CN106432602A - 三苯甲烷类分子替代孔雀石绿的分子印迹固相萃取膜的制备方法及应用 - Google Patents

三苯甲烷类分子替代孔雀石绿的分子印迹固相萃取膜的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种三苯甲烷类分子替代孔雀石绿的分子印迹固相萃取膜的制备方法及应用。本发明中以一种三苯甲烷类分子作为孔雀石绿的替代模板分子制备分子印迹膜，以解决分子印迹聚合物制备中模板分子价格高和使用中模板分子泄露等问题，同时仍保持了分子印迹的识别能力。本发明的方法中聚合反应反应稳定，无副反应产物，反应易控制，该方法制备得到的孔雀石绿分子印迹膜理化性质稳定、选择性高、传质速率快，不仅能与仪器法(如液相色谱、液相色谱‑质谱联用仪等)联用，还可以与快速检测法(如酶联免疫法、胶体金免疫法和快速检测试剂盒法等)联用。适用于复杂样品中痕量浓度的孔雀石绿的分离、萃取和富集。

Description

三苯甲烷类分子替代孔雀石绿的分子印迹固相萃取膜的制备 方法及应用
技术领域
本发明属于化学合成、分析化学和生物技术领域，涉及一种分子印迹固相萃取膜的制备和应用，具体是一种基于替代模板分子高选择性孔雀石绿分子印迹膜的制备方法，及所制备膜适用于选择性分离、萃取和富集水样、动物源性组织中痕量孔雀石绿及其类似物隐性孔雀石绿。
背景技术
在一个完整的样品分析过程中，前处理时间占用了70％-80％，而分析结果的误差有60％以上来源于样品的前处理步骤。分子印迹技术的出现改善了传统固相萃取技术选择性差的缺点，是一种基于其本身的特异“孔穴”对某类具有特定结构的物质的专一、精准识别作用的前处理技术，具有快速高效、抗基质干扰强、耐酸耐碱、机械强度高、选择性好等优点，可实现复杂样品中痕量甚至超痕量目标物的分离和富集。目前基于分子印迹聚合物的样品前处理受到分析、环境、医药等领域的关注，但是存在以下几个技术瓶颈仍有待解决：
(1)分子印迹技术通常采用目标物本身作为模板分子，难以获得完全除去模板分子的印迹聚合物，存在洗脱和泄漏的不确定性导致检测“假阳性”的风险。
(2)分子印迹聚合物的通透性差、传质速度慢，对目标物的吸附平衡时间长、洗脱条件要求高的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有前处理技术的上述不足，提出以一种三苯甲烷类分子作为孔雀石绿的替代模板分子制备分子印迹膜，以解决分子印迹聚合物制备中模板分子价格高和使用中模板分子泄露等问题，同时仍保持了分子印迹的识别能力。现有的分子印迹材料存在印迹位点“包埋”过深，目标分子在分子印迹聚合物上吸附慢、效率低的问题，以具有疏松、多孔、快速渗滤作用的玻璃纤维膜作为底材来制备分子印迹聚合物膜，解决了萃取效率低和萃取容量较小的问题。采用替代模板分子制备的分子印迹聚合物对动物源食品进行处理提取和净化处理，大大缩短了每个样品前处理的萃取前处理时间，特异性识别减少了样品基质的影响，使实验操作简单、快捷，同时具有操作准确、灵敏度高及重复性好等优点。
为了实现上述发明目的，本发明提供一种三苯甲烷类分子替代孔雀石绿的分子印迹固相萃取膜的制备方法，该方法采用三苯甲烷类物质作为模板分子，采用玻璃纤维膜作为底材。具体而言，该方法包括如下步骤：
(1)将三苯甲烷类物质、有机单体、有机交联剂、有机溶剂、偶氮引发剂进行超声混溶处理，得到混合有机溶液；
(2)将所述混合有机溶液置于4℃冰箱静置6h进行预聚合，预聚合过程完成后取出所述预聚合溶液，通入氮气数分钟后，将所述混合有机溶液倒入反应模具中，同时加入与模具尺寸匹配的底材，通过控制加液量的多少可以获得不同厚度的夹心结构聚合物膜；
(3)向反应器中通入氮气，一段时间后，密封反应器，并加热至50-70℃进行聚合反应，待所述聚合反应结束后，对得到的分子印迹膜洗涤和除去三苯甲烷类替代模版分子，获得对孔雀石绿及其类似物隐性孔雀石绿有选择吸附作用的分子印迹聚合物膜。
在本发明一个具体的实施方式中，所述底材为玻璃纤维膜或者玻璃纤维毡。
在本发明一个具体的实施方式中，所述三苯甲烷类物质选自选自三苯甲烷，烷基取代的三苯甲烷，碱性绿，酚酞，玫红，胭脂红等；其中烷基为C1-C6的烷基。
