JP3477515B2 - クロストリジウム・ビフェルメンタンスｄｐｈ−１由来パークロロエチレン脱ハロゲン化酵素、当該酵素のポリペプチド、当該酵素をコードする遺伝子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】本発明は、クロストリジウム
・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１由来パークロロエチレ
ン脱ハロゲン化酵素、及び当該酵素のポリペプチドとそ
れをコードする遺伝子に関する。 【０００２】 【従来の技術】テトラクロロエチレン等のパークロロエ
チエレン（ｐｅｒｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅ：ＰＣ
Ｅ）、トリクロロエチレン（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｅｔｈ
ｙｌｅｎｅ：ＴＣＥ）、ジクロロエチレン（ｄｉｃｈｌ
ｏｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅ：ＤＣＥ）のアイソマー類（ｃ
ｉｓ−１，２−ＤＣＥ、ｔｒａｎｓ−１，２−ＤＣＥ、
１，１−ＤＣＥ）及び塩化ビニルの様なクロロエチレン
類や他の塩素化脂肪族化合物は、産業上使用する事に伴
い、環境中にかなりの濃度で発生する。ＰＣＥやＴＣＥ
は優れた溶剤であるために、特にドライクリーニングや
織物産業において、機械を洗浄したり、脂肪を抽出した
り、塗料を剥がしたりする目的に使用される。これらの
化学物質は公衆衛生に重大な問題を引き起し、汚染され
た場所や水路を改善する事は地球レベルにおける緊急の
問題である。この汚染を改善することは、物理化学研究
と生物学研究を刺激している。生物学的な方法は、比較
的コストが安くて環境適合性が良いために、しばしば魅
力的な選択となり得る。 【０００３】ＰＣＥは、ハロゲン含量が高くて毒性が強
いために、塩素化した脂肪族化合物の生物分解の研究対
象として、重要なモデルとなる。ＰＣＥは酸化され易い
性質を有しているために好気的条件下では分解されにく
いが、嫌気的な条件下ではいくつかの微生物によって還
元的に脱塩素化される。そこで、ＰＣＥを除染するため
に、嫌気的な生物学的システムに関心が向けられてい
る。嫌気的な混合培養物が、ＰＣＥを還元的に脱塩素化
する効果を有することが、しばしば報告されてきた。し
かし、脱ハロゲン化の特性が詳細に解析された単一培養
物はほんの少数であり、その例としてＤｅｈａｌｏｓｐ
ｉｒｉｌｌｕｍ ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｄｅｓｕｆ
ｏｍｏｎｉｌｅ ｔｉｅｄｊｅｉ、Ｄｅｈａｌｏｂａｃ
ｔｅｒ ｒｅｓｔｒｉｃｔｕｓ、Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃ
ｏｉｄｅｓ ｅｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓ株１９５、Ｄｅｓ
ｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＰＣＥ−Ｓがある。 【０００４】シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）は、
ＰＣＥの非生物的な脱塩素化に有効であると、報告され
てきた。Ｄ．ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｄ．ｅｔｈｅｎ
ｏｇｅｎｅｓ株１９５、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ種ＰＣＥ−Ｓの様なＰＣＥ分解性嫌気性微生物
は、コリノイド（蛋白質が結合したシアノコバラミン）
補因子を含んでいることが示されており、それらはＰＣ
Ｅの異化に重要な役割を果たす可能性がある。 【０００５】嫌気的なＰＣＥデハロゲナーゼの精製と特
性解析に注目した研究は少ないが、嫌気的な還元的ＰＣ
Ｅデハロゲナーゼの遺伝子に関しての情報は僅かにあ
る。近年、Ｄ．ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓのＰＣＥデハロ
ゲナーゼの遺伝的な決定因子であるｐｃｅＡとｐｃｅＢ
がクローン化され、特性解析された。これら、ｐｃｅＡ
とｐｃｅＢの２つの遺伝子は、オペロン構造中に構成さ
れ、それぞれ５０１アミノ酸と７４アミノ酸の蛋白質を
コードしている。しかし、ｐｃｅＡを機能を有して大腸
菌中に発現させることは成功しなかった。 【０００６】多くの嫌気的なデハロゲナーゼは、ＰＣＥ
を分解して主としてｃｉｓ−ＤＣＥを生成するが、Ｄ．
ｅｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓ１９５由来の新規なデハロゲナ
ーゼは、還元的にＰＣＥを脱塩素化してエチレンを生成
して、毒性を分解する（図１）。Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓとＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａ
ｓ ｅｕｒｏｐａｅａによる、ｃｉｓ−ＤＣＥの好気的
な分解が報告されてきた。そこで、嫌気的なシステムで
蓄積したｃｉｓ−ＤＣＥを、その様な好気的なデハロゲ
ナーゼを用いて更に分解する事により、除くことができ
る。これらの菌株に由来する嫌気的なデハロゲナーゼを
用いた反応は、ＤＣＥで停止してしまう。よって、ＤＣ
Ｅ以降の分解は、好気性微生物に頼らなければならず、
ＴＣＥの完全分解には嫌気的微生物と好気的微生物の両
者が必要である。 【０００７】ところで、Ｄ．ｅｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓ１
９５株由来の新規なデハロゲナーゼは、還元的にＰＣＥ
を脱塩素化してエチレンを生成する事が知られている
（図１）。即ち、この菌株はＰＣＥを完全分解して、毒
性を分解するという特質を有する。この様に種々のデハ
ロゲナーゼが存在しており、それぞれによって利用する
基質や酵素としての特性は異なっている。塩素化脂肪族
化合物で汚染される状況を考えると、多くの場合ＰＣ
Ｅ、ＴＣＥやＤＣＥ異性体の混合物が存在している。よ
って、基質とする塩素化脂肪族化合物のスペクトル範囲
が広いデハロゲナーゼが得られたら、塩素化脂肪族化合
物による汚染に対する有効なツールとなると思われる。 【０００８】 【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、環境
中に存在する有害な塩素化脂肪族化合物を分解して解毒
することが可能な、新規な嫌気性の還元的ＰＣＥデハロ
ゲナーゼを得ることである。より特異的には、これまで
の嫌気性菌株由来のデハロゲナーゼでは分解が困難であ
ったＤＣＥを含めて、広い範囲の塩素化脂肪族化合物を
分解できるＰＣＥデハロゲナーゼを得ることである。更
に本発明の課題は、得られた酵素のアミノ酸配列とそれ
をコードする遺伝子の塩基配列を提供する事である。 【０００９】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、水路の汚
泥より単離されたクロストリジウム・ビフェルメンタン
スＤＰＨ−１（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｉｆｅｒｍ
ｅｎｔａｎｓ）ＤＰＨ−１がＰＣＥを脱ハロゲン化する
ことを見出し、当該菌株から新規なＰＣＥデハロゲナー
ゼを得る事を試みた。即ち、クロストリジウム・ビフェ
ルメンタンスＤＰＨ−１ＤＰＨ−１由来のデハロゲナー
ゼを単離精製し、その特性解析を行った。この酵素は基
質として、ＰＣＥとＴＣＥのみならず、ｃｉｓ−１，２
−ＤＣＥ、１，１−ＤＣＥを含む、広範囲の塩素化脂肪
族化合物を分解した。これまで、これほど広範囲の塩素
化された脂肪族化合物を基質として分解する、嫌気性の
還元的ＰＣＥデハロゲナーゼが得られた例はない。 【００１０】更に精製した酵素のアミノ末端のアミノ酸
配列を決定し、その配列より遺伝子クローニングのため
のプローブを構築した。ゲノミックＤＮＡライブラリー
からクローニングを行うことにより、遺伝子配列を決定
し、更に推定アミノ酸配列を決定した。得られた配列は
