CN106338604A - 用抗ccl25抗体和抗ccr9抗体检测癌症 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种检测受试者体内癌症的方法。所述方法包括：检测从所述受试者获得的生物样本中的一个或多个癌症标记物的表达水平；以及将所述生物样本中的一个或多个癌症标记物的表达水平与所述一个或多个癌症标记物的正常表达水平相比较。所述一个或多个癌症标记物包括CCL25或CCR9，或者，CCL25和CCR9。

Description

用抗CCL25抗体和抗CCR9抗体检测癌症

本申请为“用抗CCL25抗体和抗CCR9抗体检测癌症”发明专利申请的分案申请，母案的国家申请号为“201180067113.8”，PCT国际申请日为2011年12月13日，PCT国际申请号为PCT/US2011/064653。

本申请要求了于2011年12月7日提交的美国专利申请第13/313,705号、于2011年9月29日提交的美国专利申请第13/248,904号、于2011年9月15日提交的美国专利申请第13/233,769号和于2010年12月14日提交的美国专利申请第12/967,273号的优先权。本申请也要求了于2011年12月6日提交的美国专利申请第13/312,343号的优先权。所有上述申请的全部内容在此以引用方式并入本申请。

技术领域

本申请主要涉及癌症(cancer)的检测。特别是，本发明涉及通过使用抗趋化因子和/或抗趋化因子受体抗体来检测癌症的方法。

背景技术

在美国，癌症是导致死亡的原因之一。绝大多数癌症仅开始于一个单独的赘生性细胞。赘生性细胞增殖形成局部“肿瘤”。肿瘤仅仅意味着肿胀；其不必然是癌性的。仅在其位置或开始处生长且不能向远处扩散的肿瘤是良性肿瘤而不是癌症。但是，具有扩散能力(无论实际上是或否)的肿瘤称作恶性肿瘤或者癌症。癌症可以通过血液或者淋巴系统扩散到局部淋巴结并且通过称为转移的过程扩散到较远处。转移的癌症更难治疗，因为其此刻扩散到了许多不同的组织和器官。已经被证实，对于许多类型的癌症，例如，乳腺癌、结肠癌、卵巢癌和前列腺癌，早期治疗提高了存活率。

趋化因子是小的细胞因子样蛋白质的超家族，细胞因子样蛋白质对水解具有抗性，促进新生血管形成或者内皮细胞生长抑制，诱导细胞支架重排，活化或钝化淋巴细胞，并且通过与G蛋白偶联受体的相互作用调节趋向性。趋化因子可以调节表达其受体的宿主细胞的生长和迁移。

趋化因子(C-C基序)配体25(CCL25)，也已知为胸腺表达的趋化因子(TECK)，是属于CC趋化因子家族的小细胞因子。CCL25对胸腺细胞、巨噬细胞和树突细胞具有趋化性。CCL25通过结合趋化因子受体CCR9发挥其作用，并且被认为是对T细胞的发育起到了作用。所产生的人CCL25是一种包含151个氨基酸的蛋白前体。CCL25的基因(scya25)位于人第19号染色体上。

趋化因子(C-C基序)受体9(CCR9)，也已知为GPR 9-6，在胸腺(在未成熟和成熟T细胞上)中高表达，而在淋巴结和脾脏中低表达。CCR9也丰富地存在于消化道中，其表达与肠的T细胞相关。请注意，结合蛋白D6的趋化因子先前已经被称作CCR9，但是这个分子是清道夫受体，而不是真正的(信号)趋化因子受体。

发明内容

本发明的一个方面涉及一种检测受试者癌症的方法。该方法包括：检测从受试者获得的生物样本中的一个或多个癌症标记物的表达水平；以及将生物样本中的一个或多个癌症标记物的表达水平与一个或多个癌症标记物的正常表达水平相比较，其中，生物样本中所述的一个或多个癌症标记物的高于正常的表达水平意味着受试者体内存在癌症，其中，一个或多个癌症标记物的正常表达水平是预定值或者是从与生物样本相同的起源或类型的已知正常非癌细胞的对照样本中获得的，其中，所述癌症为胚细胞瘤、癌(carcinoma)、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖细胞瘤，并且其中一个或多个癌症标记物包括CCL25或CCR9，或者，CCL25和CCR9两者。

本发明的另一方面涉及一种用于检测受试者的癌症的方法。所述方法包括：检测从受试者获得的生物样本中的一个或多个癌症标记物的表达水平；以及将生物样本中的一个或多个癌症标记物的表达水平与一个或多个癌症标记物的正常表达水平相比较，其中，生物样本中所述的一个或多个癌症标记物的高于正常的表达水平意味着受试者体内存在癌症，其中，一个或多个癌症标记物的正常表达水平是预定值或者是从与生物样本相同的起源或类型的已知正常非癌细胞的对照样本中获得的，其中，所述癌症为胚细胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖细胞瘤，并且其中一个或多个癌症标记物包括(1)选自CCL25和CCR9中的一个或多个癌症标记物；和(2)选自CXCL13和CXCR5中的一个或多个癌症标记物和/或选自CXCL16和CXCR6中的一个或多个癌症标记物。

本发明的又一方面涉及一种评价患有癌症的受试者的预后的方法。所述方法包括：确定来自受试者的生物样本中的一个或多个癌症标记物的表达水平；以及将生物样本中的一个或多个癌症标记物的表达水平与一个或多个癌症标记物的对照表达水平相比较，其中，生物样本中的所述的一个或多个癌症标记物相对于对照水平的较高表达水平意味着受试者的预后差，且其中，生物样本中的一个或多个癌症标记物相对于对照水平的较低或相似表达水平意味着受试者的预后良好，其中，差的预后意味着癌症是攻击型的或者侵入型的，其中，所述癌症为胚细胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖细胞瘤，并且其中一个或多个癌症标记物包括CCL25或CCR9，或者CCL25和CCR9两者。

本发明的又一方面涉及一种评价患有癌症的受试者的预后的方法。所述方法包括：检确定来自受试者的生物样本中的一个或多个癌症标记物的表达水平；以及将生物样本中的一个或多个癌症标记物的表达水平与一个或多个癌症标记物的对照表达水平相比较，其中，生物样本中所述的一个或多个癌症标记物相对于对照水平的较高表达水平意味着受试者的预后差，且其中，生物样本中的一个或多个癌症标记物相对于对照水平的较低或相似表达水平意味着受试者的预后良好，其中，差的预后意味着癌症是攻击型的或者侵入型的，其中，所述癌症为胚细胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖细胞瘤，并且其中一个或多个癌症标记物包括：(1)选自CCL25和CCR9中的一个或多个癌症标记物；和(2)选自CXCL13和CXCR5中的一个或多个癌症标记物和/或选自CXCL16和CXCR6中的一个或多个癌症标记物。

本发明的又一方面涉及一种监测受试者的癌症治疗过程的方法。所述方法包括：在治疗过程中或治疗之后，确定从受试者获得的一个或多个生物样本中的一个或多个癌症标记物的表达水平；以及将一个或多个生物样本中的一个或多个癌症标记物的表达水平与一个或多个癌症标记物的对照表达水平相比较，其中，一个或多个癌症标记物的对照水平是受试者体内一个或多个癌症标记物的治疗前的水平，或者预定参考水平，其中，如果一个或多个生物样本中的一个或多个癌症标记物相似于或者低于对照水平，则治疗被认为是有效的，其中，所述癌症为胚细胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖细胞瘤，并且其中一个或多个癌症标记物包括CCL25或CCR9，或者CCL25和CCR9两者。

本发明的又一方面涉及一种监测受试者的癌症治疗过程的方法。所述方法包括：在治疗过程中或治疗之后，确定从受试者获得的一个或多个生物样本中的一个或多个癌症标记物的表达水平；以及将一个或多个生物样本中的一个或多个癌症标记物的表达水平与一个或多个癌症标记物的对照表达水平相比较，其中，一个或多个癌症标记物的对照水平是受试者体内一个或多个癌症标记物的治疗前的水平，或者预定参考水平，其中，如果一个或多个生物样本中的一个或多个癌症标记物相似于或者低于对照水平，则治疗被认为是有效的，其中，所述癌症为胚细胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖细胞瘤，并且其中一个或多个癌症标记物包括：(1)选自CCL25和CCR9中的一个或多个癌症标记物；和(2)选自CXCL13和CXCR5中的一个或多个癌症标记物和/或选自CXCL16和CXCR6中的一个或多个癌症标记物。

本发明的又一方面涉及一种用于检测癌症的试剂盒。所述试剂盒包括：用于检测生物样本中的CCL25和/或CCR9的表达的试剂；以及如何使用所述试剂的说明书，其中，所述试剂包括抗CCL25抗体、抗CCR9抗体、或者抗CCL25抗体和抗CCR9抗体二者。

附图说明

图1显示了乳腺癌组织的CCL25表达。

图2显示了CCL25抑制了顺铂诱导的乳腺癌细胞系生长的减少。

图3A-B显示了CCL25保护乳腺癌细胞免受顺铂诱导的凋亡。

图4A-B显示了乳腺癌细胞系中CCL25-CCR9相互作用导致的PI3K和Akt活化。

图5A-B显示了乳腺癌细胞系的CCL25处理之后的GSK-3β和FKHR的磷酸化。

图6显示了卵巢癌组织的CCR9和CCL25表达。

图7A-B显示了卵巢癌组织的CCL25表达的分析。

图8A-B显示了卵巢癌组织的CCR9表达的分析。

图9A-B显示了卵巢癌细胞系的CCR9和CCL25表达。

图10A-B显示了卵巢癌细胞的缺氧调节的CCR9mRNA和表面蛋白表达。

图11A-B显示了SKOV-3细胞的缺氧介导的和CCL25介导的迁移和侵袭。

图12A-B显示了SKOV-3细胞的CCL25诱导的胶原蛋白酶表达。

图13A-B显示了SKOV-3细胞的CCL25诱导的明胶酶表达。

图14A-B显示了SKOV-3细胞的CCL25诱导的基质降解酶表达。

图15显示了前列腺癌细胞的CCR9表达。

图16A-D显示了前列腺组织的CCR9表达。

图17A-D显示了前列腺癌组织的CCL25表达。

图18显示了正常健康供体或者患有前列腺疾病的患者的血清CCL25水平。

图19A-C显示了小鼠骨髓细胞的CCL25表达。

图20A-B显示了CCR9介导的前列腺癌细胞迁移和侵袭。

图21显示了前列腺癌细胞系的CCL25诱导的活性MMP表达。

图22A-F显示了CCR9基因敲减(knockdown)抑制PC3前列腺癌细胞系的骨转移。

图23显示了肺癌细胞患者的血清CCL25水平。

图24A-C显示了非肿瘤肺和肺癌组织的CCR9表达。

图25A-C显示了结肠癌组织的CCR9-CCL25表达。

具体实施方式

提供如下详细描述以使本领域技术人员实施和使用本发明。为了解释说明的目的，所提及的特定命名提供了对于本发明的彻底理解。但是，很明显，本领域技术人员应该理解，这些具体细节对于实施本发明不是必需的。提供特定应用的描述仅作为示例性实施例。不应认为本发明限于所示实施方式，而应给予与在此所公开的原理和特征相一致的最宽的可能的范围。