在本发明一个具体的实施方式中，上述步骤(1)中，有机单体能与模板分子三苯甲烷类分子形成稳定的氢键、静电作用、π-π共轭等非共价键作用，从而提高分子印迹聚合物膜的特异吸附性。该有机单体选自甲基丙烯酸、三氟甲基丙烯酸、丙烯酰胺、4-乙烯基苯甲酸、2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸中的一种或多种。
该有机单体的加入的量与模板分子三苯甲烷类分子的摩尔比为(2-6)：1；在具体实施例中，该有机单体与模板分子三苯甲烷类分子的摩尔比为2：1、3：1、4：1、5：1、6：1等。该比例的有机单体能够减少分子印迹聚合物的非特异吸附性，并增加其表面印迹位点的稳定性，从而提高分子印迹膜的选择性吸附能力。
在本发明一个具体的实施方式中，上述步骤(1)中有机交联剂能使得模板分子-有机单体复合物在聚合反应过程中交联，形成稳定的网状结构物质。在具体的实施例中，该有机交联剂选自二甲基丙烯酸乙二醇酯、二乙烯基苯、三甲基丙烷三甲基丙烯酸酯中的一种或多种。
该有机交联剂的加入的量与有机单体的摩尔比为(3-8)：1；在具体实施例中，该有机交联剂与有机单体的摩尔比为3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8:1等。该比例的有机交联剂能够使得分子印迹膜的交联度高、理化性质稳定、机械强度高，减少分子印迹聚合物的非特异吸附性，从而提高分子印迹膜的选择性吸附能力、萃取容量和富集倍数。
在本发明一个具体的实施方式中，上述步骤(1)中有机溶剂能完全溶解聚合体系中的物质，且不影响模板分子-有机单体复合物的非共价键作用，同时使得分子印迹膜存在适合的孔隙，从而增大其传质速率、分子识别速率和萃取容量。在具体实施例中，该有机溶剂选自甲苯、氯仿、乙腈、二甲基亚砜的一种多种。
在本发明一个具体的实施方式中，上述偶氮引发剂能在50-70℃下只形成一种自由基，且分解均匀，为一级反应，不发生诱导分解，无其他副反应，从而不影响模板-有机单体复合物间的非共价键作用，且使得模板-有机单体复合物间进行的聚合反应稳定，反应条件较易控制。而且在聚合反应过程中，该偶氮类引发剂对溶剂和杂质不敏感。在具体实施例中，该偶氮引发剂选自偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈和偶氮二异丁酸二甲酯中的一种或多种。
上述关于偶氮引发剂的各实施例中，其用量可以是足量。在另一实施例中，该偶氮引发剂的添加量与模板分子三苯甲烷类化合物质量比为(6-8)：1。在具体实施例中，偶氮引发剂与模板分子三苯甲烷类化合物的质量比为6：1、6.5：1、7：1、7.5：1、8：1等。
为了使得该步骤(1)各反应物充分的混合和溶解，在本发明具体的实施例中，将各反应物混合后，可以将混合液采用超声处理，具体的可以采用超声助溶5-30分钟。
上述步骤(2)中，在4℃冰箱静置6h，是为步骤(1)中配制的混合有机溶液提供一个低温且静态的环境，使得模板分子与有机单体能形成稳定的非共价键作用，从而提高分子印迹膜的选择性。
上述向混合有机溶液中通入氮气是为了除去步骤(1)中配制的混合有机溶液中的氧气，保证反应顺利发生。
上述向混合有机溶液中投入的玻璃纤维膜，作为表面印迹聚合物的载体，其类型可以选用亲水型玻璃纤维膜或疏水型玻璃纤维膜。
上述选用的模具需要经过表面处理，使得合成的分子印记聚合物不会发生粘璧现象。具体的，表面处理方式可以采用化学法，也可以直接在载玻片进行惰性处理。
上述步骤(3)中，向反应器中通入氮气并将其密封，是为了给聚合反应提供一个无氧的环境，保证反应顺利发生。
上述将混合有机溶液加热至50-70℃并保持该温度直至混合有机溶液反应完毕。在该50-70℃下，模板分子-有机单体复合物在交联剂、偶氮引发剂等作用下发生聚合反应。在一实施例中，该聚合反应的温度为60℃。
上述聚合反应的时间应该保证聚合反应充分反应直至反应完毕。在一实施例中，反应时间可以控制在6-12h，在具体实施例中，该聚合反应在60℃下持续反应8h。
