CN106434486A - 一株脱硫红细菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株脱硫红细菌(Rhodobacter sp.)DS‑17及其用于含硫化物的废水脱硫，属于生物与环保技术领域。本发明的红细菌菌株具有如SEQ ID No.1所示的16SrDNA序列。本发明的红细菌菌株能够通过生物脱硫作用利用硫化物作为电子供体获取能量，实现硫化物的去除，4.5h去除率可达到99.85％，能够在去除过程中将硫化物转化为可回收的单质硫，硫转化率为58.06％，具有较高的环保价值和经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及一株新筛选的红细菌，该菌株能够通过生物脱硫作用利用硫化物作为电子供体获取能量，实现硫化物的去除，适用于含硫化物的废水、天然气及沼气脱硫。属于生物与环保技术领域。
背景技术
由于硫化氢气体具有毒性，臭鸡蛋气味以及对金属设备具有腐蚀性，所以国家环保部规定废气中硫化物须达到符合商业销售和安全输送及使用规范标准方可排放。因此，在工程实施的过程中，必须采取安全有效的措施控制硫化物向周边环境中的释放，一般采取的方法为物理法、化学法和生物法。
传统的脱硫工艺常使用化学法来脱除硫化物，但由于需要不断地消耗脱硫剂，运行成本较高。而生物脱硫技术主要依靠能够自我繁殖的微生物来催化脱硫，脱硫剂可以自我再生，运行成本较低，具有广阔的应用前景。
生物脱硫的核心是脱硫微生物。目前文献报道的大多数菌株都适用于专一性的脱除有机硫，但单一性的脱除硫化物(H2S)的菌株虽有报道，但大多存在一些问题，例如菌株的营养类型单一。如一株那不勒斯硫杆菌及其在生物脱硫中的应用(申请号：201410179292.X)，该菌在一定条件下，对还原态的硫化物、单质硫及硫代硫酸盐有较强的氧化能力，但该菌处理硫代硫酸盐废水的时候需要24h才能可实现99％的去除，相比本发明涉及的一株脱硫红细菌要略显不足。
因此迫切需要一些高效低成本、脱硫效果迅速的微生物脱硫菌株来改进生物脱硫工艺。
发明内容
本发明的目的是针对现有脱硫菌株存在的问题和不足，提供一株高效快速脱硫菌株及其应用，该菌株能够通过生物脱硫作用利用硫化物作为电子供体获取能量，实现硫化物的去除，适用于含硫化物的废水、天然气及沼气脱硫。
为实现上述目的，本发明首先提供了一株硫氧化细菌，红细菌(Rhodobacter sp.)DS-17，于2016年06月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101)，保藏编号为：CGMCC No.12631。
本发明提供的红细菌(Rhodobacter sp.)DS-17从成都市长安垃圾填埋场渗滤液中筛选得到，筛选方法为：采用硫代硫酸钠培养基富集驯化7天，然后取驯化液利用硫化钠培养基进行平板分离，3～4天后菌落生成，挑取单菌落接入硫化钠培养基培养，重复4次以上获得纯菌。该菌命名为DS-17，革兰氏染色为阴性，细胞形态为杆状，长2.0～6.0μm，宽0.8～1.2μm。菌落颜色为淡黄色，其生理特点为：该菌生长pH为5.0～8.5，最适pH为7.0，生长温度为20～35℃，最适温度为30℃。该菌营养类型为兼性营养型，能利用牛肉膏、蛋白胨和酵母粉等有机碳源进行异养快速生长，也能利用二氧化碳为唯一碳源进行自养生长；在以二氧化碳为唯一碳源进行自养生长时，该菌能够利用氧气将硫化物氧化为单质硫或硫酸盐。
2HS-+O2→2S+2OH-
HS-+2O2→SO4 2-+H+
本发明的另一目的提供了红细菌菌株DS-17在生物脱硫中的应用，脱硫效果验证显示，该菌株在自养条件下4.5h内实现了99.85％的硫化物去除，58.06％的单质硫转化率。
本发明提供了在菌株筛选和培养过程中使用到的培养基，其培养基配方均为在筛菌过程中优化得到的：(1)硫化钠培养基，用于菌株筛选和脱硫效果实验，其配方为：Na2S.9H2O 10.0g，KH2PO4 1.0g，K2HPO4 1.0g，NH4Cl 0.2g，MgCl2 0.2g，NaHCO3 1.0g，微量元素溶液1ml，维生素溶液1ml。用1mol/L的HCl溶液调节pH至中性。(2)硫代硫酸钠培养基，用于富培养集，培养基配方为：Na2S2O3.5H2O 10.0g，KH2PO4 1.0g，K2HPO4 1.0g，NH4Cl 0.2g，MgCl2 0.2g，NaHCO3 1.0g，微量元素溶液1ml，维生素溶液1ml。用1mol/L的NaOH溶液调节pH至中性。(3)有机碳源异养培养基，用于扩大培养和验证该菌的营养类型：牛肉膏5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、氯化钠5.0g/L，pH 7.0～7.2。