除非另有定义，所使用的与本申请有关的科学和技术术语应该具有本领域技术人员常规理解的含义。此外，除非上下文需要，单数术语应该包括复数，并且复数术语应该包括单数。

如在此所使用的，如下术语应该具有下面的含义：

本文所用术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即，包含特异性结合抗原(与抗原发生免疫反应)的抗原结合位点的分子。术语“抗体”使用了广义含义，并且具体地包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示所需的生物活性即可。“特异性结合”或者“与…发生免疫反应”是指，抗体与所需抗原的一个或者多个抗原决定簇反应，并且不会与其它多肽反应(即，结合)或者与其它多肽以非常低的亲和力结合。术语“抗体”也包括抗体片段，所述抗体片段包含全长抗体的一部分，通常是其抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab，Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体；线性抗体；单链抗体(scFv)分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。在本发明的某些实施方式中，合意的是，例如，使用抗体片段，而不是完整抗体，以提高肿瘤穿透性。在这种情况下，合意的是，使用已通过本领域任何已知方式修饰以提高其血清半衰期的抗体片段。

在此所使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同系的抗体的群体获得的抗体，也就是说，除了可以以较小量存在的可能的自然发生的突变，包括所述群体的单个抗体是相同的。在此所述的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体以及这些抗体的片段，在“嵌合”抗体中，重链和/或轻链的一部分与源自特定种或者属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应的序列相同或者同系，而链的其余部分与源自其它种或者属于其它抗体类别或亚类的抗体中相应的序列相同或者同系，只要它们显示所需的生物活性即可(U.S.Pat.No.4,816,567；以及Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。

非人抗体的“人化”形式是包含源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。对于绝大部分，人化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中，将来自受体高变区的残基用来自具有所需特异性、亲和性和/或容量的非人种(供体抗体)(例如，小鼠、大鼠、兔子或者非人灵长动物)的高变区的残基来替代。制备人化抗体和其它嵌合抗体的方法为本领域已知的方法。

“双特异性抗体”是对于至少两个不同抗原具有结合特异性的抗体。在当前情况下，所述结合特异性中的一种是对于CXCL16或CXCR6的。第二结合靶为任何其它抗原，并且有利地为细胞表面蛋白或者受体或受体亚单元。制备双特异性抗体的方法为本领域已知的方法。

“非同性结合抗体(heteroconjugate antibody)”的使用也在本发明的范围内。非同性结合抗体由两种共价结合的抗体组成。例如，这种抗体已经被提出靶向免疫系统细胞至不该有的细胞(美国专利第4,676,980号)。应该注意到，可以利用已知的合成蛋白质化学的方法(包括涉及到交联剂的那些方法)在体外制备抗体。

本文所用的术语“肿瘤”是指通过细胞异常生长形成的赘生物或实体性病变。肿瘤可以是良性的、恶变前的或恶性的。

“原发性肿瘤”为出现在受试者体内第一个位置的肿瘤，并且有别于出现在受试者体内远离原发性肿瘤位置的“转移性肿瘤”。

在此所使用的术语“癌症”是指或解释为以未调节细胞生长为典型特征的哺乳动物的生理病症。示例性癌症包括：癌、黑素瘤、肉瘤、淋巴瘤、白血病、生殖细胞瘤、和胚细胞瘤。这些癌症更具体的实例包括鳞状上皮细胞癌(例如，上皮细胞鳞状上皮细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃(gastric)癌或胃(stomach)癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、泌尿道癌、肝细胞瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌或肾脏癌(kidney or renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、肛门癌、阴茎癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤、脑和头及颈癌、以及相关的转移。

在此所用的术语“癌”是指由变异的上皮细胞或者未知组织发生的变异细胞组成的侵袭性恶性肿瘤，但是其具有与上皮细胞相关的特定分子或者组织特性，例如，细胞角蛋白或者细胞间桥的生成。本申请的示例性的癌包括卵巢癌、阴道癌、子宫颈癌、子宫癌、前列腺癌、肛门癌、直肠癌、结肠癌、胃癌、胰腺癌、胰岛素瘤、腺癌、腺鳞癌、神经内分泌肿瘤、乳腺癌、肺癌、食管癌、口腔癌、脑癌、髓母细胞瘤、神经外胚层瘤、胶质瘤、脑垂体瘤和骨癌。

在此所用的术语“淋巴瘤”是指免疫系统的淋巴细胞的癌症。淋巴瘤通常表现为实体瘤。示例性淋巴瘤包括：小淋巴细胞性淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤、巨球蛋白血症、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、MALT淋巴瘤、结节边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)、滤泡性淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性淋巴瘤、典型性霍杰金淋巴瘤、结节性淋巴细胞为主型霍杰金淋巴瘤、成人T细胞淋巴瘤、结外NK/T细胞淋巴瘤(鼻型)、肠病型T细胞淋巴瘤、肝脾T细胞淋巴瘤、亚顶极NK细胞淋巴瘤、真菌病真菌瘤、塞扎里综合征、原发性侵犯皮肤CD30阳性T细胞淋巴增生性障碍、原发性侵犯皮肤间变性大细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、非特异性外周T细胞淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤。典型性霍杰金淋巴瘤的示例形式包括：结节性硬化型、混合细胞型、富淋巴细胞型和淋巴细胞耗尽型或者淋巴细胞不耗尽型。

在此所使用的术语“肉瘤”为由胚胎中胚层发展成的许多组织之中的一种组织中的变异细胞引起的癌症。因此，肉瘤包括骨、软骨、脂肪、肌肉、血管和造血组织的肿瘤。例如，骨肉瘤来源于骨，软骨肉瘤来源于软骨，脂肪肉瘤来源于脂肪，以及平滑肌肉瘤来源于平滑肌。示例性的肉瘤包括：Askin瘤、葡萄状肉瘤、软骨肉瘤、尤因原始神经外胚叶瘤(Ewing's-PNET)、恶性血管内皮细胞瘤、恶性神经鞘瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤。软组织肉瘤的亚类包括软组织腺泡状肉瘤、血管肉瘤、叶状囊肉瘤、皮肤纤维肉瘤韧带样纤维瘤、结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、上皮样肉瘤、骨外软骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纤维肉瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、神经纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和滑膜肉瘤。

在此所使用的术语“白血病”是指以白细胞异常增加为特征的血液或骨髓的癌症。白血病是覆盖一类疾病谱的广义术语。反过来，其是称为血液肿瘤的更宽泛疾病组的一部分。白血病细分为许多大组；第一分组在白血病的急性和慢性形式之间。急性白血病的特征在于，不成熟血细胞的数量迅速增加。由这些细胞导致的拥挤现象使骨髓不能产生健康血细胞。慢性白血病的特征在于，相对成熟但仍不正常的白细胞过度增长。通常在数月或数年间发展，所述细胞较比正常细胞以快得多的速率产生，从而导致血液中存在许多不正常的白细胞。白血病还通过受感染的细胞来细分。这一分级将白血病分为成淋细胞性白血病或者淋巴细胞性白血病，以及髓细胞性白血病或者骨髓性粒细胞性白血病。在成淋细胞性白血病或者淋巴细胞性白血病中，癌性变化发生在通常持续形成淋巴细胞的髓细胞类型中。在髓细胞性白血病或者骨髓性粒细胞性白血病中，癌性变化发生在通常持续形成红细胞、一些其它类型白细胞和血小板的髓细胞类型中。结合这两种分类方法提供了全部四种主要的分类。在这四种分类中的每一类中，通常存在几种典型的亚类。也有在这种分类法之外的罕见类型。示例性的白血病包括：急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、毛细胞性白血病(HCL)、T细胞前淋巴细胞性白血病、大颗粒淋巴细胞性白血病、少年型粒-单核细胞型白血病、B细胞前淋巴细胞性白血病、Burkitt白血病和成人T细胞性白血病。

在此所使用的术语“黑素瘤”为黑素细胞的癌症或恶性肿瘤。黑素细胞是产生深色色素、黑色素的细胞，其是造成皮肤的颜色的原因。它们主要出现在皮肤中，但是也被发现在身体的其它部位，包括肠和眼睛。黑素瘤分为以下类型和亚型：恶性雀斑样痣、恶性雀斑样痣黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、肢端黑素瘤、黏膜黑素瘤、结节性黑素瘤、息肉状黑素瘤、结缔组织增生性黑素瘤、无黑素性黑素瘤、软组织黑素瘤、具有小痣状细胞的黑素瘤、具有Spitz痣特征的黑素瘤和色素层黑素瘤。

在此所使用的术语“生殖细胞瘤(GCT)”为由生殖细胞获得的赘生物。生殖细胞瘤可以是癌性的或非癌性的肿瘤。生殖细胞通常出现在生殖腺(卵巢和睾丸)的内部。起源于生殖腺外部的生殖细胞瘤可以是由胚胎发育过程中的错误导致的出生缺陷。生殖细胞瘤大概分为两类：生殖细胞瘤的或精原细胞瘤的生殖细胞瘤以及非生殖细胞瘤的或非精原细胞瘤的生殖细胞瘤。示例性的生殖细胞瘤的或精原细胞瘤的生殖细胞瘤包括：生殖细胞瘤、无性细胞瘤和精原细胞瘤。示例性的非生殖细胞瘤的或非精原细胞瘤的生殖细胞瘤包括：胚胎性癌、内胚层窦瘤或卵黄囊瘤(EST,YST)、绒毛膜癌、成熟型畸胎瘤、皮样囊肿、末成熟畸胎瘤、畸胎瘤伴恶变、多胚瘤、性腺胚细胞瘤和混合GCT。

在此所用术语“转移”是指肿瘤或癌从一个器官或部位扩散到其它不邻近的器官或部位。

术语“生物样本”是指从哺乳动物受试对象(优选是，人类受试者)获得的生物材料的样本，其包括组织、组织样本、细胞样本、肿瘤样本、粪便样本和生物液体，例如，血液、血浆、血清、唾液、尿液、脑液或脊髓液、淋巴液和乳头抽吸物。生物样本可以以如下形式获得，例如，组织活检检查，如，吸出活组织检查、刷拭活组织检查、表面活组织检查、针吸活组织检查、钻取活组织检查、切除物活组织检查、切开活组织检查、切取活组织检查和内窥镜活组织检查。在一个实施方式中，所述生物样本为血液、血清或血浆样本。在另一个实施方式中，所述生物样本为唾液样本。在又一个实施方式中，所述生物样本为尿液样本。

生物样本的“分离物”(例如，组织或者肿瘤样本的分离物)是指已经从样本中分开、得到、抽取、纯化或分离的材料或成分(例如，生物材料或成分)，并且优选是基本上没有无需要的成分和/或与生物样本相关的杂质或者污染物。

“组织样本”包括从受试者(优选人类受试者)获得或者移除的组织的部件、切片、部份、块或者碎片。

“肿瘤样本”包括肿瘤的部件、切片、部份、块或者碎片，例如，从受试者(优选人类受试者)获得或者移除的肿瘤，例如，从受试者的组织移除或抽取的肿瘤。肿瘤样本可以从原发性肿瘤或者转移性肿瘤中获得。

用于治疗目的的“哺乳动物”是指任何被分类为哺乳动物的动物，包括人类，非人类灵长类动物，家畜和农场动物，动物园动物，竞技动物，或宠物动物，例如，狗，马，猫，牛等优选地，所述哺乳动物是人。

术语“增加水平”是指高于相关领域中通常定义或使用的正常或对照水平的水平。例如，在组织中免疫染色的增强水平为被本领域普通技术人员认为高于在对照组织中的免疫染色水平的免疫染色水平。