上述聚合反应完毕后，对所述分子印迹膜进行洗涤，以除去其表面未参与反应的物质以及其他杂质等。洗涤方式可以采用超纯水、甲醇(色谱纯)进行反复清洗，在洗涤过程中可以采用往复式振荡器和超声中的一种或两种相结合。
上述洗脱模板分子三苯甲烷类分子时，洗脱方式采用甲醇/乙酸、甲醇/氨水、甲醇进行反复清洗，在洗脱过程中可以采用往复式振荡器和超声中的一种或两种相结合
与传统的分子印迹聚合物合成技术相比，上述分子印迹膜制备方法以类似化合物作为替代模板分子，采用偶氮类引发剂在固定温度下发生聚合反应，聚合反应条件简单，反应稳定、易于控制，无副反应产物产生且成本较低。而且，制备的分子印迹聚合物膜理化性质稳定，对孔雀石绿和隐性孔雀石绿具有较强的特异吸附性，平衡时间短、萃取过程简单、萃取容量大、传质速率快且富集倍数高，适用于复杂样品中痕量浓度的孔雀石绿和隐性孔雀石绿的快速分离、萃取和富集。为实验室常用的仪器法(如液相色谱、液相色谱-质谱联用仪等)联用，还可以与快速检测法(如酶联免疫法、胶体金免疫法和快速检测试剂盒法等)联用，提高结果的准确度，满足现场检测和快速筛查的需求，可望解决目前分析领域中样品前处理技术的瓶颈，具有良好的应用前景。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1三苯甲烷类化合物为替代模板分子的分子印迹膜原理示意图；
图2分子印迹聚合物制备流程示意图；
图3分子印迹聚合膜萃取洗脱过程-洗脱过程示意图；
图4非分子印迹聚合膜的10000倍扫描电镜SEM图；
图5分子印迹聚合膜的10000倍扫描电镜SEM图；
图6分子印迹膜(MIP)与非分子印迹膜(NIP)萃取孔雀石绿和隐性孔雀石绿萃取量示意图；
具体实施方式
实施例1：分子印迹固相萃取膜(MIP)的制备及应用
S01：配置含有三苯甲烷、4-乙烯基苯甲酸、交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯、偶氮引发剂偶氮二异丁腈的混合有机溶液：将三苯甲烷1mol、4-乙烯基苯甲酸2mol、交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯6mol、有机溶剂甲苯适量、偶氮引发剂偶氮二异丁腈6mol进行超声混溶处理30min，得到混合溶液；
S02：将所述混合有机溶液置于4℃冰箱静置6h进行预聚，预聚完成后取出所述混合有机溶液，通入氮气数分钟后，将所述混合有机溶液倒入反应模具中，同时加入与模具尺寸匹配的玻璃纤维膜，通过控制加液量的多少可以获得不同厚度的聚合物膜；
S03：向反应器中通入氮气，一段时间后，密封反应器，并加热至60℃进行聚合反应8h，待所述聚合反应结束后，取下载玻片，对所述分子印迹膜进行洗涤和除去三苯甲烷类替代模版分子获得孔雀石绿分子印迹膜。
S04：分子印迹聚合物膜的应用，取5g标准鱼样品(其中孔雀石绿的含量0.2ng/g)，加入1.4ml 0.1M乙酸钠(ph4.8)和0.6ml 1M对甲苯磺酸，涡旋30s加入10ml乙腈，涡旋(或震荡)5min加入2g无水硫酸镁和4.5g中性氧化铝，涡旋30s离心5min，取全部上清液(过膜)，约10ml，加入50μl氧化剂，静置2min加入20ml超纯水，放入膜片，置于往复式振荡仪低速振荡萃取15min取出膜片，80℃下烘干5-10min，0.5-1ml乙腈/乙酸(9:1，v/v)洗脱，正反各5次，收集洗脱液(300-500μl)，采用液相色谱测得孔雀石绿的含量为1.8ng/g，回收率90％。
实施例2分子印迹固相萃取膜(MIP)的制备及应用
S01：配置含有三苯甲烷、三氟甲基丙烯酸、交联剂二乙烯基苯、偶氮引发剂偶氮二异庚腈的混合有机溶液：将三苯甲烷1mol、三氟甲基丙烯酸3mol、交联剂二乙烯基苯12mol、有机溶剂氯仿适量、偶氮引发剂偶氮二异庚腈7mol进行超声混溶处理30min，得到混合溶液；
S02：将所述混合有机溶液置于4℃冰箱静置6h进行预聚，预聚完成后取出所述混合有机溶液，通入氮气数分钟后，将所述混合有机溶液倒入反应模具中，同时加入与模具尺寸匹配的玻璃纤维膜，通过控制加液量的多少可以获得不同厚度的聚合物膜；