既知のＰＣＥデハロゲナーゼと相同性を有さず、これま
でにない型のＰＣＥデハロゲナーゼであると考えられ
る。 【００１１】 【発明の実施の形態】本発明は、クロストリジウム・ビ
フェルメンタンスＤＰＨ−１に由来する、新規なパーク
ロロエチレン脱ハロゲン化酵素（ＰＣＥデハロゲナー
ゼ）である。当該酵素は、以下の性質を有する。 （１）テトラクロロエチレンからトリクロロエチレンを
生成する脱ハロゲン化反応を触媒する。 （２）分子量が３５ｋＤａである２つのサブユニットか
ら成る二量体である。 （３）至適温度は３５℃である。 （４）至適ｐＨは７．５である。 （５）金属イオン、ＥＤＴＡ、ＮＡＤＨ又はシアノコバ
ラミンの添加により酵素活性は影響されない。 （６）酸素の存在により酵素活性が抑制される。 【００１２】更に、本発明の酵素により、塩素化脂肪族
化合物を分解する方法もまた、本発明の範囲内である。
上述した様に、本発明の酵素は基質スペクトルの範囲が
広いために、テトラクロロエチレン、トリクロロエチレ
ン、ジクロロエチレン、ｃｉｓ−１，２−ジクロロエタ
ン、１，１−ジクロロエタン、１，２−ジクロロエタ
ン、１，２−ジクロロプロパン、１，１，２−トリクロ
ロエタン等の、種々の塩素化脂肪族化合物を分解する事
が可能である。 【００１３】更に本発明は、クロストリジウム・ビフェ
ルメンタンスＤＰＨ−１由来のＰＣＥデハロゲナーゼの
ポリペプチドである。このポリペプチドは、配列表の配
列番号１の下段に示す、アミノ酸番号１−３６６で示さ
れるアミノ酸配列により特定される。このアミノ酸配列
は、配列表の配列番号１の上段に記載されている塩基配
列の、オープンリーディングフレーム（読み枠）部分に
よりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号１の下段に示すポリペプチドの一部が欠失、置
換若しくは付加されたポリペプチドとは、配列番号１の
下段に示すアミノ酸配列において、２０個以下、好まし
くは１０個以下、更に好ましくは５個以下のアミノ酸が
置換されたポリペプチドである。また、その様なポリペ
プチドと配列番号１の下段に示すアミノ酸配列とは、７
０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０
％以上の相同性を有する。その様なポリペプチドも、テ
トラクロロエチレンの脱塩素反応を触媒するというＰＣ
Ｅデハロゲナーゼの特徴を有する限り、本発明の範囲内
である。 【００１４】更に本発明は、配列表の配列番号１の上段
に示す、塩基番号１−２１１７で示される塩基配列から
なることを特徴とする、クロストリジウム・ビフェルメ
ンタンスＤＰＨ−１ＤＰＨ−１由来のＰＣＥデハロゲナ
ーゼ遺伝子である。配列表の配列番号１の上段に示す塩
基配列のうち塩基番号５１４−１６１４で示される部分
が読み枠であり、上述したＰＣＥデハロゲナーゼのポリ
ペプチドをコードしている。 【００１５】遺伝子組み換え技術によれば、基本となる
ＤＮＡの特定の部位に、当該ＤＮＡの基本的な特性を変
化させることなく、あるいはその特性を改善する様に、
人為的に変異を起こすことができる。本発明により提供
される天然の塩基配列を有する遺伝子、あるいは天然の
ものとは異なる塩基配列を有する遺伝子に関しても、同
様に人為的に挿入、欠失、置換を行う事により、天然の
遺伝子と同等のあるいは改善された特性を有するものと
することが可能であり、本発明はそのような変異遺伝子
を含むものである。即ち、配列表の配列番号１の上段に
示す遺伝子の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝
子とは、配列番号１の上段に示す塩基配列において、２
０個以下、好ましくは１０個以下、更に好ましくは５個
以下の塩基が置換された遺伝子である。また、その様な
遺伝子と配列番号１の下段に示す塩基配列とは、７０％
以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以
上の相同性を有する。その様な遺伝子も、テトラクロロ
エチレンの脱塩素反応を触媒するというＰＣＥデハロゲ
ナーゼの特徴を有するポリペプチドをコードしている限
り、本発明の範囲内である。 【００１６】 【実施例】（微生物と培養条件）クロストリジウム・ビ
フェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｉｆｅ
ｒｍｅｎｔａｎｓ）ＤＰＨ−１は、岐阜の電気会社の、
屑が混ざった水路の汚泥より単離した。ＭＹ培地上で、
一週間毎に継代培養することにより、培養を維持した。
そのＭＹ培地の組成は、Ｋ₂ ＨＰＯ₄ が７．０ｇ／ｌ、
ＫＨ₂ ＰＯ₄ が２．０ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏが
０．１ｇ／ｌ、（ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ が１．０ｇ／ｌ、ク
エン酸ナトリウムが０．５ｇ／ｌ、酵母抽出液が２．０
ｇ／ｌであり、ｐＨが７．２であった。２６ｍｌの血清
ボトル中で１０ｍｌの培地をオートクレーブした後に、
０．１ｍｌのフィルター滅菌したビタミン溶液（１リッ
トルあたり、ｐ−アミノ安息香酸が１ｇ、ビオチンが１
ｍｇ）と０．１ｍｌのＦｅＳＯ₄ ７Ｈ₂ Ｏ（２ｇ／ｌ）
を添加した。ヘッドスペースを純粋窒素で置き換え、テ
フロン（登録商標）で裏打ちしたゴムセプタムとアルミ
ニウムのクリンプキャップで密封した。その後ＰＣＥを
添加して、最終濃度を１２μＭとした。酵素を調製する
ために、１００ｍｌのＭＹ培地を含むボトル中で、ＰＣ
Ｅのピークが分解するまで（４６から５６時間）３０℃
で細胞を生育した。Ｃ．ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ細胞
を、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を最終濃度が２ｍＭ
になるまで添加した後、遠心（１２０００ｇ、１５分）
により回収した。クローニングと形質転換に用いた宿主
株は、大腸菌ＤＨ５αであり、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａ
ｎｉ培地中において３７℃で培養を行った。必要に応じ
て、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した。プ
ラスミド類と、その関連した特性を表１に要約する。 【００１７】 【表１】 【００１８】（酵素の調製）Ｃ．ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａ
ｎｓ細胞（およそ１．６ｇ）を、２ｍＭのＤＴＴと５％
のグリセロールを添加した２０ｍＭのトリス塩酸バッフ
ァー（ｐＨ８．２）６ｍｌ中に再懸濁し、ＴＯＭＹウル
トラソニック破砕機ＵＤ−２０１を用いて、３０秒間の
フラッシュで５分間、氷冷バス中で溶菌した。非破砕細
胞と破片を遠心分離（１７０００ｘｇ、２０分、４℃）
で分離し、非破砕細胞と破片について抽出過程を繰り返
した。２つの上清画分を混合し、０．２２μｍのミリポ
アフィルターを通した。得られた濾液を、無細胞酵素抽
出に用いた。 【００１９】（酵素アッセイ）デハロゲナーゼのアッセ
イは、Ｎｅｕｍａｎの方法（Ｎｅｕｍａｎ，Ａ．ｅｔａ
ｌ．（１９９６）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１６５
１５−１６５１９）とＭａｇｎｕｓｏｎ（Ｍａｇｎｕｓ
ｏｎ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ａｐｐｌ．Ｅ
ｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：１２７０−
１２７５）の方法を用いた。酵素アッセイ（この後、標
準アッセイ方法と言う）を、テフロンのゴムストッパー
とアルミニウムのクリンプキャップで密封した、血清ボ
トル中で行った。４ｍｌのアッセイ溶液には、１００ｍ
Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１．５ｍＭのメ
チルビオロゲン、１．５ｍＭのクエン酸チタニウム、５
００μｌの酵素と１２μＭのＰＣＥが含まれていた。コ
ントロールのアッセイ溶液では、酵素溶液をトリス塩酸
