选择浒苔，并清洗打捞的浒苔；选择的浒苔为：打捞后到使用≤2天，自然温度打捞后，浒苔的加工温度20℃；通过100kpa高压水清洗浒苔，去除沙石，时间20-30分钟。

（2）对清洗的浒苔进行自然漏水处理：

将冲洗后的浒苔平整堆放在漏水架上，每层漏水架设置接水底盘，每层浒苔厚度15-25cm，所述剪切的浒苔的长度和宽度为1-1.5cm；将打捞的浒苔剪切，然后加入罗氏蛋白酶进行榨汁，得到浒苔汁液；罗氏蛋白酶的加入量为浒苔汁液重量的2%，即100克浒苔汁液加入2克蛋白酶抑制剂；

（3）将100克浒苔汁液加入3克罗氏蛋白酶放入waringblender高速组织捣碎机，给捣碎机加入抽提液和缓冲液，温度0℃-5℃，间隙式操作5s，重复10次捣碎抽提，悬浮液用布氏漏斗过滤，用美蓝染色法测定浒苔细胞破碎程度，过滤后得到滤液为浒苔蛋白酶的粗抽提液；

所述抽提液制备方法：将1L蒸馏水加入2g的NaCI，配置NaCI溶液，在配置好的氯化钠NaCI溶液中加入0.3g氯化钾；

所述缓冲液制备方法：将1L蒸馏水加入1.5g三羟甲基甲烷，配置三羟甲基甲烷溶液；

（4）将固体硫酸铵磨碎成均匀细粒，在2℃下搅拌下分批加入所述的粗抽提液至饱和度35%，离心，弃上清夜，沉淀为澄清的浒苔蛋白酶溶液。

（5）将浒苔蛋白酶溶液装入透析袋中，将玻璃纸透析袋浸泡在1.5ml/L乙酸溶液中进行脱盐处理，浸泡的时间为2h；

（6）给脱盐处理后的浒苔蛋白酶溶液中加入0.05ml罗氏蛋白酶抑制剂，冰浴冷却12min，再加入20mg氯丁橡胶CR322，搅拌8min，离心，得沉淀，沉淀再用10g45%的NaHC0₃溶液洗脱，搅拌2min，离心后再次得到沉淀；

（7）将步骤（6）最终得到的沉淀溶解于N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，在23℃室温下放置60min生成结晶，结晶在4℃的条件下放置16h，结晶长大，冷冻离心收集结晶，所得到的结晶为浒苔蛋白酶；

所述N-乙酰-L-半胱氨酸溶液的制备：100mL蒸馏水加入0.3gN-乙酰-L-半胱氨酸配置N-乙酰-L-半胱氨酸溶液；

（8）保存结晶：0℃下冰箱保存，液态浒苔蛋白酶pH5-10于-5℃下稳定，pH≤8时稳定性有所增加，可保存6-12个月。

最后应说明的是：虽然以上已经详细说明了本发明及其优点，但是应当理解在不超出由所附的权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下可以进行各种改变、替代和变换。而且，本发明的范围不仅限于说明书所描述的过程、设备、手段、方法和步骤的具体实施例。本领域内的普通技术人员从本发明的公开内容将容易理解，根据本发明可以使用执行与在此所述的相应实施例基本相同的功能或者获得与其基本相同的结果的、现有和将来要被开发的过程、设备、手段、方法或者步骤。因此，所附的权利要求旨在在它们的范围内包括这样的过程、设备、手段、方法或者步骤。

Claims (1)

1.一种浒苔蛋白酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)选择浒苔，并清洗打捞的浒苔；

(2)将打捞的浒苔剪切，然后加入蛋白酶抑制剂进行榨汁，得到浒苔汁液；所述蛋白酶抑制剂的加入量为浒苔汁液重量的1％-3％；

(3)将浒苔汁液放入捣碎机，给捣碎机加入抽提液和缓冲液，捣碎抽提后将悬浮液过滤，得到的滤液为浒苔蛋白酶的粗抽提液；

所述抽提液制备方法：按照1L蒸馏水加入0.5-2g的氯化钠，配置氯化钠溶液，在配置好的氯化钠溶液中加入0.1-0.3g氯化钾；按照1L蒸馏水配置的所述抽提液用于加入100克的浒苔汁液中；

所述缓冲液制备方法：按照1L蒸馏水加入0.3-1.5g三羟甲基甲烷，配置三羟甲基甲烷溶液，按照1L蒸馏水配置的所述缓冲液用于加入100克的浒苔汁液中；

(4)在0-2℃，将固体硫酸铵加入所述的粗抽提液中，搅拌，至溶液饱和度35-45％，离心后弃上清液，得到浒苔蛋白酶溶液；

(5)将浒苔蛋白酶溶液装入透析袋中，将透析袋浸泡在0.5-2mol/L乙酸溶液中进行脱盐处理；

(6)给脱盐处理后的浒苔蛋白酶溶液中加入罗氏蛋白酶抑制剂，冰浴冷却，再加入氯丁橡胶，搅拌，离心，得沉淀，沉淀再用重量百分比浓度为45-90％的NaHCO₃溶液洗脱，搅拌，离心后再次得到沉淀；

所述蛋白酶抑制剂用量为：每100克的浒苔汁液中对应加入0.05-0.1ml蛋白酶抑制剂；

所述氯丁橡胶的用量为：每100克的浒苔汁液中对应加入20-30mg氯丁橡胶；

所述45-90％的NaHCO₃溶液用量为：每100克的浒苔汁液中对应加入5-10g NaHCO₃溶液；

(7)将步骤(6)最终得到的沉淀溶解于N-乙酰-L-半胱氨酸溶液中，在23-25℃室温下放置60-120min生成结晶，所得到的结晶为浒苔蛋白酶；

所述N-乙酰-L-半胱氨酸溶液按照100mL蒸馏水加入0.1-0.3gN-乙酰-L-半胱氨酸配置N-乙酰-L-半胱氨酸溶液，按照100mL蒸馏水配置的所述N-乙酰-L-半胱氨酸溶液用于加入100克的浒苔汁液中。