CN106434523A

CN106434523A - 一种无co2环境下的细胞培养的专用培养基及培养方法

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Publication number: CN106434523A
Application number: CN201610890666.8A
Authority: CN
Inventors: 陈钰; 马宏; 孙飞; 孙飞一; 李�瑞; 邓玉林; 陈波
Original assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Current assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Priority date: 2016-10-12
Filing date: 2016-10-12
Publication date: 2017-02-22

Abstract

一种无CO₂环境下的细胞培养的专用培养基及培养方法，所述专用培养基成分包括HEPES，使用专用培养基在常规培养器皿中培养贴壁细胞，作为种子细胞，同时将贴壁细胞微流控芯片腔室内壁预先用人血浆来源的纤连蛋白包被，然后将消化成单个细胞的贴壁细胞，接种至所述芯片腔室内部，待细胞贴壁后使用专用培养基灌流培养。本发明的专用培养基成分确定，使用安全性高，可有效地在无CO₂环境下稳定细胞培养过程中培养基的pH，并可以实现无CO₂环境下的细胞培养。

Description

一种无CO2环境下的细胞培养的专用培养基及培养方法

技术领域

本发明属于细胞生物学以及以空间生物学研究领域为代表的特殊环境生物学研究领域，具体涉及一种无CO₂环境下的贴壁细胞和悬浮细胞专用培养基及细胞培养方法。

背景技术

首先，随着载人航天和空间探索的深入，以及载人航天等一系列任务的成功，我国已经进入了太空研究探索阶段。未来的20年，将会是中国空间生物学研究的黄金时期，并且空间生物学研究对空间航天医学的发展和空间生物技术的转化至关重要。

其次，细胞模型法是将所研究的复杂生物问题转化为对某种细胞的研究或某几种细胞相互作用的研究，以达到以点带线的效果，从细胞层面的变化推测生物体的变化。细胞模型法能将复杂的生物问题简化，故该法被广泛地用于各种传统生物学研究中，如各种疾病的病理研究以及免疫学研究等。而细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术，也是细胞模型法的基础。同时细胞模型也被广泛地应用于以航天医学和空间生物学研究为代表的特殊环境生物学的研究中。早期，前苏联就已经在发射Zond5和Zond7时，将HeIa细胞带上了太空，而随着地面模拟机制的完善和空间搭载机会的增加，现代细胞分子生物学技术也在不断飞速发展，这为空间细胞生物学的研究带来了极大的便利条件，与之相应的空间细胞研究装置也层出不穷。到目前为止，包括美国国家航空局(NASA)，欧空局(ESA)等多家国际航空组织在内，均实现了诸多空间搭载细胞培养实验任务。例如，NASA的MSC-22633-1，-2任务搭建了一套可用于2D或3D培养生物细胞和组织的装置，利用电磁场刺激来观测其对细胞生长的作用。然而，一方面空间环境对细胞培养装置有特殊需求：1)因空间舱内体积狭小，需以最优配比实现空间体积利用率，因此要尽量减小搭载装置的体积；2)由于空间环境搭载能源有限，应尽量降低额外的能源消耗，在保证相关设施的正常运行外，应尽量降低功耗；3)航天搭载实验应尽量保证简单可控，在无人操作时保证仪器自行正常运转。而另一方面由于长期的空间环境飞行会降低宇航员的工作能力，所以应尽量减少人工操作，以保证低实验误差。

再次，微流控系统，作为21世纪新兴的科学技术方法，能够满足上述多项要求，体现出其独一无二的优势，因此已经成功的引进并应用到了航天等特殊环境领域。将微流控细胞培养技术应用于空间站等特殊环境的生物学研究中，可以为特殊环境细胞生物学研究提供有利平台。大量的微流控芯片细胞培养实验表明，多种细胞可在其内部维持长时间生长并维持生物活性，保证了特殊环境下细胞的实时动态检测，同时其提供可控的阀路控制及灵活多变的微设计结构有利于构建多种特殊环境生物学效应模型，为特殊环境细胞生物学研究带来了更为便捷的创新方法。