バッファーに置きかえた。全ての溶液のヘッドスペース
を、５分間窒素で置き換えた。３０℃で３０分間、イン
キュベーションを行った。５ＭのＭｇＳＯ₄ を０．４ｍ
ｌ添加して反応を停止した。クエン酸チタニウム溶液
を、ＺｅｈｎｄｅｒとＷｕｈｒｍａｎｎの方法（Ｚｅｈ
ｎｄｅｒ，Ａ．Ｊ．Ｂ ａｎｄ Ｗｕｈｒｍａｎｎ
Ｋ．（１９７６）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９４：１１６５−
１１６６）により調製した。反応生成物と残存したＰＣ
Ｅを、ガスクロマトグラフィーにより定量した。酵素活
性の１ユニットを、そのアッセイ条件下で生成したトリ
クロロエチレン（ＴＣＥ）とｃｉｓ−ジクロロエチレン
（ＤＣＥ）の全ｎｍｏｌである、と定義した。比活性を
計算するために、バイオラッドのプロテインアッセイ試
薬（バイオラッド）を用いて、標準的なＢｒａｄｆｏｒ
ｄ法により、蛋白質濃度を定量した。 【００２０】（塩素化した脂肪族化合物のガスクロマト
グラフィー解析）塩素化した脂肪族化合物を、ヘッドス
ペース法（Ｇｏｓｓｅｔｔ Ｊ．Ｍ．（１９８７）Ｅｎ
ｖｉｒｏｎ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．２１：２０２−
２０８）で定量した。ヘッドスペースサンプル（１０μ
ｌ）を、電子捕獲検出器（ＥＣＤ）とガラスカラム（シ
リコンＤＣ−５５０ ２０％クロモゾーブＷ［ＡＷＤＭ
ＣＳ］８０／１００）を備えた、ＧＣ−１４Ｂ型ガスク
ロマトグラフ（シマズ）を用いて解析した。担体ガスに
は、流速５０ｍｌ／分の純粋窒素を用いた。炎イオン化
検出器（ＦＩＤ）とガラスカラム（シリコンＤＣ−５５
０ ２０％クロモゾーブＷ［ＡＷＤＭＣＳ］８０／１０
０）を備えた、ＧＣ−９Ａ型ガスクロマトグラフ（シマ
ズ）を用いて、高濃度のパークロロエチレン（ＰＣＥ）
のクロマトグラフィー解析を行った。 【００２１】（酵素の精製）無細胞酵素抽出液を、限外
濾過膜セントリプレップＹＭ−５０（アミコン：５０ｋ
Ｄａの限界分子量）を通して、およそ１．５ｍｌまで濃
縮した。濃縮物をＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌアニオ
ン交換カラム（１２ｘ１．５ｃｍ）にかけた。予め２ｍ
ＭのＤＴＴを添加した２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．２）で、そのカラムを平衡化しておいた。同じ緩
衝液に、０から０．５ＭのＮａＣｌを溶解したリニアー
グラジエントを用いて、１ｍｌ／分の流速で蛋白質を溶
出した。４５の画分を５ｍｌづつ、４℃で収集してハロ
ゲナーゼ活性を評価した。 【００２２】活性画分を貯蔵し、下記に述べるサイズ排
除クロマトグラフィーにかけた。貯蔵した画分を、ＹＭ
−５０超濾過膜を用いて約１．５ｍｌまで濃縮した。予
め溶出緩衝液（２０ｍＭのリン酸カリウムバッファー
（ｐＨ７．５）に溶解した１５０ｍＭのＫＣｌ）で平衡
化しておいたＳｕｐｅｒｄｅｘ ｐｇ−７５カラム（７
０ｘ１．５ｃｍ）に、濃縮物をかけた。０．３６ｍｌ／
分の流速で、同じ緩衝液により蛋白質を溶出した。画分
（２．７ｍｌ）を４℃で収集し、デハロゲナーゼアッセ
イにかけた。 【００２３】シマズＳＰＤ−７ＡＶ紫外／可視分光検出
器、シマズＳＣＬ−６Ｂシステムコントローラー、シマ
ズＣＲ４Ａコンピューターデータ解析機と１ｍｌのイン
ジェクションループを備えた、シマズＬＣ−７Ａバイオ
液体クロマトグラフを用いて、多孔性ＨＱアニオン交換
カラム（４．６ｘ１００ｍｍ）上で、イオン交換高速液
体クロマトグラフィー（ＩＥＸ−ＨＰＬＣ）により、更
なる精製を行った。２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）を用いた、アイソクラティック（１０分）な
溶出（１ｍｌ／分）をまず行った。その後に、２０ｍＭ
のトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）に、０−１ＭのＮ
ａＣｌを添加した濃度リニアーグラジエント（２０分）
により溶出を行った。２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８．２）に添加した１ＭのＮａＣｌ（１０分）と、２０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．２）（１０分）で、順
次にカラムを洗浄した。 【００２４】５００ｍｌのインジェクションループを備
えた同じＨＰＬＣシステムを用いて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ
^R ２００ＨＲ１０／３０（１ｘ３０ｃｍ）により、サイ
ズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）
を行った。２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）に１５０ｍＭのＮａＣｌを添加して、０．５ｍｌ／
分の流速でアイソクラティックな溶出を行った。 【００２５】（分子量の測定）天然型酵素の分子量は、
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲ１０／３０上におけるＳＥ
−ＨＰＬＣにより測定した。分子量キット（ＭＷ−ＧＦ
−２００−ＫＩＴ：シグマ）を用いて、製造業者が指示
した方法によりカラムを校正した。蛋白質サンプルの純
度と分子量は、１０％のアクリルアミドを用いて、ドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＰＡＧＥ）により試験した。１７２０１から
２０００００ダルトンの範囲の分子量マーカー（第一化
学）を用いた。ゲルをクマシーブリリアントブルーＧ２
５０により染色した。 【００２６】（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ解析）Ｍａｔ
ｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｚｅｒ Ｄｅｓｏｒｐ
ｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆ
ｌｉｇｈｔ／Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（Ｍ
ＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ）を用いて、精製された蛋白質
の正確な分子量を測定した。限界分子量１０ｋＤａであ
るポリスルフォン膜（ミリポア）を用いた限外濾過によ
り、精製された蛋白質サンプルを脱塩し、滅菌したミリ
Ｑ水（滅菌脱イオン水、ミリポア）に懸濁した。簡単に
いうと、そのマトリックスはミリＱ水に溶解した０．１
％のトリフルオロ酢酸と３０％のアセトニトリルから構
成され、シナピン酸で飽和されている（１％）。正確に
１μｌのマトリックスと１μｌの蛋白質サンプルをサン
プルプレート上で混合し、５分間風乾し、ボイジャーＲ
Ｐワークステーション（パースペクティブバイオシステ
ムズ、アプライドバイオシステム）を用いて、製造業者
に指示に従い解析した。 【００２７】（酵素の性質の測定）標準的なアッセイ方
法を用いて、アッセイを行った。２０、２５、３０、３
５、４０と４５℃でインキュベートすることにより、温
度活性のプロファイルを測定した。それぞれの温度で１
時間インキュベートして、その後に残った活性を測定す
る事により、温度安定性を検討した。ｐＨ活性プロファ
イルについては、トリス−塩酸（ｐＨ７．５、８．０、
８．５、９．０）およびリン酸緩衝液（ｐＨ６．０、
６．５、７．０）のいずれかを用いることにより検討し
た。酵素をそれぞれのｐＨ値で１時間、室温で同じ緩衝
液を用いてインキュベートして、残った活性を測定する
ことにより、ｐＨ安定性を検討した。金属イオン（Ｃｏ
²⁺、Ｆｅ ³⁺、Ｍｇ²⁺、Ｎａ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｈｇ²⁺）、ＥＤ
ＴＡ−Ｎａ、ＮＡＤＨとシアノコバラミンの影響は、最
終濃度５ｍＭにおいて検討した。基質濃度の影響は、異
なった濃度のＰＣＥ（５−３０μＭ）を用いて測定し
