CN106367464A - 一种高细胞生物量生产类胡萝卜素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高细胞生物量生产类胡萝卜素的方法，以黄桃罐头下脚料为主要原料，经微波固色、冷冻破碎、生物酶解得到类胡萝卜素含量较高的果汁，调整成分后得到发酵培养基，向其中接种高产类胡萝素的海洋红酵母进行分次接种、变温发酵，使得海洋红酵母最大化增殖，发酵液经超高压均质、真空离心、破乳分离后得到乳状液，乳状液经提取、分离、纯化后得到成品类胡萝卜素，发酵液细胞生物量为38‑52g/L；类胡萝卜素产量为47‑61mg/L。该制备方法简单，周期短、效率高、节省能源、对环境友好，全程采用低温、生物加工技术，降低了生产成本，消除了环境污染隐患，为黄桃的深加工技术领域的可持续发展奠定了坚实的基础，具有积极的经济和社会发展意义。
Description
技术领域
本发明涉及类胡萝卜素的制备，具体涉及一种高细胞生物量生产类胡萝卜素的方法。
背景技术
类胡萝卜素是一组具有抗氧化性的脂溶性色素的总称，其作为人和动物体内的一类重要生物活性物质，具有增强机体免疫力、抗辐射、抗肿瘤和治疗光敏性疾病等重要作用，在食品、化妆品、医药和饲料等行业有着广泛的应用。目前，类胡萝卜素已被FAO、欧共体及WHO等国际组织认定为A类营养色素，而近年来，围绕类胡萝卜素的产业化开发也正在逐步形成。
类胡萝卜素的工业化生产方法可以采用化学合成法或植物提取法。化学合成类胡萝卜素不仅技术复杂，而且其作为食品添加剂使用会影响食品的味道，降低人体吸收的比例，同时还存在一定的副作用。因此，伴随着人们崇尚绿色食品的心理日益增强，近年来越来越多的学者将研究方向转向天然色素的开发和利用。由于从植物中提取类胡萝卜素的传统制备工艺具有较高的成本和操作复杂性，因此，类胡萝卜素的工业化生产受到了巨大的限制。利用微生物发酵生产类胡萝卜素，不仅成本低廉，工艺简单，而且能够保证产品的优质和稳产，因此，利用微生物生产类胡萝卜素是生物资源型类胡萝卜素来源的主要途径。
目前，已报道的能产生类胡萝卜素的微生物菌株主要是三孢布拉氏霉菌和红酵母，前者已经处于中试和产业化应用阶段，后者则尚处于实验室小试阶段。三孢布拉氏霉菌虽然色素产量高，但是培养工艺复杂，生产周期长，而红酵母生产类胡萝卜素则具有营养要求简单，培养周期短，菌体含有丰富的蛋白质、氨基酸和维生素等可综合利用的优点。
中国专利CN105039484 A公开了一种利用海洋红酵母高产类胡萝卜素和铜发酵培养方法，包括如下：所述海洋红酵母WYN1在含铜培养基中发酵培养高效生产类胡萝卜素，发酵培养基组成为葡萄糖1％，酶解玉米粉1-3％，蛋白胨2.5％，硫酸镁0.02％，磷酸二氢钾0.15％，铜含量150-200mg/L，氯化钠20％，其余为水；初始pH为8，接种3-8％，摇床转速为50-80r/min，24-28℃培养10-15小时后调整温度为16-20℃进行低温静止培养，停止搅拌，pH调整为3-5，保持2-4小时；之后阶梯形升温到24-30℃，pH调整为4.6-5.5，按照2.5％的添加量添加蛋白胨，按照2％的量添加酵母粉；摇床转速为50-100r/min，继续发酵10-15h。
中国专利CN 104130952 A公开了一株胶红酵母及其在发酵生产类胡萝卜素和油脂中的应用。本发明的技术方案要点为：一株胶红酵母菌Rhodotorulamucilaginosa，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CGMCCNo.8926。本发明提供的胶红酵母可用于发酵生产类胡萝卜素和油脂。本发明利用红酵母生产类胡萝卜素并且同时产生油脂，并对生产菌株进行多轮ARTP(常压室温等离子体)诱变，获得产量较高的诱变菌株，对类胡萝卜素和油脂的工业化生产提供有良好的应用前景和经济效益。
有的细菌也能产生类胡萝卜素：中国专利CN 104805168 A公开了一种利用光合细菌微氧发酵快速生产类胡萝卜素的方法：将活化的光合细菌(Rhodobacter sphaeroides)接种至MMS培养基中，好氧培养至OD600为0.6-0.8，然后调节培养条件至微氧，诱导类胡萝卜素快速大量合成，然后进行提取、纯化，利用本发明方法发酵生产类胡萝卜素的时间短，仅需要36小时，且菌体产量高达6g/L，类胡萝卜素的产量和产率分别是8.287mg/L和1911μg/g，具有良好的清除DPPH自由基的能力，IC50约为8μg/mL。