S03：向反应器中通入氮气，一段时间后，密封反应器，并加热至60℃进行聚合反应8h，待所述聚合反应结束后，取下载玻片，对所述分子印迹膜进行洗涤和除去三苯甲烷替代模版分子获得孔雀石绿分子印迹膜。
S04：分子印迹聚合物膜的应用，取5g标准鱼样品(其中孔雀石绿的含量0.2ng/g)，加入1.4ml 0.1M乙酸钠(ph4.8)和0.6ml 1M对甲苯磺酸，涡旋30s加入10ml乙腈，涡旋(或震荡)5min加入2g无水硫酸镁和4.5g中性氧化铝，涡旋30s离心5min，取全部上清液(过膜)，约10ml，加入50μl氧化剂，静置2min加入20ml超纯水，放入膜片，置于往复式振荡仪低速振荡萃取15min取出膜片，80℃下烘干5-10min，0.5-1ml乙腈/乙酸(9:1，v/v)洗脱，正反各5次，收集洗脱液(300-500μl)，采用液相色谱测得孔雀石绿的含量为1.85ng/g，回收率92.5％。
实施例3分子印迹固相萃取膜(MIP)的制备及应用
S01：配置含有酚酞、丙烯酰胺、交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯、偶氮引发剂偶氮二异丁酸二甲酯的混合有机溶液：将酚酞1mol、丙烯酰胺3mol、交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯12mol、有机溶剂乙腈适量、偶氮引发剂偶氮二异丁酸二甲酯7mol进行超声混溶处理30min，得到混合溶液；
S02：将所述混合有机溶液置于4℃冰箱静置6h进行预聚，预聚完成后取出所述混合有机溶液，通入氮气数分钟后，将所述混合有机溶液倒入反应模具中，同时加入与模具尺寸匹配的玻璃纤维膜，通过控制加液量的多少可以获得不同厚度的聚合物膜；
S03：向反应器中通入氮气，一段时间后，密封反应器，并加热至60℃进行聚合反应8h，待所述聚合反应结束后，取下载玻片，对所述分子印迹膜进行洗涤和除去酚酞替代模版分子获得孔雀石绿分子印迹膜。
S04：分子印迹聚合物膜的应用，取5g标准鱼样品(其中孔雀石绿的含量0.2ng/g)，加入1.4ml 0.1M乙酸钠(ph4.8)和0.6ml 1M对甲苯磺酸，涡旋30s加入10ml乙腈，涡旋(或震荡)5min加入2g无水硫酸镁和4.5g中性氧化铝，涡旋30s离心5min，取全部上清液(过膜)，约10ml，加入50μl氧化剂，静置2min加入20ml超纯水，放入膜片，置于往复式振荡仪低速振荡萃取15min取出膜片，80℃下烘干5-10min，0.5-1ml乙腈/乙酸(9:1，v/v)洗脱，正反各5次，收集洗脱液(300-500μl)，采用液相色谱测得孔雀石绿的含量为1.86ng/g，回收率93.0％。
实施例4：分子印迹固相萃取膜(MIP)的制备及应用
S01：配置含有碱性品红、甲基丙烯酸、交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯、偶氮引发剂偶氮二异丁酸二甲酯的混合有机溶液：将碱性品红1mol、甲基丙烯酸3mol、交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯12mol、有机溶剂氯仿适量、偶氮引发剂偶氮二异丁酸二甲酯7mol进行超声混溶处理30min，得到混合溶液；
S02：将所述混合有机溶液置于4℃冰箱静置6h进行预聚，预聚完成后取出所述混合有机溶液，通入氮气数分钟后，将所述混合有机溶液倒入反应模具中，同时加入与模具尺寸匹配的玻璃纤维膜，通过控制加液量的多少可以获得不同厚度的聚合物膜；
S03：向反应器中通入氮气，一段时间后，密封反应器，并加热至60℃进行聚合反应8h，待所述聚合反应结束后，取下载玻片，对所述分子印迹膜进行洗涤和除去碱性品红替代模版分子获得孔雀石绿分子印迹膜。
S04：分子印迹聚合物膜的应用，取5g标准鱼样品(其中孔雀石绿的含量0.2ng/g)，加入1.4ml 0.1M乙酸钠(ph4.8)和0.6ml 1M对甲苯磺酸，涡旋30s加入10ml乙腈，涡旋(或震荡)5min加入2g无水硫酸镁和4.5g中性氧化铝，涡旋30s离心5min，取全部上清液(过膜)，约10ml，加入50μl氧化剂，静置2min加入20ml超纯水，放入膜片，置于往复式振荡仪低速振荡萃取15min取出膜片，80℃下烘干5-10min，0.5-1ml乙腈/乙酸(9:1，v/v)洗脱，正反各5次，收集洗脱液(300-500μl)，采用液相色谱测得孔雀石绿的含量为1.85ng/g，回收率92.5％。