た。酸素感受性の測定は、Ｍｉｌｌｅｒらの方法（Ｍｉ
ｌｌｅｒ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ａｒｃｈ．Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６９：４９７−５０２）を用い
た。 【００２８】（ＰＣＥと他の塩素化した脂肪族化合物の
比較分解性）標準アッセイプロトコールを用いた。全て
の塩素化脂肪族化合物のストック溶液をメタノール溶液
として調製し、アッセイ混合液中でのそれらの最終濃度
は１２μＭであった。３０℃で３０分間インキュベート
した後、塩素化した脂肪族化合物の残存量を、ガスクロ
マトグラフィーで測定した。 【００２９】（ＰＣＥ分解と生成物産生の経時変化）Ｐ
ＣＥの開始濃度を１２μＭとして、標準アッセイ方法に
より検討した。ＰＣＥの生物的分解と分解生成物（ＴＣ
Ｅとｃｉｓ−ＤＣＥ）を、ガスクロマトグラフィーで連
続的に検出した。 【００３０】（アミノ末端配列決定）蛋白質サンプルの
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、蛋白質をポリビニリデン
ジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（イモビロンＰ^SQ、ミリ
ポア）へ、電気ブロッティング装置（バイオラッド）を
用いて電気的に転写した。ＰＲＯＣＩＳＥ^TM１．１ａデ
ータ解析ソフトウェアを備えた、アプライドバイオシス
テムズ４９１プロテインシークエンサーを用いて、自動
エドマン分解によりアミノ末端配列を解析した。 【００３１】（組み換えＤＮＡ技術）Ｃ．ｂｉｆｅｒｍ
ｅｎｔａｎｓを一晩培養した物から、ゲノミックＤＮＡ
を調製した。ハイピュアプラスミドアイソレーションキ
ット（ベーリンガーマンハイム）を用いて、製造業者の
指示に従って、プラスミドＤＮＡを細胞から単離した。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成物と制限酵素分解
断片を、ＱＩＡＥＸＩＩゲル抽出キット（キアゲン）に
より、アガロースゲルから精製した。ＤＮＡライゲーシ
ョンキットｖｅｒ．２（タカラ）を用いて、製造業者の
指示に従ってライゲーションを行った。プラスミドＤＮ
Ａによる大腸菌ＤＨ５αの形質転換を、製造業者の指示
に従って標準方法により行った。１００μｇ／ｍｌのア
ンピシリンと５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル
−β−Ｄ−ガラクトピラノース（Ｘ−Ｇａｌ）を含むプ
レート上での生育により、コロニーの選抜とスクリーニ
ングを行った。制限酵素はタカラから購入し、製造業者
に推奨された方法で使用した。 【００３２】（ＤＮＡ配列決定）ＤＮＡの配列決定は、
ＡＢＩプリズムビッグダイターミネーターキット（パー
キンエルマー）とアプライドバイオシステムＡＢＩ３１
０ジェネティックアナライザーを用いて、サイクルシー
クエンシングにより行った。両鎖の配列決定された領域
を、プライマーウォーキングにより伸長した。 【００３３】（遺伝子クローニングのためのプローブの
構築）デハロゲナーゼのアミノ末端配列に基づき、２つ
のプライマーを設計し、コードされる遺伝子の、先に決
定されたアミノ末端領域のＰＣＲ増幅に用いた。用いた
プライマーは、5'-GCI-GAR-GTI-TAY-AAY-AAR-GA-3'と3'
-GTR-ATR-AAR-ISI-TTR-CTR-TG-5'である（I はイノシン
R はアデニン又はグアニン、Y はシトシン又はチミン、
S はグアニン又はチミン）。Ｒｅａｄｙ．Ｔｏ．ＧｏＰ
ＣＲビーズ（アマシャムファルマシアバイオテック）を
用いて、ＰＣＲを行った。およそ１００ｎｇのＣ．ｂｉ
ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓゲノミックＤＮＡを、鋳型として
用いた。ＤＮＡ増幅は、以下の様にして３５ＰＣＲサイ
クル行われた。即ち、最初の変性（９５℃、５分）、引
き続いての変性（９５℃、１分）、アニーリング（４３
℃、１．５分）、そして伸長（７２℃、２分）というサ
イクルである。１．５％アガロースゲル上で可視化した
後、予期したバンド（８１ｂｐ）を精製し、ｐＴ７Ｂｌ
ｕｅ（ノバゲン）のＴ−クローニング部位へクローン化
し、ｐＡＴＳ８１プラスミドを作製した。挿入物をＤＮ
Ａ配列解析にかけて、その配列を翻訳し、精製蛋白質の
既知のアミノ末端と比較した。 【００３４】（サザンハイブリダイゼーションとＤＮＡ
ラベル化）ゲノミックＤＮＡを、ＢｇｌＩＩ、Ｃｌａ
Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩにより分解
した。ＤＮＡ断片をアガロースゲル上で分離し、ゼータ
プローブナイロン膜（バイオラッド）上に、０．４Ｎの
ＮａＯＨを用いた毛細管ブロッティングにより転写し
た。アガロースゲルより精製したプローブ（ＰＣＲ産
物）を、マルチプライムＤＮＡラベリングシステム（ア
マシャムファルマシアバイオテック）を用いて、α−Ｐ
³²ｄＡＴＰによりラベル化した。ブロットしたフィルタ
ーをプレハイブリダイズして、５５℃でハイブリダイズ
し、その後に洗浄して展開した。 【００３５】（関連断片のクローニング）サザンハイブ
リダイゼーションにより得られた、およそ５ｋｂのＣｂ
ａＩバンドを、ミニＤＮＡライブラリーを調製する目的
で選抜した。この領域中の断片をアガロースゲルから精
製し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）のポリリンカ
ー中の同様の部位へライゲーションした。ライゲーショ
ン反応液により、コンピーテントな大腸菌ＤＨ５αを形
質転換した。全部で１７２８個の形質転換体を、上記に
プローブを用いて、コロニーハイブリダイゼーションに
よりスクリーニングした。およそ５ｋｂのＣｂａＩ断片
を含む陽性クローンが同定された。ｐＤＥＨＡＬ５プラ
スミドが、このクローンから単離された。 【００３６】デハロゲナーゼ遺伝子の位置を決定するた
めに、ｐＤＥＨＡＬ５をＸｈｏＩとＢｇｌＩＩで分解し
た。およそ１．５ｋｂのＸｈｏＩ−ＢｇｌＩＩ断片とお
よそ１ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片を単離し、ｐ
ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）のポリリンカー中の、
ＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩとＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ適合部
位上にサブクローン化し、ｐＤＥＨＡＦ１プラスミドと
ｐＤＥＨＡＦ２プラスミドを作製した。両プラスミドの
挿入物を、完全に配列決定した。データベース検索は、
ＢＬＡＳＴにより行った。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラ
ムを用いて、相同性解析を行った。ＤＮＡスティーダー
プログラムを用いて、カイトドーライト法により、ハイ
ドロパシープロットを行った。 【００３７】（ヌクレオチド配列アクセッション番号）
デハロゲナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列とそのフラン
キング領域を、ＥＭＢＬヌクレオチド配列データベース
に、ＡＪ２７７５２８のアクセッション番号で登録し
た。 【００３８】（ＰＣＥデハロゲナーゼの抽出と精製）Ｄ
ＴＴとグリセロールを含むトリス塩酸緩衝液中で細胞を
超音波破砕することにより、この酵素を容易に抽出でき
る。抽出緩衝液に０．１％トライトン−Ｘを添加して
も、酵素の抽出は改善されなかった。残った細胞破片
を、０．１％のトライトンＸ−１００を含む同じ緩衝液
又は抽出緩衝液に懸濁しても、ＰＣＥ分解活性を示さな
かった。これは、その酵素が膜貫通蛋白質ではなく、膜
表層の蛋白質であることを示している。 【００３９】Ｃ．ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓＤＨＰ−１
の還元的ＰＣＥデハロゲナーゼは、クルードな細胞抽出
液より、ＴＣＥを経由してＰＣＥからｃｉｓ−ＤＣＥへ
変換することを検出することにより、精製された。出発