中国专利CN 102732049 B公开一种从微生物菌体中提取制备类胡萝卜素的方法。该方法是微生物菌体发酵结束后，发酵液与菌体分离得到湿菌体，再通过物流管道导入爆破罐中进行高压蒸汽爆破破壁；细胞破碎后的湿菌体脱水，得到菌体碎片形成的滤饼；每千克滤饼加入有机溶媒10～25升，30～55℃搅拌浸提20～50分钟；过滤，得到含类胡萝卜素油脂的有机溶媒提取液；提取液在40～60℃条件下真空浓缩，回收有机溶媒，得到类胡萝卜素油脂，单次提取收率达90％以上。本方法省去传统工艺中的脱水干燥和菌体粉碎工序，工艺流程短、单次提取收率高且用时短、有机溶媒用量减少，能耗和其他成本显著降低。整个过程简单、质量可控，适合于工业化生产应用。
上述公开的专利不论是何种微生物，其发酵制备类胡萝卜素的原料均为常规培养基配料成分，成本较高，且类胡萝素获取率产量和产率都较低，不适合目前低碳生产的环保要求。
中国专利CN 102286594 A公开了一种利用高纤维农副产品发酵生产类胡萝卜素的方法，是将高纤维农副产品原料粉碎处理，与辅料即0～6.0％硫酸铵、和/或0～3.0％磷酸二氢钾、和/或0～1.0％氯化钙和/或0～1.0％硫酸镁混合均匀后润水蒸料；蒸料完成后冷却20～40℃，接粗壮脉纹胞菌，20～40℃下光照培养2～10d；将培养好的培养基或收集孢子干燥后酸法破壁，然后用丙酮或乙酸乙酯浸提类胡萝卜素；对所提色素进行分离、纯化后制成类胡萝卜素成品。本方法具有过程易操作控制，生产成本低，发酵周期短，类胡萝卜素产量高等优点。上述公开的专利发酵周期较长，生产成本高，类胡萝卜素的产量和产率仍不理想。
黄桃的营养十分丰富，它的主要营养成份有：丰富的维生素C和大量的人体所需要的纤维素、胡萝卜素、番茄黄素、红素及多种微量元素。如硒、锌等含量均明显高于其它普通桃子，还含有苹果酸、柠檬酸等成分。常吃黄桃不仅能提供维持大脑功能的热量，还可以调节身体中的脂肪代谢，每天吃两只可以起到通便、降血糖、血脂，抗自由基，祛除黑斑、延缓衰老、提高免疫功能等作用，也能促进食欲，堪称保健水果、养生之桃。容易疲倦的人，在污染环境工作的人、嗜好抽烟的人、从事剧烈运动和高强度劳动的人、长期服药的人都很适合常吃黄桃。
由于黄桃极不耐储存,目前主要以罐头深加工为主，罐头生产的下脚料,如削掉的果皮,挖去的果核及残次果等,占原料重量的30％左右，大部分烂掉,或被扔掉、沤成肥料,有的堆积于厂外造成公害,污染环境且原料浪费很大，同时增加了产品生产成本。一般来说，每百克黄桃果肉含类胡萝卜素约在1-10毫克之间，罐头加工后类胡萝卜素保存率平均为40％左右，其含类胡萝卜素的量的多少也是衡量黄桃罐头品质的指标之一。除了改善工艺尽可能多的保留类胡萝卜素外，添加天然胡萝卜素也是提高黄桃品质的重要手段。黄桃果皮是黄桃罐头的下脚料之一，每百克果皮含还原糖2.4克，总蛋白0.037克，胡萝卜素0.0085克，还含有多种丰富的维生素。具有较好的再综合再利用价值。
目前，还未见以黄桃罐头下脚料为原料发酵制备类胡萝卜素的相关文献或报道。
发明内容
本发明所解决的技术问题是克服现有发酵制备类胡萝素的缺陷，以黄桃罐头下脚料为主要原料，经微波固色、冷冻破碎、生物酶解得到类胡萝卜素含量较高的果汁，调整成分后得到发酵培养基，向其中接种高产类胡萝素的海洋红酵母进行分次接种、变温发酵，使得海洋红酵母最大化增殖，发酵液经超高压均质、真空离心、破乳分离后得到乳状液，乳状液经提取、分离、纯化后得到成品类胡萝卜素。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种高细胞生物量生产类胡萝卜素的方法，包括如下步骤：
1)果汁制备：首先将黄桃罐头下脚料放入微波干燥机中于功率3-5kW、料层厚度2-4cm、105-115℃、干燥2-4min，然后浸泡在质量百分比为10-14％的丝胶肽溶液中10-15min,于-18--22℃冷冻20-40min后立即进行粉碎，冷冻料层厚度3-5cm，粉碎物粒径0.3-0.5mm,接着加入粉碎物质量1-3倍的水，用乳酸调节pH值为3.5-5.5，于室温下在电场强度25-35kV/cm，脉冲时间300-500μs,脉冲频率200-300Hz条件下进行高压脉冲电场处理20-30min；然后于室温在功率150-300W条件下进行微波辐照提取15-20min，同时在功率200-300W,频率30-40KHz条件下进行超声波辅助提取；加入提取液质量3-5％的混合酶，于40-50℃酶解30-50min，过滤，得果汁；
进一步地，所述黄桃罐头下脚料为：黄桃皮、残次黄桃果肉中的任意一种或两种以任意质量比混合；
进一步地，所述混合酶为纤维素酶、蛋白酶、果胶酶、单宁酶按质量比2-4:2-4:1-3:1-3均匀混合；
2)发酵培养基制备：向步骤1)制备的果汁中加入其质量5-9％的保护剂、1-3％的蔗糖、0.5-1.5％的硫酸铵、2-4％的磷酸二氢钾、0.5-1.5％的氯化钙和0.5-1.5％的硫酸镁得发酵培养基；
