CN106432219B

CN106432219B - 一类含苯并噻唑的苯并[c,d]吲哚-2(1H)-酮类衍生物，其制备方法及应用

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Publication number: CN106432219B
Application number: CN201510472297.6A
Authority: CN
Inventors: 李晓莲; 范丽丽; 刘季红
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2015-08-04
Filing date: 2015-08-04
Publication date: 2019-04-05
Anticipated expiration: 2035-08-04
Also published as: CN106432219A

Abstract

本发明公开一类含苯并噻唑的苯并[c,d]吲哚‑2(1H)‑酮类衍生物，其制备方法及应用，所述衍生物具有通式Y的结构，其中R为‑H或‑Br，n＝2、3或4。本发明通过在苯并[c,d]吲哚‑2(1H)‑酮母体上引入苯并噻唑基团，设计合成了一类含苯并噻唑的苯并[c,d]吲哚‑2(1H)‑酮衍生物。该类衍生物对乳腺癌和宫颈癌等多种不同组织来源的肿瘤细胞具有抑制生长的活性，而对人体正常细胞的抑制活性较小，在制备抑制肿瘤细胞生长药物中具有广阔的前景。

Description

一类含苯并噻唑的苯并[c,d]吲哚-2(1H)-酮类衍生物，其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一类抗肿瘤含苯并噻唑的苯并[c,d]吲哚-2(1H)-酮类衍生物，属于生物有机合成领域。

背景技术

苯并[c,d]吲哚-2(1H)-酮是一类重要的人工合成抗肿瘤化合物母体，越来越多的科研人员着力于对其结构的改造以期能够扩展萘内酰亚胺类化合物的应用。AG331(APPELTK,BACQUET R J,BARTLETT C A,et al.Design of Enzyme-Inhibitors Using IterativeProtein Crystallographic Analysis[J].J Med Chem.,1991,34(7):1925-1934)也是一种胸苷酸合成酶抑制剂，目前已进入临床I期试验。AG331在体内对鼠淋巴瘤有很强的活性，且在体外实验对人白血病CCRF-CEM、鼠L1210白血病等也有较好的效果。殷虹等在母体结构上引入柔性链状胺，发现苯并吲哚酮的平面结构和柔性胺链提供其作为潜在DNA嵌入剂的药效团，其中化合物A3(YIN H,Xu Y,Qian X.Novel antitumor agent family of 1H-benzo[c,d]indol-2-one with flexible basic side chains:Synthesis andbiological evaluation[J].Bioorg.Med.Chem.,2007,15(3):1356)对人肺癌A549细胞和鼠白血病P388细胞的IC50值分别达到0.428μΜ和1.69μΜ。因此，苯并吲哚酮类衍生物的开发对抗癌药物寻找新母体、新结构具有重要的意义。

苯并噻唑具有良好的药理学活性，在抗痉剂、镇痛剂、抗菌剂、抗肿瘤等方面有广泛应用。文献报道2-(4-氨基苯基)苯并噻唑在抗癌细胞实验中表现了高的活性，尤其对卵巢癌和乳腺癌细胞效果更加明显。含取代基的苯并噻唑如2-(3,4-二甲氧基-苯基)-5-氟苯并噻唑(PMX 610)在体外抗肿瘤活性实验中，对结肠癌、非小细胞肺癌和乳腺癌具有高度选择性。因此，在药物母体上引入苯并噻唑药效团是分子设计的一个思路。

发明内容

本发明的目的是在苯并[c,d]吲哚-2(1H)-酮活性位点接入苯并噻唑基团，以此来扩展苯并[c,d]吲哚-2(1H)-酮类药物的种类，并得到更加有效、毒副作用小的抗肿瘤药物。

本发明的技术目的通过以下技术方案实现：

一类含苯并噻唑的苯并[c,d]吲哚-2(1H)-酮类衍生物，所述衍生物具有通式Y的结构：

其中，R为-H或-Br，n＝2、3或4。

进一步的，通式Y中，n＝2或3。

进一步的，所述衍生物优选为Y1、Y2、Y3和Y4中的一种：

本发明的另一技术目的在于提供所述含苯并噻唑的苯并[c,d]吲哚-2(1H)-酮类衍生物的制备方法，包括以下步骤：

①当R为-H时，以苯并[c,d]吲哚-2(1H)-酮为原料，当R为-Br时，将苯并[c,d]吲哚-2(1H)-酮与溴单质混合，通过溴代反应生成中间体b；

②步骤①的原料或中间体b与丙二腈混合反应生成中间体c；

③中间体c与卤代烷烃混合，通过取代反应生成中间体d；

④中间体d与2-巯基苯并噻唑混合，通过亲核反应生成所述衍生物；

所述中间体b、c、d和卤代烷烃的结构式分别为：

其中n＝2、3或4。

合成路线如下：

本发明的另一技术目的在于提供所述衍生物在制备抑制肿瘤细胞生长药物中的应用，所述的肿瘤细胞包括乳腺癌MCF-7细胞和人宫颈癌Hela细胞。

将上述合成的含苯并噻唑的苯并[c,d]吲哚-2(1H)-酮类衍生物分别用四氮唑盐还原法对乳腺癌MCF-7细胞和人宫颈癌Hela细胞进行体外抑制肿瘤细胞生长活性的测定，并同时进行以上化合物对HL7702人正常肝细胞的体外抑制细胞生长活性的测定。