最后，地面实验中，细胞培养均需要在5％CO₂条件下进行，然而，在以空间站为代表的特殊环境中，却难以实现对细胞培养中CO₂的供应，故在地面上使用的细胞培养方法，无论是微流控细胞培养技术或是传统细胞培养技术，均难以低成本地直接在空间站等特殊环境中实现。

发明内容

为了克服现有技术上的问题，本发明提供了一种无CO₂下的细胞培养方法，既可以应用于针对空间站等特殊环境生物学研究或者便携式检测设备中的小型化、低功耗、微流控芯片细胞培养设备上，也可以应用于传统细胞培养方法。

本发明提供的无CO₂环境下的贴壁细胞和悬浮细胞专用培养基，成分包括基础培养基(如DMEM等)、胎牛血清、HEPES，并根据所培养细胞的具体要求，选择添加MEM NEAA(100×)、青霉素G、链霉素等。以上成分均已经商业化，可以直接购买市售商品，例如其中DMEM、胎牛血清、青霉素G、链霉素可购自Gibco品牌，MEM NEAA(100×)可购自Sigma品牌，HEPES可购自Solarbio品牌。

DMEM：一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养基的基础上研制的。

应说明的是，发明选用特定的培养基培养特定细胞，本发明不限于基础培养基的种类，一切可以实现本发明的基础培养基都包括在本发明中。

青霉素G、链霉素均为抗生素，可抑制细胞培养中的杂菌生长。

MEM NEAA(100×)：非必需氨基酸，作为细胞培养中的一种添加物，可提高细胞生长速度以及细胞存活率。

HEPES：N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-2-乙烷磺酸，是一种良好的缓冲物质，可代替Na₂CO₃和CO₂(HCO^3-)组成的共轭酸碱对，使细胞培养过程中，培养体系的pH值稳定在一定范围内。

本发明提供以下技术方案：

一种在无CO2环境下细胞培养用培养基，所述培养基包括：90％基础培养基、10％胎牛血清以及10mmol/L～100mmol/L N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-2-乙烷磺酸HEPES缓冲液。

进一步地，所述培养基包括：90％基础培养基、10％胎牛血清以及10mmol/L～100mmol/L HEPES，还包括90～130U/mL青霉素G溶液、90～130μg/mL链霉素溶液和体积浓度0.5～2％非必要氨基酸MEM NEAA(100×)溶液。

进一步地，所述培养基包括：90％基础培养基、10％胎牛血清以及10mmol/L～100mmol/L HEPES，还包括100U/mL青霉素G溶液、100μ g/mL链霉素溶液和体积浓度1％非必要氨基酸MEM NEAA(100×)溶液。

进一步地，所述基础培养基为DMEM培养基、RPMI-1640培养基、L15培养基、DMEM/F12培养基中的一种。

进一步地，所述无CO2环境下细胞培养用培养基适用于常规细胞培养中，也适用于微流控芯片细胞的培养中。

进一步地，所述无CO2环境下细胞培养用培养基用在单种细胞培养或者多种细胞的共培养体系中，

所述无CO2环境下细胞培养用培养基用于悬浮细胞培养或贴壁细胞培养。

一种利用无CO2环境下细胞培养用培养基培养常规细胞的方法，包括以下步骤：

(1)将细胞用胰蛋白酶消化成细胞悬液后，离心，并用所述的无CO2环境下细胞培养基重悬；

(2)将重悬的细胞计数后，按照1×105～1×106个/mL接种至培养容器中，置于37℃大气环境下培养。

进一步地，包括以下步骤：

(1)微流控芯片细胞培养腔室预先用包被液包被；

(2)将细胞用胰蛋白酶消化成细胞悬液后，离心，并用所述的无CO2环境下细胞培养基重悬，并将细胞悬液稀释至合适范围内，作为种子液，接种至微流控芯片中；

(3)将芯片置于37℃大气环境下静置至少3小时后，观察细胞形态，若贴壁细胞已经形态正常，则以0.3mL/h开始灌流培养，若形态未正常，则将芯片内部培养液更换成新鲜的所述的无CO2环境下细胞培养用培养基继续培养，继续静置至细胞贴壁后开始灌流培养。