进一步地，所述保护剂以含有抗冻蛋白、显著提高红酵母抗冷、热应激性、抗病性和免疫力的植物为原料，经高压脉冲电场提取、超声波辅助微波提取和复配酶酶解而制得的，可有效提高发酵过程中红酵母的抗冷热应激能力，提高其增殖能力和活菌存活率，同时可提高活性干红酵母粉在冷冻干燥过程活菌存活率；
优选地，所述保护剂的制备方法，包括如下步骤：将冬黑麦、沙冬青、黄芪、党参、淫羊藿、鱼腥草分别清洗、沥干，按质量比8-10:5-7:4-6:3-5:2-4:1-3均匀混合，加入混合物料质量0.1-1倍的pH值为3.8-4.5的乳酸润湿3-8h,于-18--22℃冷冻1-2h后立即进行粉碎，冷冻料层厚度3-5cm，粉碎物粒径0.5-3mm,接着加入粉碎物质量10-20倍的水，用乳酸调节pH值为3.5-5.5，于室温下在电场强度25-35kV/cm，脉冲时间300-500μs,脉冲频率200-300Hz条件下进行高压脉冲电场处理20-30min；然后于室温在功率150-300W条件下进行微波辐照提取15-20min，同时在功率200-300W,频率30-40KHz条件下进行超声波辅助提取；加入提取液质量2-4％的复配酶，于45-55℃酶解30-50min；酶解液过滤、滤液浓缩、低温粉碎至粒径为0.1-0.3mm即得保护剂；
所述复配酶为纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、单宁酶按质量比3-5:2-4:1-3:1-3:1-2均匀混合；
更优选地，所述微波辐照提取为间歇式提取，即微波辐照10s，间隔20s；
3)发酵、均质破壁：向步骤2)发酵培养基中加入其质量0.2-0.4％的活性干红酵母粉控制温度30-34℃、搅拌转速50-100r/min，恒温发酵12-15h，接着以0.8-1.0℃/min的速率升温至40-42℃,加入发酵培养基质量0.1-0.3％的活性干红酵母粉恒温静止发酵3-5h，最后以0.6-0.8℃/min的速率降温至28-32℃,继续静止发酵15-20h，发酵液依次经40目、80目双联过滤器过滤，滤液经超高压均质机于2-4℃、145-155MPa均质破壁得均质液；
进一步地，所述活性干红酵母粉是以中国专利CN105039484 A公开的海洋红酵母CCTCC No：M 2014592为出发菌按常规方法制备的；
优选地，活性干红酵母粉制备过程中使用的保护剂为步骤2)中制备的保护剂；
4)破乳、分离提取：将均质液置真空离心机中6000-8000r/min真空离心10-15min，自上而下分离得到游离油、乳状液、水解液和固体残渣，将得到的乳状液控制温度为30-50℃，添加乳状液质量0.03-0.05％的生物破乳剂破乳40-60min,破乳后于2000-3000r/min再次真空离心8-12min得到游离油和乳状液，合并所得的游离油另作它用，所得乳状液经提取、分离、纯化后得到成品类胡萝卜素。
进一步地，所述真空离心条件为温度12-18℃、真空度-0.01--0.03MPa；
进一步地，所述生物破乳剂为糖脂类、脂肽类、胞壁结合类生物破乳剂中的一种或几种组合；
优选地，所述生物破乳剂的质量组成为：糖脂类:脂肽类:胞壁结合类＝3-5:2-4:1-3；
优选地，所述糖脂类生物破乳剂为鼠李糖脂、烷基糖苷中的一种或两种组合；
更优选地，所述糖脂类生物破乳剂的质量组成为：鼠李糖脂:烷基糖苷＝4-6:1-2；
按照中国专利CN105039484A所公开的细胞生物量的检测方法及类胡萝卜素的测定方法对上述制备的发酵液中的细胞生物量和乳状液中类胡萝卜素的进行检测：细胞生物量为38-52g/L；类胡萝卜素产量为47-61mg/L。
有益效果：
本发明以黄桃罐头下脚料为原料，首先采用微波干燥在使得下脚料膨化干燥的同时主要是灭酶、固色，最大限度地保留了下脚料的天然色泽和类胡萝卜素的含量，经微波固色后的下脚料天然色泽在后续的加工过程中非常稳定，不会变色、褪色，类胡萝卜素含量相当稳定，损失极低；在含有丝胶肽的水溶液中浸泡复水，可最大限度地减少经冷冻而造成的下脚料活性物质的损失，提高了下脚料有效成分的提取率，同时也为后续变温活性干红酵母发酵奠定了坚实基础；将高压脉冲电场、微波、超声、生物酶解等低温提取技术有机结合，可最大限度地保留下脚料的类胡萝素等生物活性成分含量和营养成分，有效防止加工过程杂菌污染；在发酵培养基中科学复配保护剂，可显著提高海洋红酵母抗冷、热应激性、抗病性和免疫力，使其快速活化、复壮，实现红酵母数量和质量最大化，进而实现类胡萝素的高产化；以高产类胡萝卜素的海洋红酵母为发酵剂，采用变温发酵和分次接种方式可有效缩短延滞期和衰老期时间，大大延长了对数生长期和稳定期，最大限度地获取海洋红酵母增殖和类胡萝卜素的最大积累，提高其增殖能力和活菌存活率；通过超高压均质破壁海洋红酵母细胞，破壁率高，类胡萝素释放量大；将采用真空离心和生物破乳有机结合，显著提高了类胡萝卜素的提取率，提高了原料利用率，降低了提取成本。在提高产品质量和提取率的同时增加了微生物油脂等提取后副产物的种类、产量和附加值，进一步降低了类胡萝卜素的提取成本，杜绝了“三废”的排放，保护了环境，真正实现了低碳生产。