范围可以在此被表示为从“大约”一个特定值和/或至“大约”另一个特定值。当表示这一范围时，另一实施方式包括从一个特定值和/或至另一个特定值。相似地，当通过在值的前面使用“大约”表示为近似值时，应该理解，这一特定值形成另一实施方式。应该进一步理解，每个范围的端点是重要的，其与其它端点有关且不依赖其它端点。也应该理解，存在许多在此所公开的值，并且除了所述值本身每一值也在此公开为“大约”那个特定值。例如，如果公开了值“10”，那么就也公开了“大约10”。也应该理解，当一个值被公开时，那么也公开了“小于或者等于”所述值，“大于或者等于所述值”以及在值之间的可能范围，这正如本领域技术人员能够适当理解的那样。例如，如果公开了值“10”，那么也公开了“小于或者等于10”以及“大于或者等于10”。正如在此所使用的，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即，包括特异性结合抗原的(与抗原免疫反应的)抗原结合位点的分子。

通过测定CCL25和/或CCR9表达或活性检测癌症的方法

CCL25为CCR9趋化因子受体的配体。趋化因子和受体都显示出对癌症转移和侵袭的调节作用。CCL25和CCR9，相比于正常组织，在多种癌组织类型(包括卵巢癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、骨癌和胰腺癌)中局部上调。CCL25水平也在具有那些癌症的受试者的血清中增加。另外，可溶的CCL25趋化因子提高了癌症细胞的体内和体外增殖和转移。

CCR9为G蛋白偶联受体(GPCRs)的趋化因子受体家族的成员，其可以对癌细胞的存活具有多种作用，假定使其免受化疗药物的作用。我们发现，CCR9与CCL25的相互作用调节了基质金属蛋白酶(MMP)表达，并且提高了癌细胞的转移和侵袭潜能。这表示CCR9-CCL25相互作用对癌细胞转移和侵袭有贡献。因此，阻断这个轴线有可能抑制癌细胞转移。

本申请的一个方面涉及一种检测受试者体内癌症存在的方法，该方法包括：检测从所述受试者获得的生物样本中的一个或多个癌症标记物的表达水平；以及将所述生物样本中的一个或多个癌症标记物的表达水平与所述一个或多个癌症标记物的正常表达水平相比较，其中，所述生物样本中的所述的一个或多个癌症标记物的高于正常的表达水平意味着所述受试者体内存在癌症，其中，所述一个或多个癌症标记物的所述正常表达水平是预定值或者是从与所述生物样本相同的起源或类型的已知正常非癌细胞的对照样本中获得的，并且其中，所述癌症为胚细胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖细胞瘤，并且其中所述一个或多个癌症标记物包括CCL25或CCR9，或者，CCL25和CCR9两者。

在一个实施方式中，所述一个或多个癌症标记物包括：(1)CCL25或CCR9，或者CCL25和CCR9两者，以及(2)CXCL13或CXCR5，或者CXCL13和CXCR5两者。在另一个实施方式中，所述一个或多个癌症标记物包括：(1)CCL25或CCR9，或者CCL25和CCR9两者，以及(2)CXCL16或CXCR6，或者CXCL16和CXCR6两者。

在另一个实施方式中，所述一个或多个癌症标记物包括：(1)CCL25或CCR9，或者CCL25和CCR9两者，(2)CXCL13或CXCR5，或者CXCL13和CXCR5两者，以及(3)CXCL16或CXCR6，或者CXCL16和CXCR6两者。在另一个实施方式中，所述一个或多个癌症标记物包括：(1)CCL25或CCR9，或者CCL25和CCR9两者，和/或(2)CXCL13或CXCR5，或者CXCL13和CXCR5两者，和/或(3)CXCL16或CXCR6，或者CXCL16和CXCR6两者，以及(4)一个或多个其它癌症标记物。

在又一个实施方式中，所述一个或多个其它癌症标记物包括：(1)CCL25或CCR9，或者CCL25和CCR9两者，以及(2)选自CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL24、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CCL27、CCL28、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CCR11、XCL1、XCL2、XCR1、CX3CR1、CX3CL1、HER2、RNA结合基序3("RBM3")、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异抗原(PSA)、嗜铬粒素A(chromgranin A,CGA)、脱氢表雄酮(DHEA)神经元特异性烯醇酶(NSE)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、催乳激素、B7-H3、成纤维细胞激活蛋白α(seprase)多肽、抗p53、骨桥蛋白、铁蛋白、溶血磷脂酰胆碱、驱动蛋白家族成员4A(KIF4A)、神经正五聚蛋白I(NPTX1)和成纤维细胞生长因子受体1致癌基因配偶体(FGFR1OP)蛋白中的一个或多个癌症标记物。

在另一个实施方式中，所述癌症为乳腺癌，并且其中所述一个或多个癌症标记物包括(1)CCL25或CCR9，或者CCL25和CCR9两者，以及(2)选自CCL1、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CXCL12、CXCL13、CXCL16、CX3CL1、CCR2、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CX3CR1、HER2、RBM3和CEA中的一个或多个癌症标记物。

在另一个实施方式中，所述癌为前列腺瘤，并且，其中所述一个或多个癌症标记物包括(1)CCL25或CCR9，或者CCL25和CCR9两者，以及(2)选自CCL1、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CXCL12、CXCL13、CXCL16、CX3CL1、CCR2、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CX3CR1、PSA、CEA、CGA、DHEA、NSE、PAP、催乳激素和B7-H3中的一个或多个癌症标记物。

在又一个实施方式中，所述癌为结肠直肠癌，并且其中，所述一个或多个癌症标记物包括(1)CCL25或CCR9，或者CCL25和CCR9两者，以及(2)选自CCL1、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CXCL12、CXCL13、CXCL16、CX3CL1、CCR2、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CX3CR1、成纤维细胞激活蛋白α多肽、抗p53、骨桥蛋白和铁蛋白中的一个或多个癌症标记物。

在又一个实施方式中，所述癌为卵巢癌，并且其中，所述一个或多个癌症标记物包括(1)CCL25或CCR9，或者CCL25和CCR9两者，以及(2)选自CCL1、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CXCL12、CXCL13、CXCL16、CX3CL1、CCR2、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CX3CR1、癌症抗原125(CA-125)、HE-4、OVX-1巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和溶血磷脂酰胆碱中的一个或多个癌症标记物。

在又一个实施方式中，所述癌为肺癌，并且其中，所述一个或多个癌症标记物包括(1)CCL25或CCR9，或者CCL25和CCR9两者，以及(2)选自CCL1、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL25、CXCL12、CXCL13、CXCL16、CX3CL1、CCR2、CCR7、CCR8、CCR9、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CX3CR1、驱动蛋白家族成员4A(KIF4A)、神经正五聚蛋白I(NPTX1)、成纤维细胞生长因子受体1致癌基因配偶体(FGFR1OP)蛋白和CEA中的一个或多个癌症标记物。

在又一个实施方式中，所述癌为胰腺癌或者胃癌，并且其中，所述一个或多个癌症标记物包括(1)CCL25或CCR9，或者CCL25和CCR9两者，以及(2)选自CCL1、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CXCL12、CXCL13、CXCL16、CX3CL1、CCR2、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CX3CR1和CEA中的一个或多个癌症标记物。

在又一个实施方式中，所述癌为脑癌、脑垂体瘤或者骨癌，并且其中，所述一个或多个癌症标记物进一步包括选自CCL1、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CXCL12、CXCL13、CXCL16、CX3CL1、CCR2、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR5、CXCR6和CX3CR1中的一个或多个癌症标记物。

在一些其他实施方式中，所述生物样本为血浆样本、唾液样本或者尿液样本。

在本申请的上下文中，术语“检测”意欲包括预测和可能性分析。本方法意欲用于临床以做出关于癌症治疗方案的决定，包括治疗介入、例如疾病阶段的诊断标准(、以及疾病检测和监护。根据本申请，可以提供检查受试者状况的中间结果。这种中间结果可以与附加信息结合以帮助医生、护士或其他从业者以诊断受试者患有所述疾病。或者，本发明可以用于检测从受试者获得的组织内的癌细胞，并且提供给医生有用的信息以诊断受试者患有所述疾病。所述受试者优选为人，但是也可以包括其他哺乳动物，例如，非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马和牛。

评价患有癌症的受试者的预后的方法

本申请用于检测癌症的方法也可以用于通过将得自受试者的生物样本中的一个或多个癌症标记物的表达水平与参考样本的表达水平相比较来评价患有癌症的受试者的预后。

因此，本申请的另一方面涉及一种用于评价患有癌症的受试者的预后的方法，所述方法包括：确定从所述受试者获得的生物样本中的一个或多个癌症标记物的表达水平；以及将所述生物样本中的所述一个或多个癌症标记物的表达水平与所述一个或多个癌症标记物的对照表达水平相比较，其中，相对于所述对照水平，在生物样本中的所述一个或多个癌症标记物的较高表达水平意味着所述受试者的预后差，其中，相对于所述对照水平，在所述生物样本中的所述一个或多个癌症标记物的较低或相似的表达水平意味着所述受试者的预后良好，其中差的预后意味着所述癌症是攻击型的或者侵袭型的，其中所述癌症为胚细胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖细胞瘤，并且其中所述一个或多个癌症标记物包括CCL25或CCR9，或者，CCL25和CCR9两者。

在一个实施方式中，所述一个或多个癌症标记物进一步包括CXCL13或CXCR5，或者CXCL13和CXCR5两者。在另一个实施方式中，所述一个或多个癌症标记物进一步包括CXCL16或CXCR6，或者CXCL16和CXCR6两者。

在另一个实施方式中，所述一个或多个癌症标记物进一步包括(1)CXCL13或CXCR5，或者CXCL13和CXCR5两者，和(2)CXCL16或CXCR6，或者CXCL16和CXCR6两者。

在另一个实施方式中，所述一个或多个癌症标记物进一步包括选自CXCL13、CXCR5、CXCL16、CXCR6、CCL1、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL27、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、CX3CL1、CCR2、CCR7、CCR8、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR7和CX3CR1中的一个或多个癌症标记物。

或者，在生物样本中的一个或多个癌症标记物的水平可以在疾病阶段谱范围内进行测定以评价患者的预后。相比于正常对照水平，一个或多个癌症标记物的表达水平的增加意味着不太合意的预后。相比于正常对照水平，一个或多个癌症标记物的相似表达水平意味着患者的较为合意的预后。

在一些其他的实施方式中，所述生物样本为血浆样本、唾液样本或者尿液样本。

用于监测癌症治疗过程的方法

在某些实施方式中，一个或多个癌症标记物的水平用于监测癌症治疗的过程。在这一方法中，测试生物样本由进行癌症治疗的受试者处提供。优选地，多个测试生物样本是从处于治疗前、治疗中或治疗后的不同时间点的受试者处获得。而后，在治疗后的样本中的癌症标记物的表达水平可以与治疗前的样本中的癌症标记物水平或者与参考样本(例如，正常对照水平)相比较。例如，如果治疗后标记物水平低于治疗前标记物水平，人们可以得出治疗有效的结论。同样地，如果治疗后标记物水平与正常对照标记物水平相似或相同，人们也可以得出治疗有效的结论。

治疗“有效”是指治疗导致癌症标记物水平降低或者受试者的癌症的尺寸、患病率或者转移能力降低。当治疗应用于预防时，“有效”意味着治疗延缓或者阻止了癌症的发生或者减缓了癌症的临床症状。可以使用标准临床方案做出癌症评价。此外，治疗的有效性可以与任何用于诊断或治疗癌症的已知方法相结合进行测定。例如，对癌症进行组织病理学常规诊断或者通过鉴定症状异常(例如，体重减轻和厌食)进行常规诊断。