进一步地，在步骤(1)中，使用的贴壁细胞包被液的成分为50～1200μg/mL人血浆来源的纤连蛋白，0.24g/L KH2PO4溶液、3.58g/L Na2HPO4·12H2O溶液、8g/L NaCl溶液以及0.2g/L KCl溶液，溶液pH值为7.2～7.4。

进一步地，步骤1中细胞为悬浮细胞则不需要包被，步骤2中细胞为悬浮细胞则不需要消化。

采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：

现代实验室中一般使用传统细胞培养技术，传统细胞培养技术中，一般需要CO₂气瓶作为CO₂源，而气瓶体积大，且不方便携带，这大大限制了细胞培养的应用。使用本发明提供的无CO₂细胞培养专用培养基在传统培养器皿或微流控芯片中培养细胞，可不需要CO₂气瓶，故培养装置的体积和重量均能大大降低，这大大拓宽了细胞培养技术的应用范围。使用本专利提供的无CO₂细胞培养专用培养基的培养装置可应用于便携式快速细胞培养分析装置、空间站等特殊环境中的生物学培养装置中等。

附图说明

图1是实施例1和实施例2中使用的微流控芯片结构图；

图2是实施例1和实施例2中培养的细胞形态检测结果图；

图3是实施例3中使用无CO₂细胞培养专用培养基培养的细胞形态检测结果图；

图4是实施例3中使用普通培养基培养的细胞形态检测结果图；

图5是实施例3中MTS试验的结果图；

图6是实施例4中使用无CO₂细胞培养专用培养基培养的细胞形态检测结果图；

图7是实施例4中使用普通培养基培养的细胞形态检测结果图；

图8是实施例4中MTS试验的结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的结构图及具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

无CO₂环境下微流控芯片内两种贴壁细胞的共培养

1、微流控芯片的加工与包被

如图1所示，结构由下至上分别为底层盖板、下层腔室、筛绢、上层腔室和上层盖板，芯片使用时通过双面胶及水晶滴胶以逐层累加的方式将每一层粘合到一起，形成需要的芯片，出入口通过硅胶管连接，芯片上下腔室使用筛绢隔开，再将芯片置于烘箱，在60℃下固化24h，保证水晶滴胶完全固化后待用。

成品芯片使用前，需要预处理。对于微流控芯片表面，需提前紫外消毒1h，微流控芯片培养腔室内部需要依次使用75％乙醇和0.1M PBS清洗，再使用质量浓度为500μg/mL的纤连蛋白包被1h后，方可接种细胞。

2、常规细胞培养

人神经母细胞瘤SH-SY5Y、人神经胶质瘤U87MG冻存于-150℃中，实验前，复苏细胞，置于37℃，5％CO₂培养箱中，培养于DMEM培养基，培养基中添加10％胎牛血清，100U/mL青霉素G和100μg/mL链霉素和2％MEM NEAA 100X。应说明的是，本实施例选用DMEM培养基培养人神经母细胞瘤SH-SY5Y、人神经胶质瘤U87MG，培养其他细胞也可以选用其他培养基，本发明不限于基础培养基的种类，一切可以实现本发明的基础培养基都可以用在本发明中。

3、微流控芯片细胞培养

取胰蛋白酶消化细胞，消化结束后用胎牛血清终止消化。经过消化的细胞经1000rpm离心5min，使用无CO₂细胞培养专用培养基重悬沉淀后，使用手持式自动细胞计数仪对细胞进行计数，所使用的计数芯片的尺寸为60μm，并将SH-SY5Y与U87MG细胞按照1∶1.65配制成1×105细胞悬液，最后接种至微流控芯片腔室中，置于37℃无CO₂条件下，待SH-SY5Y细胞以及U87MG细胞贴壁后开始灌流培养。