按照中国专利CN105039484A所公开的细胞生物量的检测方法及类胡萝卜素的测定方法对本发明制备的发酵液中的细胞生物量和乳状液中类胡萝卜素的进行检测：细胞生物量为38-52g/L；类胡萝卜素产量为47-61mg/L。
本发明的制备方法简单，周期短、效率高、节省能源、对环境友好，全程采用低温、生物加工技术，有效避免了下脚料中类胡萝卜素、维生素等热敏性营养物质的损失，提高了类胡萝卜素的提取率及生物活性和营养物质含量，提高了产品的产量和质量，降低了生产成本，同时本发明还提供了一种分离得到微生物油脂的方法，具有较好的实用性和先进性。
需要说明的是本发明的技术效果是各个步骤技术特征协同作用的总和，各步骤之间具有一定的内在相关性，并非单个技术特征效果的简单叠加。
还需要说明的是本发明以黄桃罐头下脚料为原料制备类胡萝素，为黄桃的深加工开辟了一条新的捷径，有效减轻了加工企业的负担，显著降低了生产成本，增加了产品的附加值，消除了环境污染隐患，为黄桃的深加工技术领域的可持续发展奠定了坚实的基础，具有积极的经济和社会发展意义。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1
一种利用黄桃皮发酵生产类胡萝卜素的方法，包括如下步骤：
1)果汁制备：首先将黄桃皮放入微波干燥机中于功率4kW、料层厚度3cm、110℃、干燥3min，然后浸泡在质量百分比为12％的丝胶肽溶液中12min,于-20℃冷冻30min后立即进行粉碎，冷冻料层厚度4cm，粉碎物粒径0.4mm,接着加入粉碎物质量2倍的水，用乳酸调节pH值为4.5，于室温下在电场强度30kV/cm，脉冲时间400μs,脉冲频率250Hz条件下进行高压脉冲电场处理25min；然后于室温在功率200W条件下进行微波辐照提取18min，同时在功率250W,频率35KHz条件下进行超声波辅助提取；加入提取液质量4％的混合酶，于45℃酶解40min，过滤，得果汁；
所述混合酶为纤维素酶、蛋白酶、果胶酶、单宁酶按质量比3:3:2:2均匀混合；
2)发酵培养基制备：向步骤1)制备的果汁中加入其质量7％的保护剂、2％的蔗糖、1％的硫酸铵、3％的磷酸二氢钾、1％的氯化钙和1％的硫酸镁得发酵培养基；
所述保护剂的制备方法，包括如下步骤：将冬黑麦、沙冬青、黄芪、党参、淫羊藿、鱼腥草分别清洗、沥干，按质量比9:6:5:4:3:2均匀混合，加入混合物料质量0.5倍的pH值为4.2的乳酸润湿5h,于-20℃冷冻1.5h后立即进行粉碎，冷冻料层厚度4cm，粉碎物粒径2mm,接着加入粉碎物质量15倍的水，用乳酸调节pH值为4.5，于室温下在电场强度30kV/cm，脉冲时间400μs,脉冲频率250Hz条件下进行高压脉冲电场处理25min；然后于室温在功率200W条件下进行微波辐照提取18min，其中，微波辐照10s，间隔20s；同时在功率250W,频率35KHz条件下进行超声波辅助提取；加入提取液质量3％的复配酶，于50℃酶解40min；酶解液过滤、滤液浓缩、低温粉碎至粒径为0.2mm即得保护剂；
所述复配酶为纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、单宁酶按质量比4:3:2:2:1.5均匀混合；
3)发酵、均质破壁：向步骤2)发酵培养基中加入其质量0.3％的活性干红酵母粉控制温度32℃、搅拌转速80r/min，恒温发酵13h，接着以0.9℃/min的速率升温至41℃,加入发酵培养基质量0.2％的活性干红酵母粉恒温静止发酵4h，最后以0.7℃/min的速率降温至30℃,继续静止发酵18h，发酵液依次经40目、80目双联过滤器过滤，滤液经超高压均质机于3℃、150MPa均质破壁得均质液；
所述活性干红酵母粉是以海洋红酵母CCTCC No：M 2014592为出发菌按常规方法制备的；
所述活性干红酵母粉制备过程中使用的保护剂为步骤2)中制备的保护剂；
4)破乳、分离提取：将均质液置真空离心机中7000r/min真空离心12min，自上而下分离得到游离油、乳状液、水解液和固体残渣，将得到的乳状液控制温度为40℃，添加乳状液质量0.04％的生物破乳剂破乳50min,破乳后于2500r/min再次真空离心10min得到游离油和乳状液，合并所得的游离油另作它用，所得乳状液经提取、分离、纯化后得到成品类胡萝卜素；