の精製スキームは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ｐｇ−７５ゲル
濾過の後に、ＰＣＥデハロゲナーゼが１３．２倍精製さ
れるという結果となり（表２）、酵素活性はおよそ４２
％回収された。比活性は、６．５から８６．１Ｕ／ｍｇ
蛋白質へ増加した。この段階では、酵素サンプルは明ら
かな不純物を２つ含んでいた（図２Ａ：Ｓｕｐｅｒｄｅ
ｘ ｐｇ−７５ゲル濾過後のＳＤＳ−ＰＡＧＥの写
真）。プールして透析したサンプルから、イオン交換Ｈ
ＰＬＣとサイズ排除ＨＰＬＣにより、酵素を更に完全に
精製した（図２Ｂ：分子排除クロマトグラフィー後のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥの写真）。しかしながら、ＨＰＬＣの精
製条件下では不安定であるために、これにより比活性の
顕著な低下が生じた。 【００４０】 【表２】 【００４１】（分子量）天然型ＰＣＥデハロゲナーゼの
分子量を、分子サイズ排除高速液体クロマトグラフィー
により測定すると、およそ７０ｋＤａであった（図
３）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、モノマーの分子量
はおよそ３５ｋＤａであることが判り（図２Ｂ）、その
結果より、二量体蛋白質構造を有していることが示され
る。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳより決定されたモノマー
の正確な分子量は、３５．７ｋＤａであった（図４）。 【００４２】（酵素活性の性質及び反応速度論的パラメ
ーター）デハロゲナーゼはＰＣＥの脱塩素化を触媒する
至適温度は３５℃であった。２０から３５℃の温度範囲
内で、酵素は安定であった。最大活性はｐＨ７．５で記
録され、ｐＨ７．５から８．０で酵素は最も安定であっ
た。酵素活性は、金属イオンに依存せず、ＥＤＴＡ−Ｎ
ａ、ＮＡＤＨやシアノコバラミンを添加することは、Ｐ
ＣＥの分解に大きな影響を及ぼさなかった。空気の存在
下でインキュベーションしている間、酵素は酸素感受性
を有していた。アルキル化試薬（プロピルイオダイド）
と還元試薬（クエン酸チタニウム）の混合液と、暗所で
インキュベーションにより、酵素活性は抑制された。引
き続いて光に露光することにより、活性は回復した。プ
ロピルイオダイドが存在しない場合にはクエン酸チタニ
ウムは阻害活性を有しておらず、プロピルイオダイドを
単独で添加した場合には阻害活性は全く記録されなかっ
た。 【００４３】ＰＣＥの脱塩素化と産物生成の反応速度論
を、経時変化の実験で検討した。デハロゲナーゼによ
り、ＴＣＥを経由して、ＰＣＥはＤＣＥへと迅速に変化
した。反応速度論のパラメーターであるＶｍａｘとＫｍ
を、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ二重逆数プロット
からコンピューターで求めたところ、それぞれ７３ｎｍ
ｏｌ／ｍｇ蛋白質と１２μＭであった。 【００４４】（分解された塩素化脂肪族化合物のスペク
トル）ＰＣＥデハロゲナーゼによる他のハロゲン化塩素
化脂肪族化合物の分解を、検討した。Ｃ．ｂｉｆｅｒｍ
ｅｎｔａｎｓのデハロゲナーゼは、種々の塩素化脂肪族
化合物を顕著に分解した。ＰＣＥとＴＣＥにおいて観察
された分解速度は、他の環境上重要な塩素化脂肪族化合
物における分解速度より、全般的に高かった。ＰＣＥ、
ＴＣＥ、ｃｉｓ−１，２−ＤＣＥ、１，１−ＤＣＥ、
１，２−ジクロロエタン、１，２−ジクロロプロパンと
１，１，２−トリクロロエタンによりそれぞれ、一時間
あたりおよそ２５±４．９％、１６±４％、６±１％、
８±０．８％、８±１．６％、９±０．４％、８±０．
２％の分解を達成することができた。ビニルクロライド
は分解を受けにくかった。無細胞系酵素抽出液を用いた
とき、分解速度は顕著に高くなった。 【００４５】（アミノ末端解析、プライマーとプローブ
構築物の設計）精製したＰＣＥデハロゲナーゼのアミノ
末端配列解析により、下記の配列が明らかになった。即
ち、ＡＥＶＹＮＫＤＧＮＫＬＤＬＹＧＫＶＤＧＬＨＹＦ
ＳＮＤＴという配列である。ＢＬＡＳＴ解析を行ったと
ころ、既知のＰＣＥデハロゲナーゼとは相同性を示さな
かった。しかし、配列決定したアミノ末端領域中の３つ
のアミノ酸残基（ＫＶＤ）は、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ種のＰＣＥ−Ｓと同一であった（図
５）。図５に、３種のＰＣＥデハロゲナーゼのアミノ末
端配列のアラインメントを示す。アミノ末端配列の両端
より設計した２つの宿重プライマーにより、Ｃ．ｂｉｆ
ｅｒｍｅｎｔａｎｓのＰＣＥデハロゲナーゼの８１ｂｐ
推定領域を増幅することに成功した。翻訳されたプロー
ブのＤＮＡ配列は、先に決定されたアミノ末端蛋白配列
と一致した。 【００４６】（ＰＣＥデハロゲナーゼのクローニングと
遺伝子配列決定）ＰＣＲの生成物を、ＤＮＡ塩基配列の
決定により確認し、遺伝子クローニングのためのプロー
ブとして使用した。Ｃ．ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓのゲ
ノミックＤＮＡを種々の制限酵素で開裂し、［α−
³²Ｐ］ｄＡＴＰラベル化したプローブを用いて、サザン
ハイブリダイゼーション解析を行ったところ、ＢｇｌＩ
Ｉ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩ
制限酵素断片による異なったバンドが検出された（図
６）。図６（Ａ）に、Ｃ．ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓの
ゲノミックＤＮＡの、制限酵素断片のアガロースゲル電
気泳動の写真を、図６（Ｂ）にサザンブロット／ハイブ
リダイゼーション解析の写真を示す。図６において、
（Ｂ）はＢｇｌＩＩ断片を、（Ｃ）はＣｌａＩ断片を、
（Ｅ）はＥｃｏＲＩ断片を、（Ｈ）はＨｉｎｄＩＩＩ断
片を、（Ｐ）はＰｓｔＩ断片を示す。また、図６の矢印
は、サブライブラリーの構築に用いた５ｋｂのＣｌａＩ
断片を示す。 【００４７】１７２０個の大腸菌ＤＨ５αのコロニー
を、ゲノミックサブライブラリー（およそ４．５から
５．５ｋｂのＣｌａＩ断片により構築されている）から
スクリーニングした後、５ｋｂの、ＣｌａＩ挿入部位を
含んでいると思われるクローン（ｐＤＥＨＡＬ５）が単
離された。サザンハイブリダイゼーションの解析データ
（図６）に基づき、１．４ｋｂ以下のＢｇｌＩＩ制限断
片は、デハロゲナーゼ遺伝子を有していることが予測さ
れる。ｐＤＥＨＡＦ１とｐＤＥＨＡＦ２（表１）の、２
つのサブクローンの挿入物の完全な塩基配列を決定し、
先に決定したアミノ末端配列を用いてその遺伝子を同定
した。その遺伝子は、内在性のＢｇｌＩＩ部位を有して
いることが見出された（図７）。図７に、制限酵素部位
をを示す、ｐＤＥＨＡＬ５の制限酵素地図を示す。ＰＣ
Ｅデハロゲナーゼをコードしている部位を、陰影で示
す。ＡＴＧ開始コドンから、その遺伝子の９７ｂｐがｐ
ＤＥＨＡＦ１中に同定され、１００４ｂｐがｐＤＥＨＡ
Ｆ２中に同定された。 【００４８】ここで得られたＰＣＥデハロゲナーゼ遺伝
子（以下ｐｃｅＣと称する）の完全な核酸配列を、図８
に示す。図８において、転写プロモーター部位を四角で
囲み、リボソーム結合部位を下線で示し、転写終結部位
の反転繰り返しを両方向の矢印で示す。ｐｃｅＣの読み
枠は５１４番の塩基から１６１４までである（終止コド
ンを含めて３６７アミノ酸、成熟蛋白質で３９．６７ｋ
Ｄａ）。ハイドロパシープロットにより、認識可能なシ
グナルペプチドの存在が示され（図９）、また先に決定
されたアミノ末端配列からメチオニンが欠けており、こ
れは翻訳後にプロセッシングを受けることを示してい
る。コード領域は２１アミノ酸のシグナルペプチドから
始まり、先に決定されたアミノ酸配列がそれに続く（図
５）。そこで、プロセスされた蛋白質（３４６アミノ
酸）の分子量を計算すると、およそ３７．４０ｋＤａで
あり、これはマススペクトル解析により決定された分子
量と一致している（図４）。リボソームに結合するであ
ろうと思われる部位（ＡＡＡＧＧＡ）が、ＡＴＧ開始コ
ドンの８塩基上流に見出された。典型的な−１０から−
３５のプロモーター配列が、コード領域の上流に見出さ
れた。ＴＧＡ終止コドンの３９ｂｐ下流に、ρ非依存的