对比例1：
制备分子印迹固相萃取膜时，采用孔雀石绿本身作为模板分子，其他操作同实施例1。
采用液相色谱测得孔雀石绿的含量为0.190ng/g，回收率95％。
实施例5不同加标浓度下分子印迹固相萃取膜(MIP)和非分子印迹固相萃取膜(NIP)的萃取量
配置三组空白萃取环境(含有10ml乙腈和20ml超纯水)，加标浓度分别为1、2、5ng/ml，放入膜片，置于往复式振荡仪低速振荡萃取15min取出膜片，80℃下烘干5-10min，0.5-1ml乙腈/乙酸(9:1，v/v)洗脱，正反各5次，收集洗脱液(300-500μl)，采用液相色谱测得孔雀石绿和隐性孔雀石绿的含量。
其中，附图6为不同加标浓度下测得的洗脱液中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的浓度。在三个加标浓度下，MIP对于孔雀石绿和隐性孔雀石绿的萃取量均大于NIP，且MIP对孔雀石绿的富集倍数大于14(富集倍数＝洗脱液的浓度/加标浓度)，对隐性孔雀石绿的富集倍数大于6，说明本专利所制备的分子印迹固相萃取膜对孔雀石绿和隐性孔雀石绿均有较好的特异吸附性。

Claims (9)

1.一种三苯甲烷类分子替代孔雀石绿的分子印迹固相萃取膜的制备方法，其特征在于，采用三苯甲烷类物质作为模板分子。
2.根据权利要求1所述的三苯甲烷类分子替代孔雀石绿的分子印迹固相萃取膜的制备方法，其中三苯甲烷类物质选自三苯甲烷，烷基取代的三苯甲烷，碱性绿，酚酞，玫红，胭脂红等。
3.根据权利要求1-2任一项所述的三苯甲烷类分子替代孔雀石绿的分子印迹固相萃取膜的制备方法，其中采用玻璃纤维膜或者玻璃纤维毡作为底材。
4.根据权利要求1-2任一项所述的三苯甲烷类分子替代孔雀石绿的分子印迹固相萃取膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)将三苯甲烷类物质、有机单体、有机交联剂、有机溶剂、偶氮引发剂进行超声混溶处理，得到混合有机溶液；
(2)将所述混合有机溶液置于4℃冰箱静置6h进行预聚合，预聚合过程完成后取出所述预聚合溶液，通入氮气数分钟后，将所述混合有机溶液倒入反应模具中，同时加入与模具尺寸匹配的底材，通过控制加液量的多少可以获得不同厚度的夹心结构聚合物膜；
(3)向反应器中通入氮气，一段时间后，密封反应器，并加热至50-70℃进行聚合反应，待所述聚合反应结束后，对得到的分子印迹膜洗涤和除去三苯甲烷类替代模版分子，即得。
5.根据权利要求1-2任一项所述的三苯甲烷类分子替代孔雀石绿的分子印迹固相萃取膜的制备方法，有机单体选自甲基丙烯酸、三氟甲基丙烯酸、丙烯酰胺、4-乙烯基苯甲酸、2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸中的一种或多种。
6.根据权利要求1-2任一项所述的三苯甲烷类分子替代孔雀石绿的分子印迹固相萃取膜的制备方法，有机交联剂选自二甲基丙烯酸乙二醇酯、二乙烯基苯、三甲基丙烷三甲基丙烯酸酯中的一种或多种。
7.根据权利要求1-2任一项所述的三苯甲烷类分子替代孔雀石绿的分子印迹固相萃取膜的制备方法，机溶剂选自甲苯、氯仿、乙腈、二甲基亚砜的一种多种。
8.根据权利要求1-2任一项所述的三苯甲烷类分子替代孔雀石绿的分子印迹固相萃取膜的制备方法，偶氮引发剂选自偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈和偶氮二异丁酸二甲酯中的一种或多种。
9.根据权利要求1-2任一项所述的三苯甲烷类分子替代孔雀石绿的分子印迹固相萃取膜的应用，其特征在于用于检测鱼、虾以及其他海鲜中孔雀石绿或者隐性孔雀石绿的含量。
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