所述真空离心条件为温度15℃、真空度-0.02MPa；
所述生物破乳剂的质量组成为：糖脂类:脂肽类:胞壁结合类＝4:3:2；
所述糖脂类生物破乳剂的质量组成为：鼠李糖脂:烷基糖苷＝5:1.5。
上述方法制备的发酵液中的细胞生物量和乳状液中类胡萝卜素的进行检测：细胞生物量为52g/L；类胡萝卜素产量为61mg/L。
实施例2
一种利用残次黄桃果肉发酵生产类胡萝卜素的方法，包括如下步骤：
1)果汁制备：首先将残次黄桃果肉切片，放入微波干燥机中于功率3kW、料层厚度2cm、105℃、干燥2min，然后浸泡在质量百分比为10％的丝胶肽溶液中10min,于-18℃冷冻20min后立即进行粉碎，冷冻料层厚度3cm，粉碎物粒径0.3mm,接着加入粉碎物质量1倍的水，用乳酸调节pH值为3.5，于室温下在电场强度25kV/cm，脉冲时间300μs,脉冲频率200Hz条件下进行高压脉冲电场处理20min；然后于室温在功率150W条件下进行微波辐照提取15min，同时在功率200W,频率30KHz条件下进行超声波辅助提取；加入提取液质量3％的混合酶，于40℃酶解30min，过滤，得果汁；
所述混合酶为纤维素酶、蛋白酶、果胶酶、单宁酶按质量比2:2:1:1均匀混合；
2)发酵培养基制备：向步骤1)制备的果汁中加入其质量5％的保护剂、1％的蔗糖、0.5％的硫酸铵、2％的磷酸二氢钾、0.5％的氯化钙和0.5％的硫酸镁得发酵培养基；
所述保护剂的制备方法，包括如下步骤：将冬黑麦、沙冬青、黄芪、党参、淫羊藿、鱼腥草分别清洗、沥干，按质量比8:5:4:3:2:1均匀混合，加入混合物料质量0.1倍的pH值为3.8的乳酸润湿3h,于-18℃冷冻1h后立即进行粉碎，冷冻料层厚度3cm，粉碎物粒径0.5mm,接着加入粉碎物质量10倍的水，用乳酸调节pH值为3.5，于室温下在电场强度25kV/cm，脉冲时间300μs,脉冲频率200Hz条件下进行高压脉冲电场处理20min；然后于室温在功率150W条件下进行微波辐照提取15min，其中，微波辐照10s，间隔20s；同时在功率200W,频率30KHz条件下进行超声波辅助提取；加入提取液质量2％的复配酶，于45℃酶解30min；酶解液过滤、滤液浓缩、低温粉碎至粒径为0.1mm即得保护剂；
所述复配酶为纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、单宁酶按质量比3:2:1:1:1均匀混合；
3)发酵、均质破壁：向步骤2)发酵培养基中加入其质量0.2％的活性干红酵母粉控制温度30℃、搅拌转速50r/min，恒温发酵12h，接着以0.8℃/min的速率升温至40℃,加入发酵培养基质量0.1％的活性干红酵母粉恒温静止发酵3h,最后以0.6℃/min的速率降温至28℃,继续静止发酵15h，发酵液依次经40目、80目双联过滤器过滤，滤液经超高压均质机于2℃、145MPa均质破壁得均质液；
所述活性干红酵母粉是以海洋红酵母CCTCC No：M 2014592为出发菌按常规方法制备的；
所述活性干红酵母粉制备过程中使用的保护剂为步骤2)中制备的保护剂；
4)破乳、分离提取：将均质液置真空离心机中6000r/min真空离心10min，自上而下分离得到游离油、乳状液、水解液和固体残渣，将得到的乳状液控制温度为30℃，添加乳状液质量0.03％的生物破乳剂破乳40min,破乳后于2000r/min再次真空离心8min得到游离油和乳状液，合并所得的游离油另作它用，所得乳状液经提取、分离、纯化后得到成品类胡萝卜素；
所述真空离心条件为温度12℃、真空度-0.01MPa；
所述生物破乳剂的质量组成为：糖脂类:脂肽类:胞壁结合类＝3:2:1；
所述糖脂类生物破乳剂的质量组成为：鼠李糖脂:烷基糖苷＝4:1。
上述方法制备的发酵液中的细胞生物量和乳状液中类胡萝卜素的进行检测：细胞生物量为51g/L；类胡萝卜素产量为58mg/L。
实施例3
一种高细胞生物量生产类胡萝卜素的方法，包括如下步骤：
1)果汁制备：首先将黄桃残次果肉切片，然后与黄桃皮按质量比3:1均匀混合，放入微波干燥机中于功率5kW、料层厚度4cm、115℃、干燥4min，然后浸泡在质量百分比为14％的丝胶肽溶液中15min,于-22℃冷冻40min后立即进行粉碎，冷冻料层厚度5cm，粉碎物粒径0.5mm,接着加入粉碎物质量3倍的水，用乳酸调节pH值为5.5，于室温下在电场强度35kV/cm，脉冲时间500μs,脉冲频率300Hz条件下进行高压脉冲电场处理30min；然后于室温在功率300W条件下进行微波辐照提取20min，同时在功率300W,频率40KHz条件下进行超声波辅助提取；加入提取液质量5％的混合酶，于50℃酶解50min，过滤，得果汁；