因此，本申请的另一方面涉及一种用于监测受试者的癌症治疗过程的方法，该方法包括：在所述治疗过程中或治疗之后，确定从所述受试者获得的一个或多个生物样本中的所述一个或多个癌症标记物的表达水平；以及将所述一个或多个生物样本中的所述一个或多个癌症标记物的表达水平与所述一个或多个癌症标记物的对照表达水平相比较，其中，所述一个或多个癌症标记物的所述对照水平是在所述受试者中所述一个或多个癌症标记物的治疗前水平或者预定参考水平，其中，如果在所述一个或多个生物样本中的所述一个或多个癌症标记物相似于或者低于所述对照水平，则所述治疗视为有效，其中所述癌症为胚细胞瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤或生殖细胞瘤，并且其中所述一个或多个癌症标记物包括CCL25或CCR9，或者，CCL25和CCR9两者。

在一个实施方式中，所述一个或多个癌症标记物进一步包括CXCL13或CXCR5，或者CXCL13和CXCR5两者。在又一个实施方式中，所述一个或多个癌症标记物进一步包括CXCL16或CXCR6，或者CXCL16和CXCR6两者。

在一个实施方式中，所述一个或多个癌症标记物进一步包括(1)CXCL13或CXCR5，或者CXCL13和CXCR5两者，和(2)CXCL16或CXCR6，或者CXCL16和CXCR 6两者。

在又一个实施方式中，所述一个或多个癌症标记物进一步包括选自CXCL13、CXCR5、CXCL16、CXCR6、CCL1、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL27、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、CX3CL1、CCR2、CCR7、CCR8、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR7和CX3CR1中的一个或多个癌症标记物。

癌症标记物

在此所使用的术语“癌症标记物”是指或者描述的是一种多肽或多核苷酸，其单独的表达水平或者与其它多肽或多核苷酸联合的表达水平与癌症或者癌症的预后相关。这种相关性可能涉及多肽或多核苷酸的增加或减小的表达。例如，多肽或者多核苷酸的表达指示癌症，或者多肽或者多核苷酸的表达的缺乏可以与癌症患者差的预后有关。

术语“癌症标记物的表达水平”可以以转录水平测量(在该情况下测定多核苷酸的存在和/或数量)，或者以翻译水平测量(在该情况下测定多肽的存在和/或数量)。癌症标记物表达可以通过使用任何适合的方法表征。

所述癌症标记物的实例包括CCL25、CCR9和其它趋化因子及趋化因子受体，例如，CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL24、CCL27、CCL28、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR10、CCR11、XCL1、XCL2、XCR1、CX3CR1、CX3CL1、RNA结合基序3("RBM3")、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、嗜铬粒素A(CGA)、脱氢表雄酮(DHEA)、神经元特异性烯醇酶(NSE)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、催乳激素、B7-H3、成纤维细胞激活蛋白α多肽、抗p53、骨桥蛋白、铁蛋白、溶血磷脂酰胆碱、驱动蛋白家族成员4A(KIF4A)、神经正五聚蛋白I(NPTX1)和成纤维细胞生长因子受体1致癌基因配偶体(FGFR1OP)蛋白。

在一个实施方式中，在本发明中所使用的癌症标记物选自黑素瘤标记物组，所述黑素瘤标记物组包括CCL25、CCR9、CXCL13、CXCR5、CXCL16、CXCR6、CCL27、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、CX3CL1、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR4、和CX3CR1。在黑素瘤组中的标记物可以用于检测黑素瘤或者预测患有黑素瘤的受试者的预后。

在一个实施方式中，上述癌症标记物选自癌标记物组，所述癌标记物组包括CCL25、CCR9、CXCL13、CXCR5、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CXCL12、CXCL16、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR6和CX3CR1。在癌标记物组中标记物可以用于检测癌或者预测患有癌的受试者的预后。

在另一个实施方式中，上述癌症标记物选自乳腺癌标记物组，所述乳腺癌标记物组包括CCL25、CCR9、CXCL13、CXCR5、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CXCL12、CXCL16、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR6、CX3CR1、HER2、RNA结合基序3("RBM3")和癌胚抗原(CEA)。在乳腺癌组中的标记物可以用于检测乳腺癌或者预测患有乳腺癌的受试者的预后。

在另一个实施方式中，上述癌症标记物选自前列腺癌标记物组，所述前列腺癌标记物组包括CCL25、CCR9、CXCL13、CXCR5、CXCL16、CXCR6、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CXCL12、CCR7、CCR8、CXCR4、CX3CR1、PSA、CEA、CGA、DHEA、NSE、PAP、催乳激素和B7-H3。在乳腺癌组中的标记物可以用于检测前列腺癌或者预测患有前列腺癌的受试者的预后。

在另一个实施方式中，上述一个或多个癌症标记物选自结肠直肠癌标记物组，所述结肠直肠癌标记物组包括CCL25、CCR9、CXCL13、CXCR5、CXCL16、CXCR6、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CXCL12、CCR7、CCR8、CXCR4、CX3CR1、成纤维细胞激活蛋白α多肽、抗p53、骨桥蛋白和铁蛋白。在所述结肠直肠癌组中的标记物可以用于检测结肠直肠癌或者预测患有结肠直肠癌的受试者的预后。

在另一个实施方式中，上述癌症标记物选自卵巢癌标记物组，所述卵巢癌标记物组包括CCL25、CCR9、CXCL13、CXCR5、CXCL16、CXCR6、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CXCL12、CCR7、CCR8、CXCR4、CX3CR1、癌症抗原125(CA-125)、HE-4、OVX-1巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和溶血磷脂酰胆碱。在卵巢癌组中的标记物可以用于检测卵巢癌或者预测患有卵巢癌的受试者的预后。

在另一个实施方式中，上述癌症标记物选自肺癌标记物组，所述肺癌标记物组包括CCL25、CCR9、CXCL13、CXCR5、CXCL16、CXCR6、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CXCL12、CCR7、CCR8、CXCR4、CX3CR1、驱动蛋白家族成员4A(KIF4A)、神经正五聚蛋白I(NPTX1)、成纤维细胞生长因子受体1致癌基因配偶体(FGFR1OP)蛋白和CEA。在肺癌组中的标记物可以用于检测肺癌或者预测患有肺癌的受试者的预后。

在另一个实施方式中，上述一个或多个癌症标记物选自胰腺癌或者胃癌标记物组，所述胰腺癌或者胃癌标记物组包括CCL25、CCR9、CXCL13、CXCR5、CXCL16、CXCR6、CCL1、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CXCL12、CCR7、CCR8、CXCR4、CX3CR1和CEA。在胰腺癌组中的标记物可以用于检测胰腺癌或者胃癌，或者预测患有胰腺癌受试者的预后。

在另一个实施方式中，上述一个或多个癌症标记物选自脑癌、脑垂体瘤、骨癌、胰腺癌(pancratic cancer)或者胃癌标记物组，所述标记物组包括选自CCL1、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CXCL12、CXCL13、CXCL16、CX3CL1、CCR2、CCR7、CCR8、CXCR4、CXCR5、CXCR6和CX3CR1中的一种或多种癌症标记物。

检测方法

所述癌症标记物的表达可以以转录水平(即，mRNA的量)或者翻译水平(即，蛋白的量)来测定。在某些实施方式中，通过定量RT-PCR、RNA印迹法或者本领域技术人员已知的其他方法，以mRNA水平测定癌症标记物的表达。在其它实施方式中，通过使用抗癌标记物抗体，例如抗CCL25和抗CCR9抗体、抗CXCL13和抗CXCR5抗体、以及抗CXCL16和抗CXCR6抗体，用ELISA、蛋白质印迹或者其他类型的免疫检测方法，在蛋白水平上测定癌症标记物的表达。

在某些实施方式中，抗CCL25和/或抗CCR9抗体包括与CCL25肽或CCR9肽特异性结合的抗体。所述CCL25肽包括，但不限于，由选自LAYHYPIGWAVL(SEQ ID NO:116)、KRHRKVCGNPKSREVQRAMKLLDARNKVFAKLHH(SEQ ID NO:117)、FEDCCLAYHYPIGWAVLRRA(SEQ IDNO:118)、IQEVSGSCNLPAAIFYLPKRHRKVCGN(SEQ ID NO:119)、AMKLLDAR(SEQ ID NO:120)、KVFAKLHHN(SEQ ID NO:121)、QAGPHAVKKL(SEQ ID NO:122)、FYLPKRHRKVCGNP(SEQ ID NO:123)YLPKRHRKVCGNPK(SEQ ID NO:124)、LPKRHRKVCGNPKS(SEQ ID NO:125)、PKRHRKVCGNPKSR(SEQ ID NO:126)、CGNPKSREVQRAMK(SEQ ID NO:127)、GNPKSREVQRAMKL(SEQ ID NO:128)、KFSNPISSSKRNVS(SEQ ID NO:129)、PKSREV(SEQ ID NO:130)、LHHNTQT(SEQ ID NO:131)和SSSKRN(SEQ ID NO:132)中的一个或多个序列组成的肽，或者含有选自LAYHYPIGWAVL(SEQ ID NO:116)、KRHRKVCGNPKSREVQRAMKLLDARNKVFAKLHH(SEQ ID NO:117)、FEDCCLAYHYPIGWAVLRRA(SEQ ID NO:118)、IQEVSGSCNLPAAIFYLPKRHRKVCGN(SEQ IDNO:119)、AMKLLDAR(SEQ ID NO:120)、KVFAKLHHN(SEQ ID NO:121)、QAGPHAVKKL(SEQ IDNO:122)、FYLPKRHRKVCGNP(SEQ ID NO:123)YLPKRHRKVCGNPK(SEQ ID NO:124)、LPKRHRKVCGNPKS(SEQ ID NO:125)、PKRHRKVCGNPKSR(SEQ ID NO:126)、CGNPKSREVQRAMK(SEQ ID NO:127)、GNPKSREVQRAMKL(SEQ ID NO:128)、KFSNPISSSKRNVS(SEQ ID NO:129)、PKSREV(SEQ ID NO:130)、LHHNTQT(SEQ ID NO:131)和SSSKRN(SEQ ID NO:132)中的一个或多个序列的肽。CCR9肽的实例包括，但不限于，由选自QFASHFLPP(SEQ ID NO:133)、AAADQWKFQ(SEQ ID NO:134)、TFMCKVVNSM(SEQ ID NO:135)、IAICTMVYPS(SEQ ID NO:136)和VQTIDAYAMFISNCAVSTNIDICFQ(SEQ ID NO:137)中一个或多个序列组成的肽，或者含有选自QFASHFLPP(SEQ ID NO:133)、AAADQWKFQ(SEQ ID NO:134)、TFMCKVVNSM(SEQ ID NO:135)、IAICTMVYPS(SEQ ID NO:136)和VQTIDAYAMFISNCAVSTNIDICFQ(SEQ ID NO:137)中的一个或多个序列的肽。