4、细胞形态检测

使用相差显微镜，分别观察贴壁细胞形态，细胞形态结果如图2中A所示。

实施例2

无CO₂环境下微流控芯片内的免疫细胞培养

1、微流控芯片的加工

使用实施例一中相同的微流控芯片。但芯片表面腔室可不包被。

2、常规细胞培养

人单核细胞系THP-1细胞冻存于-150℃中，实验前，复苏细胞，置于37℃，5％CO₂培养箱中，培养于RPMI-1640培养基，培养基中添加10％胎牛血清，90U/mL青霉素G和130μg/mL链霉素。

3、微流控芯片细胞培养

吸取THP-1细胞置于离心管中，经1000rpm离心5min后，弃上清，并使用无CO₂细胞培养专用培养基将沉淀重悬，再使用手持式自动细胞计数仪对细胞进行计数，所使用的计数芯片的尺寸为60μm，并将THP-1细胞稀释成1×10⁵细胞悬液，最后接种至微流控芯片腔室中，置于37℃无二氧化碳条件下，静置3h后开始灌流培养。

4、细胞形态检测

使用相差显微镜，分别观察贴壁细胞和悬浮细胞形态，细胞形态结果如图2中B所示。

实施例3

无CO₂环境下的贴壁细胞共培养

1、96孔板上的细胞培养

SH-SY5Y、U87MG冻存于-150℃中，实验前，复苏细胞，置于37℃，5％CO₂培养箱中，培养于DMEM培养基，培养基中添加10％胎牛血清，130U/mL青霉素G和90μg/mL链霉素和0.5％MEM NEAA(100X)。实验时，取胰蛋白酶消化细胞，消化结束后用胎牛血清终止消化。经过消化的细胞经1000rpm离心5min，使用无CO₂细胞培养专用培养基重悬沉淀后，使用手持式自动细胞计数仪对细胞进行计数，所使用的计数芯片的尺寸为60μm，并将SH-SY5Y与U87MG细胞按照1∶1.65配制成细胞悬液，最后按照5000个细胞每孔将稀释好的细胞悬液接种至孔中，置于37℃无CO₂的培养箱中，培养24h。

2、细胞形态检测

使用相差显微镜，分别观察贴壁细胞形态，使用专用培养基培养的细胞形态结果如图3，使用普通培养基培养的细胞形态如图4。

3、MTS法检测细胞存活率

细胞培养24h后，按照培养物：MTS＝100：20(V/V)向96孔板中添加MTS，置37℃避光孵育2h，充分震荡5min，最后使用酶标仪在490nm处下测定吸光值。样品的吸光值减去已加MTS空培养基的吸光值即为每孔样品的MTS的吸光度。MTS的吸光值越大细胞存活率越高，细胞存活情况如图5。

实施例4

无CO₂环境下的悬浮细胞培养

1、96孔板上的细胞培养

人单核细胞系THP-1冻存于-150℃中，实验前，复苏细胞，置于37℃，5％CO₂培养箱中，培养于RPMI-1640培养基，培养基中添加10％胎牛血清，100U/mL青霉素G和100μg/mL链霉素。实验时，吸取细胞培养液，置于离心管中，经1000rpm离心5min，使用无CO₂细胞培养专用培养基重悬沉淀后，使用手持式自动细胞计数仪对细胞进行计数，所使用的计数芯片的尺寸为60μm，最后按照5000个细胞每孔将稀释好的细胞悬液接种至孔中，置于37℃无CO₂的培养箱中，培养24h。