所述混合酶为纤维素酶、蛋白酶、果胶酶、单宁酶按质量比4:4:3:3均匀混合；
2)发酵培养基制备：向步骤1)制备的果汁中加入其质量9％的保护剂、3％的蔗糖、1.5％的硫酸铵、4％的磷酸二氢钾、1.5％的氯化钙和1.5％的硫酸镁得发酵培养基；
所述保护剂的制备方法，包括如下步骤：将冬黑麦、沙冬青、黄芪、党参、淫羊藿、鱼腥草分别清洗、沥干，按质量比10:7:6:5:4:3均匀混合，加入混合物料质量1倍的pH值为4.5的乳酸润湿8h,于-22℃冷冻2h后立即进行粉碎，冷冻料层厚度5cm，粉碎物粒径3mm,接着加入粉碎物质量20倍的水，用乳酸调节pH值为5.5，于室温下在电场强度35kV/cm，脉冲时间500μs,脉冲频率300Hz条件下进行高压脉冲电场处理30min；然后于室温在功率300W条件下进行微波辐照提取20min，其中，微波辐照10s，间隔20s；同时在功率300W,频率40KHz条件下进行超声波辅助提取；加入提取液质量4％的复配酶，于55℃酶解50min；酶解液过滤、滤液浓缩、低温粉碎至粒径为0.3mm即得保护剂；
所述复配酶为纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、单宁酶按质量比5:4:3:3:2均匀混合；
3)发酵、均质破壁：向步骤2)发酵培养基中加入其质量0.4％的活性干红酵母粉控制温度34℃、搅拌转速100r/min，恒温发酵15h，接着以1.0℃/min的速率升温至42℃,加入发酵培养基质量0.3％的活性干红酵母粉恒温静止发酵5h，最后以0.8℃/min的速率降温至32℃,继续静止发酵20h，发酵液依次经40目、80目双联过滤器过滤，滤液经超高压均质机于4℃、155MPa均质破壁得均质液；
所述活性干红酵母粉是以海洋红酵母CCTCC No：M 2014592为出发菌按常规方法制备的；
所述活性干红酵母粉制备过程中使用的保护剂为步骤2)中制备的保护剂；
4)破乳、分离提取：将均质液置真空离心机中8000r/min真空离心15min，自上而下分离得到游离油、乳状液、水解液和固体残渣，将得到的乳状液控制温度为50℃，添加乳状液质量0.05％的生物破乳剂破乳60min,破乳后于3000r/min再次真空离心12min得到游离油和乳状液，合并所得的游离油另作它用，所得乳状液经提取、分离、纯化后得到成品类胡萝卜素；
所述真空离心条件为温度18℃、真空度-0.03MPa；
所述生物破乳剂的质量组成为：糖脂类:脂肽类:胞壁结合类＝5:4:3；
所述糖脂类生物破乳剂的质量组成为：鼠李糖脂:烷基糖苷＝6:2。
上述方法制备的发酵液中的细胞生物量和乳状液中类胡萝卜素的进行检测：细胞生物量为45g/L；类胡萝卜素产量为52mg/L。
实施例4
一种利用黄桃皮发酵生产类胡萝卜素的方法，包括如下步骤：
1)果汁制备：首先将黄桃皮放入微波干燥机中于功率3kW、料层厚度4cm、105℃、干燥4min，然后浸泡在质量百分比为10％的丝胶肽溶液中15min,于-18℃冷冻40min后立即进行粉碎，冷冻料层厚度3cm，粉碎物粒径0.5mm,接着加入粉碎物质量1倍的水，用乳酸调节pH值为5.5，于室温下在电场强度25kV/cm，脉冲时间500μs,脉冲频率200Hz条件下进行高压脉冲电场处理30min；然后于室温在功率150W条件下进行微波辐照提取20min，同时在功率200W,频率40KHz条件下进行超声波辅助提取；加入提取液质量3％的混合酶，于50℃酶解30min，过滤，得果汁；
所述混合酶为纤维素酶、蛋白酶、果胶酶、单宁酶按质量比2:4:1:3均匀混合；
2)发酵培养基制备：向步骤1)制备的果汁中加入其质量5％的保护剂、3％的蔗糖、0.5％的硫酸铵、4％的磷酸二氢钾、0.5％的氯化钙和1.5％的硫酸镁得发酵培养基；
所述保护剂的制备方法，包括如下步骤：将冬黑麦、沙冬青、黄芪、党参、淫羊藿、鱼腥草分别清洗、沥干，按质量比8:7:4:5:2:3均匀混合，加入混合物料质量0.1倍的pH值为4.5的乳酸润湿3h,于-22℃冷冻1h后立即进行粉碎，冷冻料层厚度3cm，粉碎物粒径3mm,接着加入粉碎物质量10倍的水，用乳酸调节pH值为5.5，于室温下在电场强度25kV/cm，脉冲时间500μs,脉冲频率200Hz条件下进行高压脉冲电场处理30min；然后于室温在功率150W条件下进行微波辐照提取20min，同时在功率200W,频率40KHz条件下进行超声波辅助提取；加入提取液质量2％的复配酶，于55℃酶解30min；酶解液过滤、滤液浓缩、低温粉碎至粒径为0.3mm即得保护剂；
所述复配酶为纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、单宁酶按质量比3:4:1:3:1均匀混合；