在另一个实施方式中，抗CXCL13和/或抗CXCR5抗体包括与CXCL13肽或者CXCR5肽特异性结合的抗体。所述CXCL13肽的实例包括，但不限于，由选自RSSSTLPVPVFKRKIP(SEQID NO:45)、PRGNGCPRKEIIVWKK(SEQ ID NO:46)、LPRGNGCPRKEIIVWK(SEQ ID NO:47)、QILPRGNGCPRKEIIV(SEQ ID NO:48)、ILPRGNGCPRKEIIVW(SEQ ID NO:49)、RIQILPRGNGCPRKEI(SEQ ID NO:50)、RGNGCPRKEIIVWKKN(SEQ ID NO:51)、KRSSSTLPVPVFKRKI(SEQ ID NO:52)、IQILPRGNGCPRKEII(SEQ ID NO:53)、DRIQILPRGNGCPRKE(SEQ ID NO:54)、RKRSSSTLPVPVFKRK(SEQ ID NO:55)、RCRCVQESSVFIPRRF(SEQ ID NO:56)、GNGCPRKEIIVWKKNK(SEQ ID NO:57)、CVQESSVFIPRRFIDR(SEQ ID NO:58)、IDRIQILPRGNGCPRK(SEQ ID NO:59)、LRCRCVQESSVFIPRR(SEQ ID NO:60)、FIDRIQILPRGNGCPR(SEQ ID NO:61)、RCVQESSVFIPRRFID(SEQ ID NO:62)、CRCVQESSVFIPRRFI(SEQ ID NO:63)、QESSVFIPRRFIDRIQ(SEQ ID NO:64)、RFIDRIQILPRGNGCP(SEQ ID NO:65)、VQESSVFIPRRFIDRI(SEQ ID NO:66)、ESSVFIPRRFIDRIQI(SEQ ID NO:67)、SLRCRCVQESSVFIPR(SEQ ID NO:68)、NGCPRKEIIVWKKNKS(SEQ ID NO:69)、PQAEWIQRMMEVLRKR(SEQ ID NO:70)、RRFIDRIQILPRGNGC(SEQ ID NO:71)、LRKRSSSTLPVPVFKR(SEQ ID NO:72)、VQESSVFIPRR(SEQ ID NO:73、EWIQRMMEVLRKRSSSTLPVPVFKRK(SEQ ID NO:74)、KKNK(SEQ ID NO:75)、RKRSSS(SEQ ID NO:76)、RGNGCP(SEQ ID NO:77)、VYYTSLRCRCVQESSVFIPRR(SEQ ID NO:78)、DRIQILP(SEQ IDNO:79)、RKEIIVW(SEQ ID NO:80)和KSIVCVDPQ(SEQ ID NO:81)中一个或多个序列组成的肽，或者含有选自RSSSTLPVPVFKRKIP(SEQ ID NO:45)、PRGNGCPRKEIIVWKK(SEQ ID NO:46)、LPRGNGCPRKEIIVWK(SEQ ID NO:47)、QILPRGNGCPRKEIIV(SEQ ID NO:48)、ILPRGNGCPRKEIIVW(SEQ ID NO:49)、RIQILPRGNGCPRKEI(SEQ ID NO:50)、RGNGCPRKEIIVWKKN(SEQ ID NO:51)、KRSSSTLPVPVFKRKI(SEQ ID NO:52)、IQILPRGNGCPRKEII(SEQ ID NO:53)、DRIQILPRGNGCPRKE(SEQ ID NO:54)、RKRSSSTLPVPVFKRK(SEQ ID NO:55)、RCRCVQESSVFIPRRF(SEQ ID NO:56)、GNGCPRKEIIVWKKNK(SEQ ID NO:57)、CVQESSVFIPRRFIDR(SEQ ID NO:58)、IDRIQILPRGNGCPRK(SEQ ID NO:59)、LRCRCVQESSVFIPRR(SEQ ID NO:60)、FIDRIQILPRGNGCPR(SEQ ID NO:61)、RCVQESSVFIPRRFID(SEQ ID NO:62)、CRCVQESSVFIPRRFI(SEQ ID NO:63)、QESSVFIPRRFIDRIQ(SEQ ID NO:64)、RFIDRIQILPRGNGCP(SEQ ID NO:65)、VQESSVFIPRRFIDRI(SEQ ID NO:66)、ESSVFIPRRFIDRIQI(SEQ ID NO:67)、SLRCRCVQESSVFIPR(SEQ ID NO:68)、NGCPRKEIIVWKKNKS(SEQ ID NO:69)、PQAEWIQRMMEVLRKR(SEQ ID NO:70)、RRFIDRIQILPRGNGC(SEQ ID NO:71)、LRKRSSSTLPVPVFKR(SEQ ID NO:72)、VQESSVFIPRR(SEQID NO:73、EWIQRMMEVLRKRSSSTLPVPVFKRK(SEQ ID NO:74)、KKNK(SEQ ID NO:75)、RKRSSS(SEQ ID NO:76)、RGNGCP(SEQ ID NO:77)、VYYTSLRCRCVQESSVFIPRR(SEQ ID NO:78)、DRIQILP(SEQ ID NO:79)、RKEIIVW(SEQ ID NO:80)和KSIVCVDPQ(SEQ ID NO:81)中的一个或多个序列的肽。所述CXCR5肽的实例包括，但不限于，由选自TSLVENHLCPATE(SEQ ID NO:82)、EGSVGWVLGTFLCKT(SEQ ID NO:83)、LPRCTFS(SEQ ID NO:84)、LARLKAVDNT(SEQ ID NO:85)和MASFKAVFVP(SEQ ID NO:86)中的一个或多个序列组成的肽，或者含有选自TSLVENHLCPATE(SEQ ID NO:82)、EGSVGWVLGTFLCKT(SEQ ID NO:83)、LPRCTFS(SEQ ID NO:84)、LARLKAVDNT(SEQ ID NO:85)和MASFKAVFVP(SEQ ID NO:86)中的一个或多个序列的肽。

抗CXCL16和/或抗CXCR6抗体包括与CXCL16肽或者CXCR6肽特异性结合的抗体。所述CXCL16肽的实例包括，但不限于，由选自AAGPEAGENQKQPEKN(SEQ ID NO:87)、SQASEGASSDIHTPAQ(SEQ ID NO:88)、STLQSTQRPTLPVGSL(SEQ ID NO:89)、SWSVCGGNKDPWVQEL(SEQ ID NO:90)、GPTARTSATVPVLCLL(SEQ ID NO:91)、SGIVAHQKHLLPTSPP(SEQ ID NO:92)、RLRKHL(SEQ ID NO:93)、LQSTQRP(SEQ ID NO:94)、SSDKELTRPNETT(SEQ ID NO:95)、AGENQKQPEKNA(SEQ ID NO:96)、NEGSVT(SEQ ID NO:97)、ISSDSPPSV(SEQ ID NO:98)、CGGNKDPW(SEQ ID NO:99)、LLPTSPPISQASEGASSDIHT(SEQ IDNO:100)、STQRPTLPVGSLSSDKELTRPNETTIHT(SEQ ID NO:101)、SLAAGPEAGENQKQPEKNAGPTARTSA(SEQ ID NO:102)、TGSCYCGKR(SEQ ID NO:103)、DSPPSVQ(SEQ ID NO:104)、RKHLRAYHRCLYYTRFQLLSWSVCGG(SEQ ID NO:105)、WVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKHLLPTSPPISQ(SEQ ID NO:106)、SDIHTPAQMLLSTLQ(SEQ IDNO:107)、RPTLPVGSL(SEQ ID NO:108)、TAGHSLAAG(SEQ ID NO:109)、GKRISSDSPPSVQ(SEQID NO:110)和KDPWVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKH(SEQ ID NO:111)中一个或多个序列组成的肽，或者含有选自AAGPEAGENQKQPEKN(SEQ ID NO:87)、SQASEGASSDIHTPAQ(SEQ ID NO:88)、STLQSTQRPTLPVGSL(SEQ ID NO:89)、SWSVCGGNKDPWVQEL(SEQ ID NO:90)、GPTARTSATVPVLCLL(SEQ ID NO:91)、SGIVAHQKHLLPTSPP(SEQ ID NO:92)、RLRKHL(SEQ IDNO:93)、LQSTQRP(SEQ ID NO:94)、SSDKELTRPNETT(SEQ ID NO:95)、AGENQKQPEKNA(SEQ IDNO:96)、NEGSVT(SEQ ID NO:97)、ISSDSPPSV(SEQ ID NO:98)、CGGNKDPW(SEQ ID NO:99)、LLPTSPPISQASEGASSDIHT(SEQ ID NO:100)、STQRPTLPVGSLSSDKELTRPNETTIHT(SEQ ID NO:101)、SLAAGPEAGENQKQPEKNAGPTARTSA(SEQ ID NO:102)、TGSCYCGKR(SEQ ID NO:103)、DSPPSVQ(SEQ ID NO:104)、RKHLRAYHRCLYYTRFQLLSWSVCGG(SEQ ID NO:105)、WVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKHLLPTSPPISQ(SEQ ID NO:106)、SDIHTPAQMLLSTLQ(SEQ IDNO:107)、RPTLPVGSL(SEQ ID NO:108)、TAGHSLAAG(SEQ ID NO:109)、GKRISSDSPPSVQ(SEQID NO:110)和KDPWVQELMSCLDLKECGHAYSGIVAHQKH(SEQ ID NO:111)中的一个或多个序列的肽。所述CXCR6肽的实例包括，但不限于，由选自HQDFLQFSKV(SEQ ID NO:112)、AGIHEWVFGQVMCK(SEQ ID NO:113)、PQIIYGNVFNLDKLICGYHDEAI(SEQ ID NO:114)和YYAMTSFHYTIMVTEA(SEQ ID NO:115)中的一个或多个序列组成的肽，或者含有选自HQDFLQFSKV(SEQ ID NO:112)、AGIHEWVFGQVMCK(SEQ ID NO:113)、PQIIYGNVFNLDKLICGYHDEAI(SEQ ID NO:114)和YYAMTSFHYTIMVTEA(SEQ ID NO:115)中的一个或多个序列的肽。

在一个实施方式中，所述抗体与固体载体结合。所述“固体载体”的意思是本申请的抗体能够附着或连接的非水性基质。在此包括的固体相的实例包括部分或完全由玻璃(例如，可控多孔玻璃)、多糖(例如，琼脂糖)、聚丙烯酰胺、硅酮、和塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯和聚乙烯醇)形成的那些固体相。

酶联免疫吸附测定法

在某些实施方式中，通过使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测癌症标记物，所述酶联免疫吸附测定法通常通过使用涂覆抗体的测试板或测试孔进行。常规使用的ELISA测定使用夹层免疫测定(sandwich immunoassay)或者竞争结合免疫测定(competitivebinding immunoassay)。

简要地说，夹层免疫测定是使用结合在抗原或配体上不同位点的两种抗体的方法。将对抗原具有高度特异性的第一抗体附着在固体表面。然后加入抗原，接着加入称为检测抗体的第二抗体。所述检测抗体将抗原结合至与第一抗体相比不同的表位。结果，抗原“夹在”两种抗体之间。抗体对于抗原的亲合力通常是免疫测定灵敏性的主要决定因素。随着抗原浓度的增大，检测抗体的量也增大，导致更高的测量响应。夹层-结合测定的标准曲线具有正相性斜率。为了定量化结合的程度，可以使用不同的报告因子。典型地，酶附着在第二抗体，所述第二抗体必须是在与第一抗体相比不同的种类中产生的(即，如果第一抗体是兔子抗体，那么第二抗体将是来自羊、鸡等的抗兔子的抗体，而不是兔子抗体)。将酶的底物加入到形成色度法读数(readout)作为检测信号的反应中。生成信号与样本中存在的目标抗原的量成比例。