本发明提供了上述菌株的16SrDNA鉴定结果。经过16SrDNA鉴定及BLAST比对，DS-17与红细菌属的同源性达到了99％，因此鉴定该菌株为红细菌(Rhodobacter sp.)DS-17。本发明提供的红细菌(Rhodobacter sp.DS-17)的16SrDNA基因序列如SEQ ID No.1所示：
GCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAACGTACCCTTTGGTACGGAATAGCCCCGGGAAACTGGGAGTAATACCGTATGGTGTCTTCGGACTAAAGATTTATCGCCAAAGGATCGGCCCGCGTTGGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGCCGACGATCCATAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTAGACAATGGGCGCAAGCCTGATCTAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCAGCTGGGAAGATAATGACGGTACCAGCAGAAGAAGCCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGATTGAAAAGTTGGGGGTGAAATCCCGGGGCTCAACCTCGGAACTGCCTTCAAAACTATCAGTCTGGAGTTCGAGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTCGATACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCCAGTCGTCGGGCAGCATGCTGTTCGGTGACACACCTAACGGATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAACCCTTGACATGGTGATCGTAGTTTCCAGAGATGGATTCGTCAGTTCGGCTGGATCACACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTCGGTTAAGTCCGGCAACGAGCGCAACCCACGTCCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAGGGAAACTGCCGATGATAAGTCGGAGGAAGGTGTGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTAGTGACAATGGGATAATCCCCAAAAGCTATCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGTAACAGCATGACGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGGTCTACCCGAAGGTGGTGCGCTA
本发明涉及的生物材料相关保藏信息为：
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2016年06月16日；保藏编号：CGMCC No.12631；命名为：红细菌(Rhodobacter sp.)DS-17。
本发明的优点在于：
(1)本发明涉及的红细菌的营养类型为兼性营养型，在异养条件下实现菌体的快速繁殖，在自养条件下实现高效脱硫。利用有机碳源异养培养基对菌株进行扩大培养获得高密度菌体，用于实现生物脱硫工程的快速启动。
(2)本发明涉及的红细菌的脱硫速率较快，自养条件下，4.5h硫化物去除率可达到99.85％，能够在去除过程中将硫化物转化为可回收的单质硫，硫转化率为58.06％；
(3)本发明涉及的红细菌能够耐受较高浓度的硫化物，自养脱硫条件下耐受的硫(S2-)浓度高达1079.13mg/L。
(4)符合生物安全法规，本发明涉及的红细菌菌株从被高硫化物长期胁迫的选择环境中筛选得到，不会对周围环境和生态平衡造成危害。
附图说明
图1本发明红细菌DS-17在扫描电子显微镜下的细胞形态。
图2本发明涉及的红细菌DS-17的在异养和自养条件下培养的生长曲线，其中：(a)红细菌DS-17在自养条件下的生长曲线，(b)红细菌DS-17在异养条件下的生长曲线。
图3本发明红细菌DS-17在脱硫效果实验过程中各因素的变化情况，其中：(a)硫化物去除率的变化，(b)单质硫浓度变化情况。
图4本发明红细菌DS-17脱硫形成的单质硫在扫描电镜(SEM)下的形态。
具体实施方式
以下结合实施例详细说明本发明。实施方案方便于更好的理解本发明，但并非对本发明的限制。
实施例中涉及到的培养基配方为：
(1)硫化钠培养基，配方为：Na2S.9H2O 10.0g，KH2PO4 1.0g，K2HPO4 1.0g，NH4Cl0.2g，MgCl2 0.2g，NaHCO3 1.0g，微量元素溶液1ml，维生素溶液1ml。用1mol/L的HCl溶液调节pH至中性。