2、细胞形态检测

使用相差显微镜，分别观察悬浮细胞形态，使用专用培养基培养的细胞形态结果如图6，使用普通培养基培养的细胞形态如图7。

3、MTS法检测细胞存活率

细胞培养24h后，按照培养物：MTS＝100：20(V/V)向96孔板中添加MTS，置37℃避光孵育2h，充分震荡5min，最后使用酶标仪在490nm处下测定吸光值。样品的吸光值减去已加MTS空培养基的吸光值即为每孔样品的MTS的吸光度。MTS的吸光值越大细胞存活率越高，细胞存活情况如图8所示。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种在无CO₂环境下细胞培养用培养基，其特征在于，所述培养基包括：90％基础培养基、10％胎牛血清以及10mmol/L～100mmol/L N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸HEPES缓冲液。

2.根据权利要求1所述的无CO₂环境下细胞培养用培养基，其特征在于，所述培养基包括：90％基础培养基、10％胎牛血清以及10mmol/L～100mmol/L HEPES，还包括90～130U/mL青霉素G溶液、90～130μg/mL链霉素溶液和体积浓度0.5～2％非必要氨基酸MEM NEAA(100×)溶液。

3.根据权利要求2所述的无CO2环境下细胞培养用培养基，其特征在于，所述培养基包括：90％基础培养基、10％胎牛血清以及10mmol/L～100mmol/L HEPES，还包括100U/mL青霉素G溶液、100μg/mL链霉素溶液和体积浓度1％非必要氨基酸MEM NEAA(100×)溶液。

4.根据权利要求1或2中任一项所述无CO₂环境下细胞培养用培养基，其特征在于，所述基础培养基为DMEM培养基、RPMI-1640培养基、L15培养基、DMEM/F12培养基中的一种。

5.根据权利要求1或2中任一项所述无CO₂环境下细胞培养用培养基，其特征在于，所述无CO₂环境下细胞培养用培养基适用于常规细胞培养中，也适用于微流控芯片细胞的培养中。

6.根据权利要求1或2中任一项所述无CO₂环境下细胞培养用培养基，其特征在于，所述无CO₂环境下细胞培养用培养基用在单种细胞培养或者多种细胞的共培养体系中，

所述无CO2环境下细胞培养用培养基用于悬浮细胞培养或贴壁细胞的培养。

7.一种利用权利要求1或2中任一项所述的无CO₂环境下细胞培养用培养基培养常规细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将细胞用胰蛋白酶消化成细胞悬液后，离心，并用所述的无CO₂环境下细胞培养基重悬；

(2)将重悬的细胞计数后，按照1×10⁵～1×10⁶个/mL接种至培养容器中，置于37℃大气环境下培养。

8.一种利用权利要求1所述的无CO₂环境下细胞培养用培养基培养微流控芯片细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)微流控芯片细胞培养腔室预先用包被液包被；

(2)将细胞用胰蛋白酶消化成细胞悬液后，离心，并用所述的无CO₂环境下细胞培养基重悬，并将细胞悬液稀释至合适范围内，作为种子液，接种至微流控芯片中；

(3)将芯片置于37℃大气环境下静置至少3小时后，观察细胞形态，若贴壁细胞已经形态正常，则以0.3mL/h开始灌流培养，若形态未正常，则将芯片内部培养液更换成新鲜的所述的无CO₂环境下细胞培养用培养基继续培养，继续静置至细胞贴壁后开始灌流培养。

9.根据权利要求8，所述的无CO₂环境下细胞培养用培养基培养微流控芯片细胞的方法，其特征在于，在步骤(1)中，使用的贴壁细胞包被液的成分为50～1200μg/mL人血浆来源的纤连蛋白，0.24g/L KH₂PO₄溶液、3.58g/L Na₂HPO₄·12H₂O溶液、8g/L NaCl溶液以及0.2g/LKCl溶液，溶液pH值为7.2～7.4。

10.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，步骤1中细胞为悬浮细胞则不需要包被，步骤2中细胞为悬浮细胞则不需要消化。

11.根据权利要求8所述的培养方法，其特征在于，步骤1中细胞为悬浮细胞则不需要包被，步骤2中细胞为悬浮细胞则不需要消化。