用于测定结合事件的抗体连接的报告因子决定了检测方式。分光光度测量板读数器(reader)可以用于色度法检测。最近已经开发出许多种类的报告因子用以增大免疫测定法的灵敏性。例如，已经开发的化学发光底物，其进一步放大了信号，并且可以在发光板读数器上读出。此外，其中用荧光体标记抗体替代测定法的酶步骤的荧光读数正变得十分受欢迎。这种读数随后通过使用荧光板读数器测定。

竞争性结合测定是基于标记或未标记配体对于有限数量的抗体结合位点的竞争。竞争性抑制测定常常用于测定较小的分析物。这些测定也在抗体与分析物的配对不存在时使用。在竞争结合ELISA中使用唯一抗体。这是由于如果两种抗体试图结合到非常小的分子上会产生空间位阻。将固定量的标记配体(示踪物)和可变量的未标记配体用抗体孵育。根据质量作用定律，标记配体的量是标记配体和未标记配体的总浓度的函数。随着未标记配体浓度的增大，越少的标记配体结合到抗体上，并且测定到的响应减少。这样，信号越低，在样本中存在越多的未标记分析物。竞争结合测定的标准曲线具有负向性斜率。

微珠

在某些其它的实施方式中，癌症标记物通过使用涂覆抗体的微珠检测。在一些实施方式中，所述微珠为磁珠。在其它实施方式中，所述珠用荧光染料进行内部颜色编码，并且所述珠的表面用抗癌标记物抗体(例如，抗CCL25抗体或者抗CCR9抗体)加以标记，所述抗癌标记物抗体可以结合测试样本中的癌症标记物。依次地，所述癌症标记物以荧光标记直接标记或者以结合到荧光标记上的抗标记物抗体间接标记。因此，存在两种颜色来源，一种源自珠，另一种来自荧光标记。或者，珠可以以不同尺寸内部编码。

通过使用来自两种染料的不同荧光强度的混合物以及不同尺寸的珠，测定可以测量高达数百种不同的癌症标记物。在测定过程中，包含颜色/尺寸编码珠的混合物、荧光标记抗标记物抗体和样本被组合并且注入到使用精密流控技术以调节珠的仪器中。所述珠随后经过激光，并且基于其颜色或者尺寸，进行分选或者测定颜色强度，其经处理获得对于各反应的定量数据。

当用荧光团直接标记样本时，系统可以读出或定量珠上唯一的荧光而不会除去溶液中非结合的荧光团。测定可以通过区别不同颜色或尺寸的珠来多元化。当样本直接需要未标记样本时，实时测试是可实现的。标准测定步骤包括用抗标记物抗体涂覆的珠孵育样本，用生物素或荧光团标记的第二抗体孵育，以及检查荧光信号。可以在珠上(通过加入对于生物素化的第二抗体的抗生物素蛋白链菌素-荧光团轭合物)显影荧光信号，并且通过珠分析仪读出。依靠珠表面上固定的抗标记物，基于珠的免疫测定法可以是夹层型或者竞争型免疫测定法。

测试条

在一些其它的实施方式中，液体生物样本中的癌症标记物通过使用测试条来检测。所述测试条典型地包括流体不可渗透外壳和具有一个或多个检测区域的流体可渗透“条”。在一个实施方式中，各检测区域包括与生物样本中癌症标记物结合的干燥的结合试剂。在其它实施方式中，干燥的结合试剂为标记结合试剂。在另一实施方式中，测试条可以进一步包括控制区域以指示测定样本已经令人满意地进行，也就是说，试剂存在于测试条中，以及指示它们在实验操作过程中变得可移动且已经沿着流体路径输送。所述控制区域也指示了设备中试剂能够进行免疫化学相互作用，证实了设备的化学完整性。当考虑在某一温度范围内的烘干条件下设备的存放和运输时，这是重要的。控制区域典型地放置在检测区域的下游，并且可以例如，包括用于标记结合试剂的固定结合试剂。标记结合试剂可以存在于控制区域和检测区域的可移动形式上游区。所述标记结合试剂可以与对于癌症标记物的标记结合试剂相同或不同。

在一个实施方式中，所述测试条包括与一个或多个流动路径连接且在一个或多个流动路径上游的流体多孔样本接收器。所述多孔样本接收器可以是与所有测定方法通用的。这样，用于设备的常规样本应用区域的流体样本能沿着一个或多个流动路径流动到各检测区域。所述多孔样本接收器可以在外壳中提供，或者可以至少部分地延伸到所述外壳的外部，并且可以用于例如收集体液。所述多孔样本接收器也可以充当流体贮存器。多孔样本接收部件由任何吸水材料、多孔材料或者能够迅速吸收液体纤维材料制成。材料的孔隙率可以单向的(即，整体或者主要平行于部件的轴运行的孔或者纤维)或者是多向的(全向的，以致部件具有非晶海绵状结构)。可以使用多孔塑料材料，例如，聚丙烯、聚乙烯(优选非常高分子量)、聚偏二氟乙烯、乙烯乙酸乙烯酯、丙烯腈和聚四氟乙烯。其它合适的材料包括玻璃纤维。

如果需要，吸收剂“储槽”可以提供在载体材料的远端。吸收剂储槽可以包括，例如，华特门(Whatman)3MM色层分析纸，并且应该提供足够的吸收能力以使任何非结合标记结合试剂从测试区域洗出。作为与这一储槽的可选方案，具有延伸超过所述检测区域的多孔固材料长度是足够的。

在将结合试剂用于检测区域之后，可以处理多孔固相材料的残留物以封闭任何残留结合部位。封闭可以通过例如用蛋白质(例如，牛血清白蛋白或乳蛋白质)或者用聚乙烯醇或乙醇胺或其结合的处理方式来实现。为了帮助标记结合试剂的自由移动，当多孔载体用样本润湿时，多孔载体可以进一步包括如蔗糖或乳糖的糖和/或其它物质(例如，聚乙烯醇(PVA)或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。这种材料可以例如作为水溶液储存在将要使用标记结合试剂的区域。这些材料可以作为第一用途用于多孔载体，随后用于标记物；或者这些材料可以与标记物混合并用于多孔载体或两者的组合。这种材料可以存放在标记结合试剂的上游或者存放在标记结合试剂处。

或者，多孔载体在制造时可以不被封闭；作为替代的是，用于封闭多孔载体的组件被包括在多孔载体的材料上游中。当润湿所述测试条时，用于封闭多孔载体的组件被移动，并且封闭组件流进且通过多孔载体，随着流动的进行实施封闭。封闭组件包括蛋白质，例如BSA和酪蛋白；以及聚合物，例如PVP、PVA；以及糖和去污剂，例如Triton-X100。封闭部件可以存在于大孔载体材料中。

所述干燥结合试剂可以提供在设置在包含检测区域的多孔载体材料上游的多孔载体材料上。上游多孔载体材料可以是大孔的。大孔载体材料应该是低蛋白结合的或者非蛋白结合的，或者应该是通过例如BSA或PVA的试剂可以容易封闭的，以在大孔体已经用液体样本润湿后最小化非特异性结合且有助于标记试剂的自由移动。如果需要，大孔载体材料可以用表面活性剂或溶剂预处理，以使其更为亲水且促进液体样本的迅速吸收。用于大孔载体的合适材料包括塑料材料，例如聚乙烯和聚丙烯；或者其它材料，例如纸或玻璃纤维。在标记结合试剂用可检测颗粒标记的情况下，大孔体可以具有大于颗粒标记物的最大粒度至少10倍的孔径。越大的孔径给予越好的标记试剂释放。作为对于大孔载体的替代物，标记结合试剂可以设置在检测区域上游设置的非多孔物质上，所述非多孔物质形成部分流动路径。在另一实施方式中，测试条可以进一步包括用于接收流体样本的样本接收部件。所述样本接收部件可以从外套延伸。

所述外壳可以由流体不可渗透材料构成。所述外壳也合意地将环境光排除在外。当从设备的外部透入设备内部时，如果少于10％，优选少于5％，且更优选少于1％的可见光入射，则认为所述外壳基本上排除环境光。光不可透过合成塑料材料，例如包含适当阻光颜料的聚碳酸酯、ABS、聚苯乙烯(polystyrene)、聚苯乙烯(polystyrol)、高密度聚乙烯或者聚丙烯，为用于构成外壳的合适选择。开孔可以设置在外壳的外部，其与在外壳内部的设置于内部空间内的测定相联通。或者，开孔可以用于使多孔样本接收器从外壳向外壳外的位置延伸。

微点阵

在其它实施方式中，所述癌症标记物通过在其表面上包含固定的癌症标记物特异性抗体的蛋白质微点阵检测。所述微点阵可以用于“夹层”测定，其中在微点阵上的抗体捕捉测试样本中的癌症标记物并且捕捉的标记物用与捕捉的标记物特异性结合的标记第二抗体检测。在优选实施方式中，第二抗体为生物素化的或者酶标记的。所述检测通过随后用抗生蛋白链菌素-荧光团轭合物(用于荧光检测)或者酶底物(用于色度法检测)孵育来实现。

典型地，微点阵测定包括多个孵育步骤，包括用样本孵育和用多种试剂(例如，第一抗体、第二抗体、报告试剂等)孵育。在孵育步骤之间，也需要重复清洗。在一个实施方式中，微点阵测定在需要唯一一个或两个孵育的快速测定方式中进行。也可以想象到，可检测免疫复合物(例如，捕捉的癌症标记物/抗标记物抗体/指示物复合物)的形成可以通过使蛋白质微点阵暴露于样本和所有所需试剂的混合物而在单一的孵育步骤中实现。在一个实施方式中，所述第一抗体和第二抗体为相同的抗体。

在另一实施方式中，蛋白质点阵提供了竞争免疫测定。简要的说，在标记癌症标记物标准物的存在下，包含固定的抗标记物抗体的微点阵用测试样本孵育。标记癌症标记物在测试样本中与未标记癌症标记物竞争以结合至固定的抗原特异性抗体。在这一竞争机构中，测试样本中特异性癌症标记物浓度的增大将导致标记癌症标记物标准物与固定的抗体结合的降低，并且因此减少源自标记物的信号强度。

所述微点阵可以以手工、半自动或者自动模式进行。手工模式是指手工操作所述测定步骤，包括将试剂和样本递送至微点阵上，样本孵育和微点阵清洗。半自动模式是指手工操作将样本和试剂递送至微点阵上，同时自动运行孵育和清洗步骤。在自动模式中，三个步骤(样本/试剂递送、孵育和清洗)可以通过具有小键盘的计算机或者集成实验电路板单元控制。例如，所述微点阵可以通过ProteinArray Workstation(PerkinElmer LifeSciences,Boston,Mass.)或者Assay 1200^TM.Workstation(Zyomyx,Hayward,Calif.)进行。利用荧光、色度法和化学发光法的扫描器可以用于检测微点阵信号并且捕捉微点阵图像。基于微点阵的定量法也可以通过其它方式，如质谱法和表面等离子体共振(surfaceplasma resonance)实现。捕捉的微点阵图像可以通过独立的图像分析软件来进行分析或者利用图像采集和分析软件包来进行分析。例如，抗原微点阵的定量化可以利用基于荧光PMT的扫描器--ScanArray 3000(General Scanning,Watertown,Mass.)或者基于色度法的CCD扫描器VisionSpot(Allied Biotech,Ijamsville,Md.)来实现。典型地，图像分析将包括数据采集和用单独的软件包制备分析报告。为了加速从捕捉图像到生成分析报告的整个分析过程，包括图像捕捉、图像分析和报告生成的所有分析步骤可以被限制在一个软件包和/或由一个软件包控制。这一统一的控制系统将提供图像分析和以使用者友好的方式生成分析报告。