(2)硫代硫酸钠培养基，配方为：Na2S2O3.5H2O 10.0g，KH2PO4 1.0g，K2HPO4 1.0g，NH4Cl 0.2g，MgCl2 0.2g，NaHCO3 1.0g，微量元素溶液1ml，维生素溶液1ml。用1mol/L的NaOH溶液调节pH至中性。
(3)有机碳源异养培养基，配方为：牛肉膏5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、氯化钠5.0g/L，pH 7.0～7.2。
实施例1：菌株筛选
取成都市长安垃圾填埋场(位于成都市龙泉驿区洛带镇万兴乡)渗滤液适量，按20％的接种量加入含5L硫代硫酸钠培养基的反应器中，在pH＝7.0，0.5L/min，30℃的条件下富集培养7天，采用硫化钠培养基进行平板分离，3～4天后菌落生成，挑取单菌落接入平板中培养，重复划线分离4次以上获得纯菌。
实施例2：菌株鉴定
将菌株按照相同的接种量接种于硫代硫酸钠液体培养基中，置于不同温度的摇床中(20℃、25℃、30℃、40℃)培养30h，确定该菌株最适生长温度为30℃；采取初始pH别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在最适生长温度下培养30h，确定最适生长pH为7.0。
将分离纯化的菌株在扫描电子显微镜(SEM)下观察，如图1所示，该菌形态为杆状，长2.0～6.0μm，宽0.8～1.2μm，无鞭毛；革兰氏鉴定为阴性。
采用细菌全基因组快速抽提试剂盒，提取纯菌株的全基因组，通过选用细菌16SrDNA通用引物27F和1492R进行PCR，然后测序分析。测序结果经BLAST比对，鉴定该菌株为红细菌，命名为Rhodobacter sp.DS-17，即为本发明的保藏菌株红细菌CGMCC No.12631(Rhodobacter sp.DS-17)。
对红细菌菌株DS-17进行生长曲线研究，分别选用硫代硫酸钠培养基进行自养培养和有机碳源异养培养基进行异养培养，结果如附图2(a)、(b)所示：(a)红细菌DS-17可以在硫代硫酸钠培养基中生长，培养30h后菌液OD值达到0.32；(b)红细菌DS-17在能够在有机碳源异养培养基中快速生长，培养30h后，菌液OD值达到1.13，远高于在无机环境中培养的结果。这说明该菌的营养类型为兼性营养型；在工程应用中可以使用有机碳源异养培养基快速获得高密度菌体。
实施例3：脱硫瓶试
将200ml硫化钠培养基溶液(600mg/L S2-)在紫外下灭菌30min，无菌条件下装入已灭菌的500ml三角瓶中，然后加入50ml接种培养30h后的红细菌菌液，用好氧塞塞住瓶口，置于摇床中振荡(30℃、200r/min)，测定初始硫化物浓度为504mg/L；所述硫化钠培养基配方为：Na2S.9H2O 10.0g，KH2PO4 1.0g，K2HPO4 1.0g，NH4Cl 0.2g，MgCl2 0.2g，NaHCO3 1.0g，微量元素溶液1ml，维生素溶液1ml，用1mol/L的HCl溶液调节pH至中性。
对照组加入等量的无菌水，每个实验组设置三个重复，每隔30分钟取样测定硫化物浓度、单质硫浓度，取平均值。在4.5小时后，硫化物浓度几近于零，其测定计算结果如附图3(a)、(b)所示。实验组硫化钠溶液中添加该脱硫菌后，其硫化物去除效果明显，达到99.85％；单质硫累积浓度最高可达到293.01mg/L，相应的转化率达到58.06％。对照组中硫化物的去除是由于摇瓶振荡促进了硫化物的逸出，但从单质硫转化率可以看出，硫化物的去除只是单纯的物理性移除，并不是生物转化去除。
实施例4：脱硫罐试
将5L硫化钠培养基溶液(设计初始浓度为1200mg/L S2-，实测S2-浓度为1079.13mg/L)装入已灭菌的8L的反应器中(反应器中添加有软性填料，用以微生物挂膜)，然后加入500ml接种培养30h后的红细菌菌液，用空气泵曝气，曝气速率为0.4L/min，保持环境温度为28℃～30℃，每天定时定量添加硫代硫酸钠培养基，在此条件下驯化7天，使微生物能够在填料上附着，然后进行去除硫化物的验证试验；在实现菌体在反应器中挂膜成功后，往反应器中添加1000ml通过紫外灭菌的硫化钠培养基溶液；对照组加入等量的无菌水，每个实验组设置三个重复，每隔30分钟取样测定硫化物浓度、单质硫浓度，取其平均值。在3h后，其测定计算结果如下表1所示。
表1红细菌罐试脱硫效果
由上表可知，在实验组实现挂膜后的反应器中，加入硫化钠溶液3小时后，硫化物浓度比对照组去除率明显要高，单质硫产率明显要高，其中硫化物去除率可达到99.95％，实际单质硫转化率可达到49.39％。与实例3相比，成功挂膜的反应器中，该菌株对硫化物的去除速率更快，效率更高，可实施用于脱硫应用。对照组中硫化物的去除是由于空气吹脱导致硫化物的逸出，但从单质硫转化率可以看出，硫化物的去除只是单纯的物理性移除，并不是生物转化去除。
实施例5：生物硫颗粒观察