3)发酵、均质破壁：向步骤2)发酵培养基中加入其质量0.2％的活性干红酵母粉控制温度34℃、搅拌转速50r/min，恒温发酵15h，接着以0.8℃/min的速率升温至42℃,加入发酵培养基质量0.1％的活性干红酵母粉恒温静止发酵5h，最后以0.6℃/min的速率降温至28℃,继续静止发酵20h，发酵液依次经40目、80目双联过滤器过滤，滤液经超高压均质机于2℃、155MPa均质破壁得均质液；
4)破乳、分离提取：将均质液置真空离心机中6000r/min真空离心15min，自上而下分离得到游离油、乳状液、水解液和固体残渣，将得到的乳状液控制温度为30℃，添加乳状液质量0.05％的鼠李糖脂破乳40min,破乳后于3000r/min再次真空离心8min得到游离油和乳状液，合并所得的游离油另作它用，所得乳状液经提取、分离、纯化后得到成品类胡萝卜素。
上述方法制备的发酵液中的细胞生物量和乳状液中类胡萝卜素的进行检测：细胞生物量为42g/L；类胡萝卜素产量为48mg/L。
实施例5
一种利用黄桃皮发酵生产类胡萝卜素的方法，包括如下步骤：
1)果汁制备：首先将黄桃皮放入微波干燥机中于功率5kW、料层厚度2cm、115℃、干燥2min，然后浸泡在质量百分比为14％的丝胶肽溶液中10min,于-22℃冷冻20min后立即进行粉碎，冷冻料层厚度5cm，粉碎物粒径0.3mm,接着加入粉碎物质量3倍的水，用乳酸调节pH值为3.5，于室温下在电场强度35kV/cm，脉冲时间300μs,脉冲频率300Hz条件下进行高压脉冲电场处理20min；然后于室温在功率300W条件下进行微波辐照提取15min，同时在功率300W,频率30KHz条件下进行超声波辅助提取；加入提取液质量5％的混合酶，于40℃酶解50min，过滤，得果汁；
所述混合酶为纤维素酶、蛋白酶、果胶酶、单宁酶按质量比4:2:3:1均匀混合；
2)发酵培养基制备：向步骤1)制备的果汁中加入其质量9％的保护剂、1％的蔗糖、1.5％的硫酸铵、2％的磷酸二氢钾、1.5％的氯化钙和0.5％的硫酸镁得发酵培养基；
所述保护剂的制备方法，包括如下步骤：将冬黑麦、沙冬青、黄芪、党参、淫羊藿、鱼腥草分别清洗、沥干，按质量比10:5:6:3:4:1均匀混合，加入混合物料质量1倍的pH值为3.8的乳酸润湿8h,于-18℃冷冻2h后立即进行粉碎，冷冻料层厚度3cm，粉碎物粒径3mm,接着加入粉碎物质量10倍的水，用乳酸调节pH值为5.5，于室温下在电场强度25kV/cm，脉冲时间500μs,脉冲频率200Hz条件下进行高压脉冲电场处理30min；然后于室温在功率150W条件下进行微波辐照提取20min，同时在功率200W,频率40KHz条件下进行超声波辅助提取；加入提取液质量4％的复配酶，于55℃酶解30min；酶解液过滤、滤液浓缩、低温粉碎至粒径为0.3mm即得保护剂；
所述复配酶为纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、单宁酶按质量比5:2:3:1:2均匀混合；
3)发酵、均质破壁：向步骤2)发酵培养基中加入其质量0.4％的活性干红酵母粉控制温度30℃、搅拌转速100r/min，恒温发酵12h，接着以1.0℃/min的速率升温至40℃,加入发酵培养基质量0.3％的活性干红酵母粉恒温静止发酵3h，最后以0.8℃/min的速率降温至28℃,继续静止发酵20h，发酵液依次经40目、80目双联过滤器过滤，滤液经超高压均质机于4℃、145MPa均质破壁得均质液；
4)破乳、分离提取：将均质液置真空离心机中8000r/min真空离心10min，自上而下分离得到游离油、乳状液、水解液和固体残渣，将得到的乳状液控制温度为50℃，添加乳状液质量0.03％的胞壁结合类生物破乳剂破乳60min,破乳后于2000r/min再次真空离心12min得到游离油和乳状液，合并所得的游离油另作它用，所得乳状液经提取、分离、纯化后得到成品类胡萝卜素。
上述方法制备的发酵液中的细胞生物量和乳状液中类胡萝卜素的进行检测：细胞生物量为38g/L；类胡萝卜素产量为47mg/L。
Claims (10)
1.一种高细胞生物量生产类胡萝卜素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)果汁制备：首先将黄桃罐头下脚料放入微波干燥机中于功率3-5kW、料层厚度2-4cm、105-115℃、干燥2-4min，然后浸泡在质量百分比为10-14％的丝胶肽溶液中10-15min,于-18--22℃冷冻20-40min后立即进行粉碎，冷冻料层厚度3-5cm，粉碎物粒径0.3-0.5mm,接着加入粉碎物质量1-3倍的水，用乳酸调节pH值为3.5-5.5，于室温下在电场强度25-35kV/cm，脉冲时间300-500μs,脉冲频率200-300Hz条件下进行高压脉冲电场处理20-30min；然后于室温在功率150-300W条件下进行微波辐照提取15-20min，同时在功率200-300W,频率30-40KHz条件下进行超声波辅助提取；加入提取液质量3-5％的混合酶，于40-50℃酶解30-50min，过滤，得果汁；