植入性生物传感器

在其它实施方式中，癌症标记物通过使用植入性生物传感器检测。生物传感器为产生作为生物学相互作用结果的电子信号的电子设备。在一个实施方式中，生物传感器使用抗体、受体、核酸或者与癌症标记物结合的结合对的其它部件，其通常是结合对的其它部件。生物传感器可以与血液样本一起使用以确定癌症标记物的存在而不需要对于自动化免疫测定系统通常需要的样本制备和/或分离步骤。

在一个实施方式中，传感器为纳米尺度的设备。所述传感系统包括联接至纳米线的生物识别元件和能够确定与纳米线有关的性质的检测器。所述生物识别元件为结合对的一个部件(例如，癌症标记物的受体或者抗癌症标记物抗体)，其中被测定的所述癌症标记物为结合对的另一部件。优选地，纳米线传感器包括半导体纳米线，其具有在其上形成的外部表面以形成栅极；和第一端，其与导体电接触以形成源极；以及第二端，其与导体电接触以形成漏极。在一个实施方式中，传感器为场效应晶体管，其包括由绝缘材料形成的基板、源极、漏极和设置在其间的具有连接至纳米线表面上的生物识别元件的半导体纳米线。当结合事件发生在生物识别元件和其特异性结合配偶体之间时，可检测的变化以场效应晶体管的电流电压特性发生。

在另一实施方式中，传感系统包括传感器阵列。在阵列中的一个或多个传感器与防止相关传感器和周围环境相互作用的防护部件联接。在选定的时间，所述防护部件可以是不起作用的，因此允许传感器开始运行以与周围流体或组织相互作用，以便所述生物识别元件可以与其结合对的其它部件相互作用(如果存在那个配对部件)。

在另一实施方式中，所述防护部件由导电材料形成，所述导电材料能够氧化，是生物相容、生物可吸收的，并且可以在施加电势时在例如血液的溶液中溶解。例如，传感器可以形成在覆盖了例如生物相容金属或电侵蚀聚合物的导电材料的基板的孔中。在另一个实施方式中，所述防护部件通过使用在预定时间段内溶解的材料来形成。

质谱法

在其它实施方式中，所述癌症标记物通过使用质谱(MS)，例如，MALDI/TOF(飞行时间)、SELDI/TOF、液相色谱-质谱(LC-MS)、气相色谱-质谱(GC-MS)、高性能液相色谱-质谱(HPLC-MS)、毛细管电泳-质谱、核磁共振波谱法或者串联质谱法(如，MS/MS、MS/MS/MS、ESI-MS/MS等)来检测。

质谱法是本领域所已知的，并且已经被用于定量和/或鉴定生物分子，例如蛋白质。而且，质谱技术已经发展为允许分离的蛋白质至少部分重新测序。在某些实施方式中，使用气相离子分光光度计。在其它实施方式中，使用激光脱附/离子化质谱以分析样本。调制解调器激光解析/离子化质谱(“LDI-MS”)可以在两个主要变化中实施：基质辅助激光解析/离子化(“MALDI”)质谱和界面增大激光解析/离子化(“SELDI”)。在MALDI中，分析物与包含基质的溶液混合，并且将一滴液体置于基板的表面上。然后，基质溶液与生物分子共结晶。将基板插入进质谱中。激光能量指向基板表面，其中，其使生物分子解吸附且离子化而没有显著破坏它们。在SELDI中，基板表面可以被修饰以便其成为解析过程的积极参与者。在一个实施方式中，基板用选择性结合目的蛋白质的吸附剂和/或捕捉试剂衍化。在另一实施方式中，表面用在利用激光撞击时不会解吸附的能量吸收分子衍化。在另一实施方式中，表面用结合目的蛋白质且包括在施加激光时断裂的光解键的分子衍化。在这些方法中的每种中，衍化试剂通常被局限于施加样本的基板表面上的特定位置。两种方法可以通过以下方法组合使用：例如，使用SELDI亲合表面以捕捉分析物并且将包含基质的液体加入到捕捉到的分析物中以提供能量吸收材料。

检测癌症标记物的存在将典型地包括检测信号强度。这又能够反映结合到基板的多肽的数量和特性。例如，在某些实施方式中，来自第一样本和第二样本的光谱的峰值的信号强度可以被比较(例如，视觉上、通过计算机分析等)以确定特定生物分子的相对量。例如Biomarker Wizard程序(Ciphergen Biosystems,Inc.,Fremont,Calif.)的软件程序可以用于帮助分析质谱。所述质谱和其技术对于本领域技术人员是已知的。

本领域技术人员理解的是，质谱仪的任何部件(例如，解析源、质量分析仪、检测等)和各种样本制品可以与在此所述的或本领域已知的其它适合的部件或制品结合。例如，在一些实施方式中，对照样本可以包括重原子(例如，¹³C)从而允许测试样本与在相同的质谱运行中已知的对照样本相混合。

在一个优选实施方式中，使用激光解吸飞行时间(TOF)质谱仪。在激光解吸质谱中，具有结合标记物的基板引入到进口系统。通过来自电离源的激光解吸附所述标记物并将其离子化成气相。生成的离子通过离子光学装置收集，然后在飞行时间质量分析仪中，离子通过短高压场加速并且漂移进高真空室。在高真空室的远端，加速离子在不同时间撞击灵敏检测器表面。由于飞行时间是离子质量的函数，所以在离子形成和离子检测器冲击之间逝去的时间可以用于鉴定特定质量分子的存在或缺乏以获得配料比。

在一些实施方式中，部分地，通过用计算机执行算法，确定存在于第一或第二样本中的一个或多个癌症标记物的相对量。所述算法鉴定在第一质谱和第二质谱中的至少一个峰值。随后，所述算法将质谱的第一质谱的峰值信号强度与第二质谱的峰值信号强度相比较。相对信号强度为存在于第一样本和第二样本中的癌症标记物的量的指示。可以分析包含已知量的癌症标记物的标准物作为第二样本以较好地定量化第一样本中存在的生物分子的量。在某些实施方式中，也可以确定在第一样本和第二样本中的癌症标记物的身份。

标准值、特异性和灵敏性的测定

在本发明中，可以对癌症标记物(例如CCL25的血液浓度)的标准表达水平进行统计学测定。例如，可以测定在健康个体中的CCL25的血液浓度以在统计学上确定CCL25的标准血液浓度。当可以采集统计学上充足的群体时，在自平均值的两倍或三倍标准差(S.D.)的范围内的值通常用作标准值。因此，相当于平均值+2x.S.D.或者平均值+3x S.D.的值可以用作标准值。如理论上所述设定的标准值分别包括90％和99.7％健康个体。

或者，标准值也可以基于癌症患者体内的实际表达水平(例如，CCL25血液浓度)设定。通常，设定这种方法的标准值使假阳性的百分比最小化，并且从符合能够使检测灵敏性最大化的条件的值的范围内选择。在此，假阳性的百分比是指在健康个体中CCL25的血液浓度被判定为高于标准值的患者的百分比。相反，在健康个体中，CCL25的血液浓度被判定为低于标准值的患者的百分比指示特异性。也就是说，假阳性和特异性的总和总是1。检测灵敏性是指：在已经确定存在癌症的个体群体内所有患者中，CCL25的血液浓度被判定为高于标准值的患者的百分比。

如在此所使用的，术语“测试灵敏性”是筛选实验能够鉴定真实疾病的能力，并且特征也在于是具有较少假阴性的高灵敏性的测试，另外还是不依赖于疾病患病率的测试。所述测试灵敏性计算为真阳性/所测试的受袭患者总和，表达为百分比。

术语“测试特异性”为在疾病不存在时确切阴性，具有高特异性和较少假阳性、不依赖于疾病患病率的筛选实验。测试特异性计算为真阴性/所测试的未受袭个体，表达为百分比。

术语“PPV”(阳性预测值)为患有疾病的测试阳性的患者的百分比，并且因此评价阳性测试的可靠性。计算：

1.PPV＝(真阳性)/(真阳性+假阳性)。

术语“NPV”(阴性预测值)是指未患有疾病的测试阴性的患者的百分比，并且由此评价阴性测试的可靠性。计算：

2.NPV＝(真阴性)/(真阴性+假阴性)。

正如上面显示的关系所示，作为用于评价检测准确性的指数的灵敏性、特异性、阳性预测值和阴性预测值的各值依据用于判定CCL25的血液浓度水平的标准值而变化。

通常设定标准值以便假阳性比较低，并且灵敏性较高。但是，如从上述所示的关系中显示的，在假阳性比值与灵敏性之间存在权衡。也就是说，如果标准值减小，检测灵敏性增大。但是，由于假阳性比值也增大，则很难符合具有“低假阳性比值”的条件。考虑到这些情况，例如，给予如下预测结果的值可以被选择作为本发明中的优选标准值：(1)假阳性比值为50％或更小的标准值(也就是说，特异性不小于50％的标准值)；以及(2)灵敏性不小于20％的标准值。

通过使用接收器工作特性(ROC)曲线设定标准值。ROC曲线为显示在纵轴上的检测灵敏性和在横轴上的假阳性比值(也就是“1--特异性”)的曲线图。通过绘制灵敏性和假阳性比值的变化来获得ROC曲线，其是在使测定癌症标记物(例如，CCL25)的血液浓度的高/低程度的标准值连续变化之后获得的。

用于获得ROC曲线的“标准值”为临时用于统计分析的值。用于获得ROC曲线的“标准值”通常可以在允许覆盖所有可选标准值的范围内连续变化。例如，所述标准值可以在分析群体中最小和最大测量的血液CCL25值之间变化。

基于获得的ROC曲线，将用于本发明的优选标准值可以从符合上述条件的范围内选择。或者，标准值可以基于ROC曲线来选择，所述ROC曲线通过从包括绝大多数测量的血液CCL25的范围中改变标准值而制作。

用于检测癌症的试剂盒

本申请的另一方面涉及一种用于检测癌症的试剂盒，其包括：用于确定生物样本中CCL25和/或CCR9表达的试剂；以及如何使用所述试剂的说明书，其中，所述试剂包括抗CCL25抗体、抗CCR9抗体、或者抗CCL25抗体和抗CCR9抗体二者。

在特定实施方式中，所述试剂盒进一步包括用于确定生物样本中CXCL13和/或CXCR5表达的试剂；以及如何使用所述试剂的说明书，其中，所述试剂包括抗CXCL13抗体、抗CXCR5抗体、或者抗CXCL13抗体和抗CXCR5抗体二者。在进一步的特定实施方式中，所述试剂盒进一步包括用于确定生物样本中CXCL16和/或CXCR6表达的试剂；以及如何使用所述试剂的说明书，其中，所述试剂包括抗CXCL16抗体、抗CXCR6抗体、或者抗CXCL16抗体和抗CXCR6抗体二者。

在其它特定实施方式中，所述试剂盒进一步包括用于确定生物样本中CXCL16和/或CXCR6表达的试剂；以及如何使用所述试剂的说明书，其中，所述试剂包括抗CXCL16抗体、抗CXCR6抗体、或者抗CXCL16抗体和抗CXCR6抗体二者。