对红细菌DS-17处理后废水中的单质硫聚合形成的生物硫颗粒进行了扫描电子显微镜观察，结果如附图4所示：废水中的生物硫颗粒形态大小不一，颗粒表面有微孔。
序列表
<110>中国科学院成都生物研究所
<120>一株脱硫红细菌及其应用
<160>1
<210>1
<211>1282
<212>DNA
<213>红细菌（Rhodobacter sp.）
<400>1
gcggacgggt gagtaacgcg tgggaacgta ccctttggta cggaatagcc ccgggaaact 60
gggagtaata ccgtatggtg tcttcggact aaagatttat cgccaaagga tcggcccgcg 120
ttggattagg tagttggtgg ggtaatggcc taccaagccg acgatccata gctggtttga 180
gaggatgatc agccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt 240
ggggaatctt agacaatggg cgcaagcctg atctagccat gccgcgtgag tgatgaaggc 300
cctagggttg taaagctctt tcagctggga agataatgac ggtaccagca gaagaagccc 360
cggctaactc cgtgccagca gccgcggtaa tacggagggg gctagcgttg ttcggaatta 420
ctgggcgtaa agcgcgcgta ggcggattga aaagttgggg gtgaaatccc ggggctcaac 480
ctcggaactg ccttcaaaac tatcagtctg gagttcgaga gaggtgagtg gaattccgag 540
tgtagaggtg aaattcgtag atattcggag gaacaccagt ggcgaaggcg gctcactggc 600
tcgatactga cgctgaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag 660
tccacgccgt aaacgatgaa tgccagtcgt cgggcagcat gctgttcggt gacacaccta 720
acggattaag cattccgcct ggggagtacg gccgcaaggt taaaactcaa aggaattgac 780
gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcgc agaaccttac 840
caacccttga catggtgatc gtagtttcca gagatggatt cgtcagttcg gctggatcac 900
acacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttcggtt aagtccggca 960
acgagcgcaa cccacgtcct tagttgccag cattcagttg ggcactctag ggaaactgcc 1020
gatgataagt cggaggaagg tgtggatgac gtcaagtcct catggccctt acgggttggg 1080
ctacacacgt gctacaatgg tagtgacaat gggataatcc ccaaaagcta tctcagttcg 1140
gattggggtc tgcaactcga ccccatgaag tcggaatcgc tagtaatcgc gtaacagcat 1200
gacgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat gggagttggg 1260
tctacccgaa ggtggtgcgc ta 1282
Claims (3)
1.一株脱硫红细菌，Rhodobacter sp.DS-17，其特征在于，其保藏编号为：CGMCCNo.12631，革兰氏染色为阴性，细胞形态为杆状，长2.0～6.0μm，宽0.8～1.2μm，无鞭毛；菌落呈圆形，表面凸起，颜色为淡黄色；生长pH为5.0～8.5，生长温度为20～35℃；该菌营养类型为兼性营养型，能利用牛肉膏、蛋白胨和酵母粉等有机碳源进行异养快速生长，也能利用二氧化碳为唯一碳源进行自养生长；在以二氧化碳为唯一碳源进行自养生长时，该菌能够利用氧气将硫化物氧化为单质硫或硫酸盐。
2.如权利要求1所述的脱硫红细菌，其特征在于，所述脱硫红细菌的16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。
3.权利要求1所述的脱硫红细菌在硫化物脱硫中的应用。
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