所述混合酶为纤维素酶、蛋白酶、果胶酶、单宁酶按质量比2-4:2-4:1-3:1-3均匀混合；
2)发酵培养基制备：向步骤1)制备的果汁中加入其质量5-9％的保护剂、1-3％的蔗糖、0.5-1.5％的硫酸铵、2-4％的磷酸二氢钾、0.5-1.5％的氯化钙和0.5-1.5％的硫酸镁得发酵培养基；
所述保护剂的制备方法，包括如下步骤：将冬黑麦、沙冬青、黄芪、党参、淫羊藿、鱼腥草分别清洗、沥干，按质量比8-10:5-7:4-6:3-5:2-4:1-3均匀混合，加入混合物料质量0.1-1倍的pH值为3.8-4.5的乳酸润湿3-8h,于-18--22℃冷冻1-2h后立即进行粉碎，冷冻料层厚度3-5cm，粉碎物粒径0.5-3mm,接着加入粉碎物质量10-20倍的水，用乳酸调节pH值为3.5-5.5，于室温下在电场强度25-35kV/cm，脉冲时间300-500μs,脉冲频率200-300Hz条件下进行高压脉冲电场处理20-30min；然后于室温在功率150-300W条件下进行微波辐照提取15-20min，同时在功率200-300W,频率30-40KHz条件下进行超声波辅助提取；加入提取液质量2-4％的复配酶，于45-55℃酶解30-50min；酶解液过滤、滤液浓缩、低温粉碎至粒径为0.1-0.3mm即得保护剂；
所述复配酶为纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、单宁酶按质量比3-5:2-4:1-3:1-3:1-2均匀混合；
3)发酵、均质破壁：向步骤2)发酵培养基中加入其质量0.2-0.4％的活性干红酵母粉控制温度30-34℃、搅拌转速50-100r/min，恒温发酵12-15h，接着以0.8-1.0℃/min的速率升温至40-42℃,加入发酵培养基质量0.1-0.3％的活性干红酵母粉恒温静止发酵3-5h，最后以0.6-0.8℃/min的速率降温至28-32℃,继续静止发酵15-20h，发酵液依次经40目、80目双联过滤器过滤，滤液经超高压均质机于2-4℃、145-155MPa均质破壁得均质液；
4)破乳、分离提取：将均质液置真空离心机中6000-8000r/min真空离心10-15min，自上而下分离得到游离油、乳状液、水解液和固体残渣，将得到的乳状液控制温度为30-50℃，添加乳状液质量0.03-0.05％的生物破乳剂破乳40-60min,破乳后于2000-3000r/min再次真空离心8-12min得到游离油和乳状液，合并所得的游离油另作它用，所得乳状液经提取、分离、纯化后得到成品类胡萝卜素。
2.如权利要求1所述的一种高细胞生物量生产类胡萝卜素的方法，其特征在于，步骤1)所述黄桃罐头下脚料为：黄桃皮、残次黄桃果肉中的任意一种或两种以任意质量比混合。
3.如权利要求1所述的一种高细胞生物量生产类胡萝卜素的方法，其特征在于，步骤2)所述微波辐照提取为间歇式提取，即微波辐照10s，间隔20s。
4.如权利要求1所述的一种高细胞生物量生产类胡萝卜素的方法，其特征在于，步骤3)所述活性干红酵母粉是以海洋红酵母CCTCC No：M 2014592为出发菌按常规方法制备。
5.如权利要求4所述的一种高细胞生物量生产类胡萝卜素的方法，其特征在于，所述活性干红酵母粉制备过程中使用的保护剂为步骤2)制备。
6.如权利要求1所述的一种高细胞生物量生产类胡萝卜素的方法，其特征在于，步骤4)所述真空离心条件为温度12-18℃、真空度-0.01--0.03MPa。
7.如权利要求1所述的一种高细胞生物量生产类胡萝卜素的方法，其特征在于，步骤4)所述生物破乳剂为糖脂类、脂肽类、胞壁结合类生物破乳剂中的一种或几种组合。
8.如权利要求7所述的一种高细胞生物量生产类胡萝卜素的方法，其特征在于，步骤4)所述生物破乳剂的质量组成为：糖脂类:脂肽类:胞壁结合类＝3-5:2-4:1-3。
9.如权利要求7或8所述的一种高细胞生物量生产类胡萝卜素的方法，其特征在于，所述糖脂类生物破乳剂为鼠李糖脂、烷基糖苷中的一种或两种组合。
10.如权利要求9所述的一种高细胞生物量生产类胡萝卜素的方法，其特征在于，所述糖脂类生物破乳剂的质量组成为：鼠李糖脂:烷基糖苷＝4-6:1-2。
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