所述四氮唑盐还原法实验步骤如下：

1、接种细胞

分别将乳腺癌MCF-7细胞、人宫颈癌Hela细胞和HL7702人正常肝细胞收集到培养基中，将细胞稀释每孔接种约5000个细胞，最外围加入200μLPBS，提供充足的水分保证细胞的生长环境，将培养板放至CO₂培养箱中温育一到两天。

2、添加药物

当细胞培育至对数生长期时即可加药物，用培养基将本发明所述化合物分别稀释成2μM、20μM、40μM、80μM四个梯度浓度，向细胞中加入药物，每个药物浓度设置4个复孔，减小误差，并设置对照组，放回CO₂培养箱中，培育24h。

3、存活细胞数的检测

在所有孔中均加入20μL MTT，放到CO₂培养箱中温育4h；弃去孔中的溶液加入200μL DMSO，溶解形成的结晶。在酶标仪上测定各孔吸光度记录结果，按下列公式计算出被测物的IC₅₀值。

本发明的有益效果：

本发明通过在苯并[c,d]吲哚-2(1H)-酮母体上引入苯并噻唑基团，设计合成了一类含苯并噻唑的苯并[c,d]吲哚-2(1H)-酮衍生物。其目的是：通过Knoevenagel缩合、取代等反应合成一类含苯并噻唑的苯并[c,d]吲哚-2(1H)-酮衍生物，一方面扩大三元环的共轭平面增加母体嵌入性，另一方面通过柔性侧链将具有抗癌活性的巯基苯并噻唑药效团引入母体，提高该系列化合物的抗癌活性并增加溶解性。该类衍生物对乳腺癌和宫颈癌等多种不同组织来源的肿瘤细胞具有抑制生长的活性，而对人体正常细胞的抑制活性较小，在制备抑制肿瘤细胞生长药物中具有广阔的前景。

附图说明

本发明附图1幅

图1.化合物Y1～3的粘度测试结果。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

化合物Y1的合成

(1)中间体2的合成

干燥环境下，将4.0g(23.66mmol)苯并[c,d]吲哚-2(1H)-酮(化合物1)倒入装有30mL无水甲苯的100mL两口瓶中，再加入2.0g(30.3mmol)丙二腈，磁力搅拌下加热反应至80℃，然后向反应体系中缓慢滴加3.0mL(11.57mmol)POCl₃，升温体系至100℃，在100℃下反应3.5h后，停止搅拌，冷却后将15mL甲醇和500mL冷水加入体系中，析出黑褐色沉淀，静置一夜后抽滤，水洗，干燥后得到4.2g黑色固体(中间体2)，产率：71.9％。

(2)中间体3的合成

在100mL反应瓶中，加入4.0g(18.4mmol)化合物2，2.5g碳酸钾，20mL无水乙腈，再向体系中加入20mL(0.23mol)二溴乙烷，催化剂量的Cu和CuI，氮气保护下加热至回流，4.5h后停止反应，冷却至室温，静置一夜后过滤，水洗，干燥后硅胶柱层析提纯(CH₂Cl₂：石油醚＝3:1)得橙黄色固体(中间体3)4.43g，产率：68.5％。

(3)化合物Y1的合成

取0.1g(0.31mmol)中间体3，0.08g(0.48mmol)2-巯基苯并噻唑，0.02gK₂CO₃，加入到50mL双口瓶中，用20mL的DMF溶解，搅拌均匀，将反应加热到140℃反应3h。体系冷却至室温后倒入冰水中，静置一夜，过滤，干燥后硅胶柱层析提纯(CH₃OH:CH₂Cl₂＝1:250)得黄色固体0.1g，产率：82.5％。熔点：213.2-213.9℃。

+ESI MS(M+H):C₂₃H₁₄N₄S₂,计算值：410.07，实测值：410.07。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.63(d,J＝7.4Hz,1H),8.07(d,J＝8.1Hz,1H),7.85(d,J＝7.7Hz,1H),7.73(t,J＝8.6Hz,2H),7.67(dd,J＝7.5,1.4Hz,1H),7.63–7.57(m,2H),7.45(dd,J＝11.3,4.1Hz,1H),7.33–7.29(m,1H),4.99–4.93(m,2H),3.94–3.89(m,2H).

¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ165.16(s,1H),157.91(s,1H),152.68(s,2H),141.52(s,3H),135.41(s,1H),131.91(s,3H),129.46(d,J＝13.8Hz,4H),129.07(s,3H),128.78(s,3H),127.88(s,4H),126.20(s,3H),124.58(s,3H),124.19(s,2H),122.36(s,3H),121.23(d,J＝10.9Hz,7H),116.06(s,2H),115.56(s,3H),108.40(s,4H),50.79(s,2H),44.28(s,3H),31.62(s,3H).

实施例2

化合物Y2的合成：

(1)中间体4的合成

采用实施例1中步骤(1)得到的中间体2，除用1-氯-3溴丙烷代替1,2-二溴乙烷外，合成方法同实施例1中步骤(2)，得到中间体4，橙黄色固体，产率为58.4％。

(2)化合物Y2的合成

除用中间体4代替中间体3外，合成方法同实施例1中步骤(3)，经硅胶柱层析提纯(CH₃OH:CH₂Cl₂＝1:500)得黄色固体，产率80.1％。熔点：152.7-153.8℃。

+ESI MS(M+H):C₂₄H₁₆N₄S₂,计算值：424.08，实测值：424.15。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.69(d,J＝7.4Hz,1H),8.11(d,J＝8.1Hz,1H),7.82–7.75(m,3H),7.65(d,J＝8.3Hz,1H),7.52(t,J＝7.8Hz,1H),7.42(dd,J＝11.2,4.2Hz,1H),7.32(d,J＝7.1Hz,1H),7.21(d,J＝7.3Hz,1H),4.67–4.61(m,2H),3.52(t,J＝6.9Hz,2H),2.58–2.51(m,2H).

实施例3

化合物Y3的合成：

(1)中间体5的合成

采用实施例1中步骤(1)得到的中间体2，除用1-氯-4-溴丁烷代替1,2-二溴乙烷外，合成方法同实施例1中步骤(2)，得到中间体5，橙黄色固体，产率为50.2％。

(2)化合物Y3的合成

除用中间体5代替中间体3外，合成方法同实施例1中步骤(3)，经硅胶柱层析提纯(CH₃OH:CH₂Cl₂＝1:500)得黄色固体L3，产率78.6％。熔点：113.9-114.7℃。

+ESI MS(M+H):C₂₅H₁₈N₄S₂,计算值：438.10，实测值：438.14。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.66(d,J＝7.4Hz,1H),8.09(d,J＝8.1Hz,1H),7.83(d,J＝8.1Hz,1H),7.80–7.76(m,1H),7.74(d,J＝7.6Hz,1H),7.64(d,J＝8.3Hz,1H),7.54–7.50(m,1H),7.43–7.39(m,1H),7.32–7.28(m,1H),7.11(d,J＝7.2Hz,1H),4.49–4.45(m,2H),3.47(t,J＝6.9Hz,2H),2.19–2.14(m,2H),2.09–2.04(m,2H).

实施例4

化合物Y4的合成：

(1)中间体6的合成

在100mL的两口瓶中，将2g(11.8mmol)苯并吲哚酮溶于20mL的1,2-二氯乙烷中，然后取0.6mL液溴溶于10mL的1,2-二氯乙烷中，将此混合溶液缓慢滴加到反应瓶中，升温至50℃，反应3h。体系冷却后静置一夜，过滤，水洗后干燥。得黄色固体(中间体6)，产率80.1％。

(2)化合物Y4的合成

用中间体6代替实施例1中步骤(1)的中间体1，其他步骤和操作同实施例1，最后经硅胶柱层析提纯(CH₃OH:CH₂Cl₂＝1:500)得黄色固体，产率77.1％。熔点：202.8-203.5℃。

+ESI MS(M+H):C₂₃H₁₃BrN₄S₂,计算值：487.98，实测值：488.25。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.65(d,J＝7.4Hz,1H),8.18(d,J＝8.6Hz,1H),7.80(d,J＝8.0Hz,3H),7.71(d,J＝7.3Hz,1H),7.43(d,J＝7.6Hz,2H),7.32(d,J＝8.0Hz,1H),4.98–4.88(m,2H),3.90(t,J＝7.1Hz,2H).

