CN105462869B - 双酶梭菌及其用途及纳米金属硫化物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及双酶梭菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.9294，保藏日期2014年6月12日。本发明的双酶梭菌具有高的金属离子耐受浓度、在高重金属浓度的环境下，能够保持良好的活性。

Description

双酶梭菌及其用途及纳米金属硫化物的制备方法

技术领域

本发明涉及双酶梭菌，本发明涉及该双酶梭菌在制备纳米金属硫化物中的应用，本发明还涉及该双酶梭菌在处理重金属污染物中的应用。

背景技术

近年来，新兴的生物制备纳米粒子的方法即众多的生物大分子在合适的生理条件（pH、温度、盐度）下都是天然的纳米反应器。利用微生物体来合成纳米材料的主力军是细菌，当然利用真菌和病毒等其它微生物体也已制备出许多性能优良、形貌精美的纳米材料。相对于传统的物理、化学制备的方法，生物法具有其独特的优点，如制备程序简单、细菌易于控制、条件温和、设备简单、操作方便和成本较低、收率高等。

但是，现有技术中，细菌对重金属的耐受浓度普遍不高，这限制了微生物体在制备纳米材料方面的应用。

发明内容

本发明提供一种双酶梭菌，本发明还提供了该双酶梭菌在制备纳米金属硫化物中的应用，本发明还提供了该双酶梭菌在处理重金属污染物中的应用。

一种双酶梭菌（Clostridium bifermentans），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.9294，保藏日期2014年6月12日。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

该双酶梭菌在制备纳米金属硫化物中的应用。

制备纳米金属硫化物的方法，包括以下步骤：

S10.在培养基中加入含0.01-5g/L金属盐溶液，调节pH值至4-9，灭菌后冷却至室温，加入含有双酶梭菌的菌液，获得接种溶液；

S20.将接种溶液放置于15-45℃下厌氧培养6~76小时;

S30.获得纳米金属硫化物。

所述的金属盐溶液中的金属元素为镍、钴、锌、镉、铁、锰、汞、铅、金、银、铜中的一种或几种。

所述的金属盐溶液为硝酸盐溶液、盐酸盐溶液和硫酸盐溶液中的一种或几种。

所述的金属盐溶液和/或培养基中还包括镍、钴、锌、镉、铁、锰、汞、铅、金、银、铜等元素离子的络合物。

所述的培养基中包括含硫有机质。

该双酶梭菌在处理重金属污染物中的应用。

本发明的双酶梭菌具有高的金属离子耐受浓度、在高重金属浓度的环境下，能够保持良好的活性。能够以原位的方法，应用于制备纳米粒子和处理重金属污染物。

说明书附图

图1为实施例1获得的黑色沉淀TEM图。

图2为实施例2获得的黑色沉淀TEM图。

图3为实施例3获得的黑色沉淀TEM图。

图4为实施例4获得的黑色沉淀TEM图。

图5为实施例5获得的黑色沉淀TEM图。

图6为不同Cd²⁺浓度对去除情况的影响图（t＝37℃，pH=6.5）。

图7为不同Cu²⁺浓度对去除情况的影响图（t＝37℃，pH=6.5）。

图8为pH对Cd^2＋去除率的影响图（t＝37℃，Cd2+为40mg/L）。

图9为pH对Cu^2＋去除率的影响图（t＝37℃，Cu2+为40mg/L）。

图10为温度对Cd²⁺去除率的影响图（pH=6.5，Cd2+为40mg/L）。

图11为温度对Cu²⁺去除率的影响图（pH=6.5，Cu2+为40mg/L）。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

一株双酶梭菌（Clostridium bifermentans），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.9294，保藏日期2014年6月12日。

细菌的获取：

1、采集与富集天然菌株

从浙江某地一家电镀公司废水排放口处采取液样和固样，放入装有 30mL己灭菌的生理盐水的锥形瓶中，放摇床振荡 30min，连续稀释至10一6倍，然后用移液枪吸取 1mL所需浓度的菌悬液，注入富集培养基内并置于35℃电子恒温培养箱中，培养2-4天。用肉眼观察培养基内是否有菌生长。

2、菌的驯化

取富集样品1mL，接种于驯化培养基中，在35℃、200 r/min的摇床上培养72h，再取培养液1mL进行传代驯化。每72h接种传代1次。经过若干代重金属离子驯化后，选择生长代谢旺盛、菌丝球丰富、分布均匀者供平板分离初筛。