な終結部位を示す反転繰り返しが存在していた（図
８）。 【００４９】ＢＬＡＳＴの検索によると、ｐｃｅＣの塩
基配列及び推定アミノ酸配列は、ｓｅｒｒａｔｉａ ｍ
ａｒｃｅｓｃｅｎｓと大腸菌ポリンの配列と相同性を示
した。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを用いたところ、
ｐｃｅＣの塩基配列は、大腸菌のポリンとｓｅｒｒａｔ
ｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓのポリンの塩基配列と、そ
れぞれ６３．７％と６０％の相同性を示した。推定アミ
ノ酸配列のハイドロパシープロファイルを検討したとこ
ろ（図９：ハイドロパシープロット）、これまで知られ
たリーダーペプチドに典型的なことに、アミノ末端領域
において大きな疎水性領域が示された。 【００５０】毒性の生体異物分子の嫌気性還元脱ハロゲ
ン化は、近年ますます注意をひいている。本発明におい
て、新たに単離されたＣ．ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ菌
株ＤＰＨ１に由来する、ＰＣＥデハロゲナーゼを精製
し、特性解析し、遺伝子配列を解析した。ｐｃｅＣは、
細胞に結合した細胞外酵素（膜表層蛋白質）であると考
えられ、細胞膜に緩く結合しており、水性緩衝液で容易
に抽出される。更に、先に決定されたアミノ末端アミノ
酸配列はアラニンより始まり、ｐｃｅＣの推定アミノ酸
配列には、認識し得るシグナル配列が含まれており、こ
れはプロセスされた膜表層蛋白質である事を示してい
る。 【００５１】Ｃ．ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓデハロゲナ
ーゼの至適温度（３５℃）は、Ｄ．ｍｕｌｔｉｖｏｒａ
ｎｓにおいて報告された温度である４２℃に近い温度で
あり、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種菌株Ｐ
ＣＥ−Ｓにおいて報告された５０℃とは完全に異なって
いる。Ｃ．ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓデハロゲナーゼの
至適ｐＨは、Ｄ．ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓとＤｅｓｕｌ
ｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのＰＣＥ−Ｓの至適ｐＨと
似通っており、それらはｐＨ８．０とｐＨ７．２におい
て最大活性を示す。ＰＣＥデハロゲナーゼ活性は、試験
した金属イオンによって刺激されず、抑制される事も無
かった。良く知られた二価金属イオンのキレーターであ
るＥＤＴＡもまた、効果を奏しなかった。この現象は、
コリノイドデハロゲナーゼの置換基であるコバラミン
（ＣＯ²⁺）が遊離型でないために、ＥＤＴＡによるキレ
ーション受けない事で説明される。この状態において、
ＥＤＴＡの様な二価金属イオンキレーターは、コバルト
を固定化しないであろう。 【００５２】ｐｃｅＣはホモダイマーであり、他の報告
されたデハロゲナーゼと分子サイズが異なっている。Ｄ
ｅｈａｌｏｓｐｉｒｉｌｌｉｕｍ ｍｕｌｔｉｖｏｒａ
ｎｓ、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株Ｙ−
５１、Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｅｔｈｅｎｏ
ｇｅｎｅｓ菌株１９５のＰＣＥデハロゲナーゼは、モノ
マーの蛋白質であり、見かけの分子サイズが５７ｋＤ
ａ、６０ｋＤａ、と５１ｋＤａであると報告されてい
る。しかし、ＰＣＥ−Ｓ株由来のＰＣＥデハロゲナーゼ
はおそらくホモトリマーであり、モノマーと天然型にお
ける見かけの分子量は、およそ６５ｋＤａと２００ｋＤ
ａである。 【００５３】１２μＭというＫｍ値は、Ｄ．ｍｕｌｔｉ
ｖｏｒａｎｓデハロゲナーゼにおいて観察された２００
μＭと比較して低い値であるが、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ＰＣＥ−Ｓのデハロゲナーゼで記録
された１０μＭと類似している。そこで、ＰＣＥの親和
性が高いという点において、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ ＰＣＥ−ＳとＣ．ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａ
ｎｓのデハロゲナーゼは似通っている様であるが、Ｄ．
ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓの精製した酵素のＰＣＥ親和性
は低かった。低い濃度のＰＣＥや、他の塩素化した脂肪
族化合物は、汚染された場所における微生物分解の基質
として分解されにくく、利用することができない。その
ために、低いＫｍ値の微生物デハロゲナーゼは、その様
な場所において非常に重要であると思われる。しかし、
Ｃ．ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓデハロゲナーゼのＶｍａ
ｘ（７３ｎｍｏｌ／ｍｇ蛋白質）は、Ｄ．ｍｕｌｔｉｖ
ｏｒａｎｓとＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ＰＣＥ−Ｓで報告された、２６５０ｎｋａｔ／ｍｇ蛋白
質と２６５０ｎｋａｔ／ｍｇ蛋白質という値と比較し
て、低い値であった。 【００５４】アルキル化試薬（プロピルイオダイド）と
還元試薬（クエン酸チタニウム）の混合物により活性抑
制が引き起こされ、この抑制は光により回復した。この
観察は、この酵素はコリノイド補因子を含んでいるかも
しれない可能性を示唆している。多くの嫌気性生物より
得られるこの様な蛋白質は、同じようにＰＣＥを分解す
る。コリノイド蛋白質によるＰＣＥ脱ハロゲン化につい
て、正確な機構は殆ど知られていないが、過還元された
状態のコリノイド（Ｃｏ⁺ ）は、ハロゲン化した炭化水
素又はプロピルイオダイドの様なアルキル化試薬のアル
キル残基に結合可能であり、脱塩素化又は酵素活性の抑
制を達成する。ＭａｒｓｈとＨｏｌｌｏｗａｙにより、
コバラミン結合蛋白質においてＤＸＨＸＸＧの残基が保
存されていることが報告された（Ｍａｒｓｈ，Ｅ．Ｎ．
Ｇ，ａｎｄ Ｄ．Ｅ．Ｈｏｌｌｏｗａｙ（１９９２）Ｆ
ＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３１０：１６７−１７０）。コバラ
ミン結合部位であろうと思われるアミノ酸残基（ＧＫＤ
ＬＧＶＮＧＳＤ）が、ｐｒｅＣのカルボキシ末端におい
て見出された。この配列は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｔｅｔａｎｏｍｏｒｐｈｕｍとマウスのムターゼのコバ
ラミン結合領域中に見られる、ＧＳＤＣＨＡＶＧＮＫと
ＧＫＤＫＨＤＲＧＡＫという配列と類似していた。そこ
で、３つの蛋白質中で不変である、ＧＸＤＸＸＸＸＧは
コリノイドモチーフであると考えられるが、この推定を
実験で評価する必要がある。 【００５５】ハロゲン−炭素結合の酵素的開裂（脱ハロ
ゲン化）は、微生物による変換及びハロゲン化した脂肪
族化合物の無機化における重要なステップである。脱ハ
ロゲン化により普通は毒性が低下し、ハロゲン化した分
子の感受性が増加して、更に分解される。ＰＣＥとＴＣ
Ｅによる汚染を生物処理の方法として、２つの戦略が提
案されている。それは、還元的脱塩素化による完全な分
解と、好気的システムと嫌気的システムを組み合わせる
事による完全な分解である。後者のシステムにおいて、
ＰＣＥとＴＣＥは嫌気的な還元的脱塩素化によりｃｉｓ
−ＤＣＥに変換され、ひき続いてｃｉｓ−ＤＣＥは好気
的に完全に代謝される。ＰＣＥデハロゲナーゼ（Ｐｃｅ
Ｃ）がＰＣＥを素早く脱塩素化することは、嫌気的な生
物処理および好気的な生物処理から成る２段階処理方法
において、非常に重要である。 【００５６】塩素化された脂肪族化合物基質の混合液
は、汚染された環境中でしばしば見られる。しかし、塩
素化された炭化水素の嫌気的変換は殆ど知られていなか
った。Ｃ．ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓのデハロゲナーゼ
は、多くの塩素化された脂肪族化合物分子において作用
する嫌気的な還元的デハロゲナーゼである、という点で
特異であり、本発明はその様な酵素を初めて特性解析し
たものである。驚くべき事に、ｃｉｓ−ＤＣＥを出発物
質として添加しても分解が行われた。ｃｉｓ−ＤＣＥを
分解した際の生成物が何であるか、また中間生成物であ
るｃｉｓ−ＤＣＥがなぜ分解され難いのか、について解
明されていない。ｃｉｓ−ＤＣＥ分解の、機構と生成物
を理解するために、この観点からの更なる検討が必要で
ある。 【００５７】ＰＣＥデハロゲナーゼ遺伝子（ｐｃｅＣ）
のＤＮＡ配列とフランキング領域の配列を決定した。両
鎖の配列は全体的が一致していたので、正確であった。
シャインダルガノ（ＡＡＡＧＧＡ）推定配列は開始コド
ンから８塩基上流に見られ、それはＡＴＧ開始コドンか
ら７塩基という標準的な間隔と近いものである。構造遺
伝子に加えて、結合したフランキングＤＮＡ配列は、原
核細胞の転写制御領域の典型的な構造であった。即ち、
−１０から−３５のプロモーターコンセンサス配列と、
ｒｈｏに非依存的なターミネターに類似した配列を有し
ていた（図８）。推定アミノ末端配列の特徴は、良く知
られたリーダーペプチド配列と一致していた。プロセス
された蛋白質におけるアミノ末端領域中の３つのアミノ
酸残基（ＫＶＤ）は、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ種のＰＣＥ−Ｓと一致しており、その中でリジン
（Ｋ）は３つのデハロゲナーゼにおいて共通している
（図５）。しかし、この相同性の重要性とは明らかでな
く、３つの細菌が脱ハロゲン化する能力との関係もまた
明らかではない。 【００５８】ＢＬＡＳＴの検索において、ｐｃｅＣと他
のＰＣＥデハロゲナーゼ遺伝子の間において、明確な配
列の相同性は見られなかった。同じように、ｐｃｅＡは
いかなる既知のデハロゲナーゼとも、相同性を示さなか
った。そこで、嫌気的なＰＣＥデハロゲナーゼは異なっ
た祖先の遺伝子から、生体異物汚染と環境条件の変化に
反応して進化した可能性がある。驚くべき事に、塩基配
列及びコードされた蛋白質の推定アミノ酸配列は、ポリ
ンと明らかな相同性を示した。これらの遺伝子の間の進
化における関係は、この段階では明らかでなく、更に検
討する必要がある。しかし、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓとＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの様な、いくつかのグラ
ム陽性細菌より得た抽出液は、チャネル形成蛋白質（ポ
リン）を含んでいることが示された。 【００５９】本発明者らは、新規なＰＣＥデハロゲナー
ゼを精製してクローン化し、そのＰＣＥデハロゲナーゼ
は広範囲のスペクトルの塩素化脂肪族化合物を分解する
ことができた。Ｃ．ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓのデハロ
ゲナーゼは、過去に報告された嫌気的ＰＣＥデハロゲナ
ーゼの間では特異であり、ｐｃｅＣの分子データは、微
生物で分解されるデハロゲナーゼの新たなグループが存
在するかもしれない可能性を示している。得られた結果
は、Ｃ．ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓのデハロゲナーゼ
は、ハロゲン化された物質の混合液で汚染された場所に
おいて、ＰＣＥと他の塩素化された脂肪族化合物の、最
初の分解に何らかの重要な役割を果たしているかもしれ
ない可能性を示している（図１）。 【００６０】 【発明の効果】本発明により、クロストリジウム・ビフ
ェルメンタンスＤＰＨ−１由来のパークロロエチレン脱
ハロゲン化酵素、及び当該酵素のアミノ酸配列と遺伝子
塩基配列が与えられた。当該酵素は、広範囲のスペクト
ルの塩素化された脂肪族化合物を基質として分解すると
いう特徴を有する。 【００６１】 【配列表】 ＜１１０＞出願人氏名：岐阜大学長 ＜１２０＞発明の名称：クロストリジウム・ビフェルメンタンスＤＰＨ−１由来 パークロロエチレン脱ハロゲン化酵素、当該酵素のポリペプチド、当該酵素をコ ードする遺伝子 ＜１６０＞配列の数：１ ＜２１０＞配列番号：１ ＜２１１＞配列の長さ：核酸２１１７、アミノ酸３６６ ＜２１２＞配列の型：核酸、アミノ酸 ＜２１３＞起源：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓＤＰＨ− １ ＜４００＞配列 cctccaaaca tttttaacgt acaggctttc gtgctaaatg caacaagcca aagtcagaag 60 tttggaaaga cgcaccatcg ttttgcaaaa cggtacgact ttccatgcag ttgctgaaaa 120 agcggaaaaa gagcggtacc gagtaatgcg ttatctcagt attaacctgg aacccaaaaa 180 aaagcccgaa cgggttgttc gggcttgtca atttattcgc tggctaatta ataatagcta 240 tcaatacgtc aacgaaaaat aaacgtgaca ataaaggcat ataacacgcg cagaatagcc 300 cgaacacact tcacttgtat aatttttatt ttatatattt accattccat acattcacca 360 caattatcat catttccgta gaattattcc tttaaggttt tacttaaggc gtaacaattc 420 atatttatcc ctttacggaa cttctccttt agcatgcttt tactccctac atgggtagtc 480 acaggttaat aaaaaaacta aaggattatt tca 513 ATG AAC AGA AAA GTA CTG GCT CTC GTA ATT CCT GCC CTG CTG GCT GCA 561 M N R K V L A L V I P A L L A A 16 GGC GCT GCT CAC GCG GCT GAA GTT TAT AAT AAA GAC GGC AAC AAA TTA 609 G A A H A A E V Y N K D G N K L 32 GAT CTC TAT GGC AAA GTA GAC GGC CTG CAT TAT TTC TCT GAT GAC GCT 657 D L Y G K V D G L H Y F S D D A 48 AAC AGT GAT GGC GAT CAG ACT TAT ATG CGT ATG GGC TTC AAA GGC GAA 705 N S D G D Q T Y M R M G F K G E 64 ACT CAG GTT AAC GAT ATG ATC ACC GGT TAC GGC CAG TGG GAA TAT CAG 753 T Q V N D M I T G Y G Q W E Y Q 80 GTT CAG GCT AAC GGC ACC GAA GGT GAT AAA GGC GAC TCC TGG ACT CGT 801 V Q A N G T E G D K G D S W T R 96 CTG GCA TTC GCA GGT ATT AAA GTC GGC GAC TAC GGC TCA TTC GAC TAC 849 L A F A G I K V G D Y G S F D Y 112 GGC CGT AAC TAC GGC GTA ATG TAC GAC GTT GAA GGC TGG ACC GAT ATG 897 G R N Y G V M Y D V E G W T D M 128 CTG CCG GAA TTC GGT GGC GAC TCT TAC ACC AAA GCA GAC AAC TTC ATG 945 L P E F G G D S Y T K A D N F M 144 ACC GGT CGT GCG AAC GGC GTG GCG ACC TAC CGT AAT ACC GAC TTC TTT 993 T G R A N G V A T Y R N T D F F 160 GGT CTG GTT GAC GGT CTG AAC GTG GCG TTG CAG TAT CAG