实施例5

体外抑制肿瘤细胞生长活性测定：

用四氮唑盐(microculture tetrozolium，MTT)还原法对Hela宫颈癌细胞、MCF-7乳腺癌细胞和HL7702人正常肝细胞进行体外抑制细胞生长活性测定。

四氮唑盐(MTT)还原法的具体操作是：

(1)接种细胞、培养细胞：当细胞处于对数生长期时，用胰蛋白酶将贴壁生长的细胞消化下来，收集到含血清的培养基中并稀释细胞悬液浓度为大约4×10⁵～6×10⁵个/mL。将上述培养液接种到无菌96孔板中，每孔加入100μL细胞悬液(每孔大约5000个细胞)，最外围每孔加入200μL的PBS缓冲液，为细胞生长环提供充足的水分环境。将接种后的培养板放至37℃、5％CO₂环境的培养箱中温育24h，当细胞处于对数生长期时即可加药物。

(2)添加药物：用培养基将药物稀释成2μM，20μM，40μM，80μM四个梯度浓度。每个浓度设置4个复孔来减小误差。每孔加入100μL药物溶液(此时药物浓度稀释一倍)，对照组设置8～10个复孔，对照组不加药物用培养基代替。培养板放回培养箱中温育，使药物作用24h。

(3)检测存活细胞数：取出培养板，每孔加入20μL MTT。放回培养箱中培养4h。吸出所有孔中的培养基和MTT，注意不要吸走孔底部的紫色结晶。每孔中加入200μL DMSO溶解甲臜结晶，在摇床上震荡10分钟。将96孔板放入酶标仪中测定每个孔吸光度。波长为490nm，570nm，625nm。计算细胞生长抑制率和IC₅₀值。

对化合物Y1～4的体外生测结果如下：

表1.化合物Y1～4对Hela，MCF-7和HL7702细胞株的IC₅₀值

从表1可以看出化合物Y1、Y2、Y4对肿瘤细胞株Hela、MCF-7都表现出良好的抑制增殖效果，Y1～4对正常细胞HL7702的抑制活性较小，具有选择性。

实施例6

化合物与细胞DNA作用方式的确定

溶液粘度对溶质分子长度变化比较敏感，所以粘度测试是确定药物分子与DNA结合方式的一种有效方法。若药物与CT-DNA以嵌插方式结合，药物分子破坏了碱基对的链接，使DNA双螺旋链部分解旋和变长，溶液粘度增加；若药物以非嵌插结合(静电吸引或沟槽结合)方式与CT-DNA作用，DNA链长度不会发生明显变化，溶液粘度也不会明显变化。

具体实验过程如下：

牛胸腺DNA溶于Tris-HCl(30mM，pH7.5)缓冲溶液中，4℃下保存，全部溶解后，在超声仪中震荡10分钟，用PVDF膜(孔径0.45μM)过滤，以滤去不溶物。配制的小牛胸腺DNA浓度100μM。粘度测定在乌氏粘度计上进行，放置于恒温水域槽中，水浴保持恒温25℃。吸取l0mL小牛胸腺DNA(100μM)置于粘度计中，用秒表记录滴下时间。滴加浓度为10^-3M的Y1-3化合物溶液，使其浓度和DNA浓度的比值逐渐增加，用吸耳球鼓泡以混匀溶液。记录化合物滴下时间，每个化合物溶液滴下时间重复测量三次，每次相差不得超过0.2秒，取平均值。以(η/η_o)^1/3相对于化合物与DNA的浓度比值R(R＝C_化合物/C_DNA)比值作图，其中η表示滴加化合物后DNA的相对运动粘度，η_o表示没有化合物时DNA的相对运动粘度。

图1为药物Y1-3的粘度测试结果。由图可见，DNA溶液的粘度随着药物浓度增加，呈增大的趋势，说明药物分子嵌插到DNA碱基对中，使DNA的双螺旋变松散，DNA分子伸长，即药物分子在R≤0.20范围内主要以嵌插结合方式与DNA作用。通过粘度变化对比，可以看出化合物Y1与DNA的作用最强。

Claims

1.一类含苯并噻唑的苯并[c,d]吲哚-2(1H)-酮类衍生物，其特征在于：所述衍生物具有通式Y的结构：

其中，R为-H或-Br，n＝2、3或4。

2.根据权利要求1所述的含苯并噻唑的苯并[c,d]吲哚-2(1H)-酮类衍生物，其特征在于：通式Y中，n＝2或3。

3.根据权利要求1所述的含苯并噻唑的苯并[c,d]吲哚-2(1H)-酮类衍生物，其特征在于：所述衍生物选自Y1、Y2、Y3和Y4中的一种：

4.权利要求1所述的含苯并噻唑的苯并[c,d]吲哚-2(1H)-酮类衍生物的制备方法，包括以下步骤：

②步骤①的原料或中间体b与丙二腈混合反应生成中间体c；

③中间体c与卤代烷烃混合，通过取代反应生成中间体d；

所述中间体b、c、d和卤代烷烃的结构式分别为：

其中n＝2、3或4。

5.权利要求1所述的含苯并噻唑的苯并[c,d]吲哚-2(1H)-酮类衍生物在制备抑制肿瘤细胞生长药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述肿瘤细胞包括乳腺癌MCF-7细胞和人宫颈癌Hela细胞。