3、初筛方法

蘸取驯化菌液于分离平板上划线，35℃培养48h-72h，观察菌体生长情况，挑选生长优良的单菌落接种于斜面试管中。

4、复筛方法

将初筛得到的菌株分别接种于复筛培养基中进行摇瓶培养，在35℃、200 r/min的摇床上培养72h，每12h测1次培养基中剩余的重金属离子浓度，淘汰去除重金属离子能力较低的菌株，将能力较高的菌株接种于扩大培养基中，35℃下进行增殖培养。

5、菌种的纯化

菌种的纯化实验采用改良的Brewer皿厌氧琼脂平板进行操作。复筛培养液中取10ml 菌液，放入事先充满氮气并带有数粒玻璃珠的无氧灭菌的培养瓶中，在振荡器中振荡1 小时后将污泥中菌胶团彻底打碎，然后用充满氮气的脱氧无菌水或脱氧无菌生理盐水进行 10 倍为基准的梯度稀释，将梯度稀释后的菌液分别接种于固体培养基之中制成滚管，培养3天。挑取单菌落转接入液体培养基中。 重复以上操作若干次，直至管内菌落和显微镜下的细胞形态一致认为是纯菌株，再进一步用电镜确认。将分离纯化的发酵细菌转接于液体培养基中，35℃、200r/min 振荡培养3天，再次检测培养液中重金属离子剩余浓度，确定获取对重金属离子去除能力较高的功能菌。

6、菌的鉴定

首先在商品哥伦比亚血琼脂培养基厌氧平板(上海科玛嘉微生物技术有限公司)，用无菌接种环挑取获得的功能菌种接种于平板，放置于37℃恒温培养箱中培养，观察平板上菌种的生长状况和细胞形态，直至平板上菌落和显微镜下的细胞形态一致认为是纯菌株；其次通过对菌株菌落、液体培养特征、细胞形态观察、生理生化特征实验基础上，对其16SrDNA序列分析研究，最后确定为一株双酶梭菌（Clostridium bifermentans），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.9294，保藏日期2014年6月12日。

在1L培养基中加入0.5g硫酸亚铁，灭菌冷却后再接种5%已经培养好的菌液进行培养，然后通过不断增加硫酸亚铁的浓度对菌株进行驯化，最终获得对亚铁离子具有耐受性的优势菌株，最大耐受浓度为5g/L硫酸亚铁。

双酶梭菌细菌形态：细小菌落、干燥；革兰阳性、芽孢杆菌。基本生化反应：触酶 -、氧化酶 - 、吲哚 + 、克氏双糖 -/-（生长不良）。

本申请的双酶梭菌能够将有机质中的硫元素转化为硫离子，相对于其他双酶梭菌以及其他种类的细菌，同时具有更强的重金属耐受能力，可用于原位制备纳米金属硫化物。

现有技术中，双酶梭菌可以从动物的新鲜粪便中分离，但是该双酶梭菌的重金属耐受能力很差。

该双酶梭菌在制备纳米金属硫化物颗粒中的应用。

制备纳米金属硫化物的方法，包括以下步骤：

S10.在培养基中加入可溶性金属盐溶液，调节pH值至4-9，高温灭菌后冷却至室温，再加入含有双酶梭菌的菌液，获得接种溶液；

S20.将接种溶液放置于15-42℃下厌氧培养；

S30.获得纳米金属硫化物颗粒。

所述的金属盐溶液中的金属元素为镍、钴、锌、镉、铁、锰、汞、铅、金、银、铜中的一种或几种。

优选在培养基中含有0.01-5g/L的金属离子。所述的金属盐溶液为硝酸盐溶液、盐酸盐溶液、硫酸盐溶液中的一种或几种。

所述的金属盐溶液和/或培养基中还包括镍、钴、锌、镉、铁、锰、汞、铅、金、银、铜元素离子的络合物。

经过大量的实验，我们发现，为了得到粒径分布更加均匀的纳米粒子，可以加入络合物，所述的络合物包括柠檬酸及其盐，EDTA、依地酸钙二钠、二巯基丙磺酸钠、二巯基丁二酸钠、青霉胺等。

所述的培养基中包括含硫有机质。所述含硫有机质优选含硫氨基酸。

该双酶梭菌在处理重金属污染物中的应用。

处理重金属污染物的材料，含有该双酶梭菌。作为一种优选的技术方案，本发明可以采用含有该双酶梭菌0.01-1 g/L的菌液或双酶梭菌制成的粉末，可直接用于处理重金属废液。

原料来源：

纳米粒子TEM样品的制备:

透射电镜(TEM)是一种高分辨率、高放大倍数的显微镜，是材料科学研究的重要手段，能提供极微细材料的组织结构、晶体结构和化学成分等方面的信息。它的分辨率为0.1～0.2nm，放大倍数为几万～几十万倍。

⑴ 一定条件下在硫酸亚铁浓度为3g/L的液体培养基中生成的黑色沉淀与液体培养基摇匀，用一次性塑料注射器取1.5mL于1.5mL的离心管中，4℃下高速离心10min，倾去上层液；

⑵ 上述装有离心后的沉淀物的离心管中加入1mL 20μg/mL的溶菌酶溶液，37℃温育20min，然后用超声波破碎仪充分破碎，4℃下高速离心10min，倾去上层液；

⑶加入无菌去离子水至1.5mL，涡旋振荡使沉淀重悬，再在4℃下高速离心10min，倾去上层液；

⑷重复步骤⑶3次，然后用无菌去离子水重新悬浮；

⑸所得液体混合状样品滴在铜网上，稍加自然干燥后在透射电镜下观察。

实施例1

在培养基中加入3g/L硫酸亚铁，调节pH值6，灭菌后加入5%菌体浓度为3×10⁸ cells/mL的已培养好的菌液。接种后的浅黄色溶液放置于各20℃温度下厌氧培养6h，溶液变为黑色不透明溶液。过滤获得黑色沉淀。TEM见图1。

实施例2

与实施例1相同，1g/L硫酸亚铁，PH为9，温度为30℃，加入柠檬酸。TEM见图2。

实施例3

与实施例1相同，加入柠檬酸，PH为6，温度为35℃。TEM见图3。

实施例4

与实施例1相同，加入5g/L硫酸亚铁，PH为6，温度为40℃。TEM见图4。

实施例5

与实施例1相同，加入5g/L硫酸锌，PH为6，温度为35℃。TEM见图5。

对比例1

从成年猪的新鲜粪便中分离出双酶梭菌，实验条件与实施例1相同，加入0.5g/L硫酸亚铁。5天之后最终获得棕色溶液。

通过对比例1与实施例1，普通的双酶梭菌在重金属溶液中活性较低，生成纳米材料的速度很慢，无法以原位合成的方式高效制备纳米材料。

通过图3与其他图的对比，可以看出，加入柠檬酸，可以得到粒径更加均匀的纳米粒子。

从透射电镜的结果来看，硫化亚铁呈现了不同的形态，有不规则球形、薄片状和细针状，粒径大约在40～50nm左右。通过控制重金属浓度、pH值、温度等条件，可以得到不同形状和大小的纳米粒子。

该双酶梭菌在处理重金属污染物中的应用。

细菌含量为约为10⁸个/ml；

分别配制含有重金属离子的培养基各100ml，分别调节pH至4.5－8.5，在121℃，1.01KPa条件下，高温高压灭菌20min后，静置，冷却后用注射器分别向每个培养基中注射0.1g/L（细菌含量约为10⁸个/ml）的菌液，置于恒温培养箱中，进行不同条件下的培养(重金属离子浓度、pH、温度)后，高速离心培养液15min，采用原子吸收分光光度法测定上清液中剩余重金属离子的浓度。见图7-11。

可见本发明提供的双酶梭菌具有处理重金属污染物的能力。

Claims (8)

1.一种双酶梭菌（Clostridium bifermentans），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.9294，保藏日期2014年6月12日。

2.如权利要求1所述的双酶梭菌在制备纳米金属硫化物颗粒中的应用，所述纳米金属硫化物为硫化锌、硫化铁中的一种或两种。

3.制备纳米金属硫化物的方法，包括以下步骤：

S10.在培养基中加入可溶性金属硫酸盐溶液，调节pH值至4-9，高温灭菌后冷却至室温，再接种如权利要求1所述的双酶梭菌，获得接种溶液；

S20.将接种溶液放置于15-42℃下厌氧培养；

S30.获得纳米金属硫化物颗粒。

4.如权利要求3所述的制备纳米金属硫化物的方法，其特征在于，所述的金属盐溶液和/或培养基中还包括镍、钴、锌、镉、铁、锰、汞、铅、金、银、铜元素离子的络合物。

5.如权利要求3所述的制备纳米金属硫化物的方法，其特征在于，所述的金属离子的浓度为0.01-5g/L。

6.如权利要求3所述的制备纳米金属硫化物的方法，其特征在于，所述的培养基中包括含硫有机质。

7.如权利要求1所述的双酶梭菌在处理重金属污染物中的应用。

8.处理重金属污染物的组合物，含有如权利要求1所述的双酶梭菌。