GGC GCG AAC 1041 G L V D G L N V A L Q Y Q G A N 176 GAA AAT CAG TCA CCA GAG CAG GAA GGC ACC AAT AAC GGT GGC GAC GAT 1089 E N Q S P E Q E G T N N G G D D 192 CGT AAC ATG AAG AAC TCT AAC GGT GAC GGC TTC GGT ATC TCC TCG ACC 1137 R N M K N S N G D G F G I S S T 208 TAC GAT TTG GGT ATG GGT GTA AGC TTC GGT GCA GCA TAC ACC TCT TCT 1185 Y D L G M G V S F G A A Y T S S 224 GAC CGT ACT AAC GAG CAG GTT AAC GAT TCT ACC GCG GGT GGT GAT AAA 1233 D R T N E Q V N D S T A G G D K 240 GCT GAC GCG TGG ACA GTC GGT CTG AAA TAC GAC GCG AAC AAC ATC TAC 1281 A D A W T V G L K Y D A N N I Y 256 CTG GCA ACC ATG TAC TCC GAA ACC CGC AAC ATG ACC CCT TAT GGT GGC 1329 L A T M Y S E T R N M T P Y G G 272 TCA AAC GGT AGT GAT AAT ACG ATT GCC AAC AAA ACT CAG AAC TTT GAA 1377 S N G S D N T I A N K T Q N F E 288 GTG ACT GCG CAA TAC CAG TTC GAC TTC GGT CTG CGT CCG GAA GTT TCT 1425 V T A Q Y Q F D F G L R P E V S 304 TTC CTG ATG TCT AAA GGT AAG GAT CTG GGT GTA AAC GGA TCT GAT GGC 1473 F L M S K G K D L G V N G S D G 320 GAC CAG GAT CTG GTG AAA TAC GCA TCC GTA GGC GCT ACT TAC TAC TTC 1521 D Q D L V K Y A S V G A T Y Y F 336 AAC AAA AAC TTC TCC ACC TAC GTT GAT TAC AAA ATC AAC CTG CTG GAT 1569 N K N F S T Y V D Y K I N L L D 352 GAA GAT AAA AAC TTC TAC AGC CAA AAA CGA CAT CTC TAC CGA TGA 1614 E D K N F Y S Q K R H L Y R 366 cgtagtagca ctgggt 1630 atggtttacc agttctaatc cgtcagcccg ctggcaacag cgggctctct ttatgttcta 1690 acaattctgt tttatccaga tcaaaacatt atatctgttg cactaaaaca catctctgat 1750 agatgatatc ttgcattaag acctgtagta gaggatacct gcaatgaatc atcatcctgt 1810 aaaatcatcc cgtattgcat ccgtcggcta tgacgaatcc tcccgcacgc tagaaattcg 1870 ctttcaccag ttgtctactc tgcaatatca gcatgtccct gctcgtattt ttcgtgattt 1930 cctgagcgtc gtttctaaag gtcgatttta cgatggagta ataaaaggaa agtttcctga 1990 aataaaaata aagtgatgcc aaaatgtgat ctttgtcatt gtacataaag tgccattacg 2050 cggtaagctt tgggtggata cttaaacagg aggttttatg aacagaacga ttcttgtacc 2110 catcgat 2117

ｃ【図面の簡単な説明】 【図１】 ＰＣＥの微生物による分解の経路を示した図
である。 【図２】 Ｃ．ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ由来ＰＣＥデ
ハロゲナーゼの精製過程における、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの
結果を示した写真である。 【図３】 分子排除クロマトグラフィーで天然型のＣ．
ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ由来ＰＣＥデハロゲナーゼの
分子量を決定するための、検量線のグラフである。 【図４】 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳを用いて、Ｃ．ｂ
ｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ由来ＰＣＥデハロゲナーゼの分
子量を解析した結果を示した図である。 【図５】 ３種のＰＣＥデハロゲナーゼの、アミノ末端
アミノ酸配列を比較した図である。 【図６】 種々の制限酵素によりＣ．ｂｉｆｅｒｍｅｎ
ｔａｎｓ由来ＰＣＥデハロゲナーゼのゲノミックＤＮＡ
を分解し、アガロースゲル電気泳動及びサザンブロッテ
ィングを行った結果の写真である。 【図７】 ｐＤＥＨＡＬ５の制限酵素地図を示した図で
ある。 【図８】 Ｃ．ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ由来ＰＣＥデ
ハロゲナーゼの塩基配列及び推定アミノ酸配列を示した
図である。 【図９】 Ｃ．ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ由来ＰＣＥデ
ハロゲナーゼの推定アミノ酸配列の、ハイドロパシープ
ロットを示したグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 ＣＨＡＮＧ Ｙｏｕｎｇ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏ ｆ ａ Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｅｔｈ ｙｌｅｎｅ Ｄｅｃｈｌｏｒｉｎａｔｉ ｎｇ Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｃｌｏｓｔ ｒｉｄｉｕｍ ｂｉｆｅｒｍｅ，Ｊｏｕ ｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎ ｇ，2000年，ｖｏｌ．89，ｎｏ．５, 489−491 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA C12N 9/00 C12P 1/00 ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤ Ｓ（ＳＴＮ) ＣＡＯＬＤ（ＳＴＮ) ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ)

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 【請求項１】 以下の（ａ）（ｂ）または（ｃ）に示す
   塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。 （ａ）配列表の配列番号１の上段に示す、塩基番号１−
   ２１１７で示される塩基配列からなることを特徴とす
   る、遺伝子。 （ｂ）配列表の配列番号１の下段に示す、アミノ酸番号
   １−３６６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチ
   ドをコードすることを特徴とする、遺伝子。 （ｃ）テトラクロロエチレンの脱塩素反応を触媒するポ
   リペプチドをコードし、（ａ）の塩基配列の１０個以下
   が欠失、置換若しくは付加された、遺伝子。