本发明通过如下实施例进一步进行解释，其不应解释为对本申请的限制。在本申请中引用的所有参考文献、专利和公开专利申请以及图和表的内容在此以引用方式并入本文。

具体实施方式

实施例1：各种癌中的CCL25和CCR9表达和活性的体外分析

如在图1中所示，乳腺癌组织表达CCL25。用同种型对照或抗CCL25抗体对乳腺癌组织染色。红紫色显示CCL25染色。具有40X物镜的Aperio ScanScope CS系统捕获数字图像。乳腺癌的典型实例显示了CCL25的免疫强度。

图2证实了CCL25抑制了顺铂诱导的乳腺癌细胞系生长的减少。随着增大顺铂浓度，用0或100ng/ml CCL25加同种型对照或抗CCR9Ab培养MDA-MB-231细胞24小时。通过BrdU合并测定细胞增殖，并且测定重复3次且平行进行三份。星号指示了在CCL25处理的和未处理的BrCa细胞之间的统计学显著性差异(p<0.01)。

图3A-B显示了CCL25保护乳腺癌细胞免受顺铂诱导的细胞凋亡。仅用5mg/ml顺铂或者用0或100ng/ml CCL25加1mg/ml抗人CCR9或同种型对照培养MDA-MB-231细胞24小时(A)。收获细胞并且用锚定蛋白(annexin V)和碘化丙锭(propidium iodide,PI)染色。通过染色的细胞的流式细胞术分析区分凋亡(锚定蛋白阳性)细胞和生活(无荧光)细胞和坏死(PI阳性)细胞。星号指示在CCL25处理的和未处理的乳腺癌细胞之间的统计学显著性差异(p<0.01)。用5mg/ml顺铂或用0或100ng/ml CCL25加1mg/ml的抗人CCR9或同种型对照Ab培养MDA-MB-231细胞系24小时(B)。使用末端脱氧核苷酰酶酸转移酶介导的dUTP切口末端标记(TUNEL)法进行凋亡细胞的检测。用标准荧光过滤盒(520±20nm)，凋亡细胞显示核绿色荧光。星号指示在顺铂CCL25处理的和未处理的乳腺癌细胞系之间的统计学显著性差异(p<0.01)。

图4A-B显示了在乳腺癌细胞系中CCL25-CCR9相互作用的PI3K和Akt活化。在用CCL25、顺铂和特定的激酶抑制剂(渥曼青霉素和PF-573,228)处理之后，测试MDA-MB-231细胞的活化PI3K和Akt的能力。在顺铂和激酶抑制剂存在下，在CCL25刺激之前(0分钟)或者之后(5或10分钟)，用基于快速活化细胞的ELISA定量了原位总的和磷酸化的PI3K和Akt水平。在平行进行三份的3个独立实验中提供活化(磷酸化)的PI3K(A)或Akt(B)与总的PI3K(A)或Akt(B)的比例±SEM。星号指示在未处理的和CCL25处理的细胞和CCL25+顺铂处理的细胞之间的统计学差异。

图5A-B显示了乳腺癌细胞系CCL25处理后的GSK-3β和FKHR磷酸化作用。在用CCL25、顺铂和特定的激酶抑制剂(渥曼青霉素和PF-573,228)处理之后，测试MDA-MB-231细胞的使GSK-3β和FKHR磷酸化的能力。在顺铂和激酶抑制剂存在下，在CCL25刺激之前(0分钟)或者之后(5或10分钟)，用基于快速活化细胞的ELISA定量了原位总的和磷酸化的GSK-3β和FKHR水平。在平行进行三份的3个独立实验中，以±SE的方式提供磷酸化的GSK-3β(A)或FKHR(B)与总的GSK-3β(A)或FKHR(B)的比值。星号指示在未处理的和CCL25处理的细胞和CCL25+顺铂处理的细胞之间的统计学差异(p<0.01)。

图6显示了卵巢癌组织CCR9和CCL25的表达。用同种型对照或者抗CCR9和CCL25抗体对源自非肿瘤的(n＝8)、浆液性腺癌(n＝9)、浆液性乳突状囊腺瘤(n＝1)、子宫内膜样腺癌(n＝5)、粘液腺癌(n＝2)、囊腺瘤(n＝3)、交界性粘液腺癌(n＝1)、透明细胞癌(n＝5)、粒层细胞瘤(n＝3)、无性细胞瘤(n＝3)、移行细胞癌(n＝3)、布伦纳瘤(n＝1)、卵黄囊瘤(n＝4)、腺癌(n＝1)和纤维瘤(n＝2)的卵巢癌组织进行染色。棕(DAB)色显示了CCR9染色并且红紫色显示了CCL25。用具有40X物镜的Aperio ScanScope CS系统捕获各玻片的数字图像。典型的实例显示了CCR9和CCL25的免疫强度。

图7A-B显示卵巢癌组织的CCL25表达的分析。用改进的箱线图(box plot)(A)分析和呈现CCL25表达。在箱线中，下线、中线和上线分别表示第一四分位数(Q1)、中值(Q2)和第三四分位数(Q3)。上和下触须线表示中值±1.5(Q3-Q1)。在下格中指示与非肿瘤的显著性差异。表(B)显示非肿瘤组织(NN)与浆液性腺癌(SA)、子宫内膜样腺癌(EC)、粘液腺癌(MA)、囊腺瘤(C)、交界性粘液腺癌(MBA)、透明细胞癌(CCC)、粒层细胞瘤(GCT)、无性细胞瘤(D)、移行细胞癌(TCC)、布伦纳瘤(BT)、卵黄囊瘤(YST)、腺癌(A)和纤维瘤(F)间的各p值或显著性差异。

图8A-B显示卵巢癌组织的CCR9表达的分析。用改进的箱线图(box plot)(A)分析和呈现CCR9表达。在箱线中，下线、中线和上线分别表示第一四分位数(Q1)、中值(Q2)和第三四分位数(Q3)。上和下触须线表示中值±1.5(Q3-Q1)。在下格中指示与非肿瘤的显著性差异。表(B)显示非肿瘤组织(NN)与浆液性腺癌(SA)、子宫内膜样腺癌(EC)、粘液腺癌(MA)、囊腺瘤(C)、交界性粘液腺癌(MBA)、透明细胞癌(CCC)、粒层细胞瘤(GCT)、无性细胞瘤(D)、移行细胞癌(TCC)、布伦纳瘤(BT)、卵黄囊瘤(YST)、腺癌(A)和纤维瘤(F)之间的各p值或显著性差异。

图9A-B显示卵巢癌细胞系的CCR9和CCL25表达。将卵巢癌细胞用荧光素(FITC)结合的抗CCR9或FITC结合的同种型对照抗体染色并通过FACS分析(A)。卵巢癌细胞用FITC结合的抗CCR9染色，细胞内CCL25用藻红蛋白(PE)结合的抗CCL25抗体染色，以及细胞核用Draq-5染色(B)。归并数据(merged data)显示CCR9在表面表达而CCL25在核中表达。

图10A-B显示卵巢癌细胞的缺氧调节的CCR9mRNA和表面蛋白表达。从处于含氧量正常的条件和含氧量低的条件下的SKOV-3细胞系中分离总RNA，或者从正常的初级卵巢组织中分离总RNA。CCR9mRNA表达的定量RT-PCR分析平行进行三份。转录物的拷贝数被表示为相对于18S rRNA+SE的实际拷贝数(A)。将处于常氧和缺氧的SKOV-3细胞用PE结合的同种型对照抗体(Ab)(实心直方图)或PE结合的抗CCR9单克隆Ab(空心直方图)染色并且通过流式细胞计量术定量(B)。显示PE阳性细胞的平均荧光强度。符号表示在正常组织或同种型对照与OvCa细胞(@)之间或者在含氧量正常的细胞和含氧量低的细胞之间的CCR9表达的统计学上的显著性(p<0.01)差异(*)。

图11A-B显示SKOV-3细胞缺氧介导的和CCL25介导的迁移和侵入。测试SKOV-3细胞的向趋化梯度的CCL25迁移的能力(A)。在迁移实验过程中，在含氧量正常的条件或含氧量低的条件下，使用100ng/ml的CCL25，将细胞与1.0μg/ml小鼠抗CCR9抗体(Ab)或同种型对照Ab共培养。此外，测试SKOV-3细胞的在含氧量低的条件或含氧量正常的条件下应答100ng/ml的CCL25而侵入或转移穿过MatrigelTM基质的能力(B)。在侵入实验过程中，在含氧量正常的条件或含氧量低的条件下，使用使用100ng/ml的CCL25，将细胞与1.0μg/ml的抗CCR9的单克隆抗体共培养。用符号显示迁移或侵入的细胞数(+SE)，该符号表示在CCL25处理的和未处理的含氧量正常的细胞(#)、CCL25处理的和未处理的含氧量低的细胞(@)、或同样地处理的含氧量正常的和含氧量低的细胞(*)之间的显著性(p<0.01)差异。

图12A-B显示SKOV-3细胞的CCL25诱导的胶原酶表达。测试细胞表达胶原酶(MMP-1、MMP-8、和MMP-13)mRNA和活性蛋白质的能力。在含氧量正常的条件或含氧量低的条件下，将SKOV-3细胞单独、使用100ng/ml的CCL25+1μg/ml的同种型对照抗体(Ab)、或者使用CCL25+1μg/ml的小鼠抗CCR9Ab来培养24小时。分离总RNA，并对胶原酶的mRNA表达进行定量RT-PCR分析，并且转录物拷贝数被表示为相对于18S rRNA的实际拷贝数(A)。在条件培养基中通过Fluorokine和Biotrak实验定量活性胶原酶(B)。符号表示在CCL25处理的和未处理的含氧量正常的细胞(#)、CCL25处理的和未处理的含氧量低的细胞(@)、或同样地处理的含氧量正常的和含氧量低的细胞(*)之间的显著性(p<0.01)差异。

图13A-B显示SKOV-3细胞的CCL25诱导的明胶酶表达。测试细胞的表达明胶酶(MMP-2和MMP-9)mRNA和活性蛋白质的能力。在含氧量正常的条件或含氧量低的条件下，将SKOV-3细胞单独、使用100ng/ml的CCL25+1μg/ml的同种型对照抗体(Ab)、或者使用CCL25+1μg/ml的小鼠抗CCR9Ab来培养24小时。分离总RNA，并对明胶酶的mRNA表达进行定量RT-PCR分析，并且转录物拷贝数被表示为相对于18S rRNA的实际拷贝数(A)。在条件培养基中通过Fluorokine和Biotrak实验定量活性明胶酶(B)。符号表示在CCL25处理的和未处理的含氧量正常的细胞(#)、CCL25处理的和未处理的含氧量低的细胞(@)、或同样地处理的含氧量正常的和含氧量低的细胞(*)之间的显著性(p<0.01)差异。

图14A-B显示SKOV-3细胞的CCL25诱导的基质降解酶表达。测试细胞的表达基质降解酶(MMP-3、MMP-10、和MMP-11)mRNA和活性蛋白质的能力。在含氧量正常的条件或含氧量低的条件下，将SKOV-3细胞单独、使用100ng/ml的CCL25+1μg/ml的同种型对照抗体(Ab)、或者使用CCL25+1μg/ml的小鼠抗CCR9Ab来培养24小时。分离总RNA，并对基质降解酶的mRNA表达进行定量RT-PCR分析，并且转录物拷贝数被表示为相对于18S rRNA的实际拷贝数(A)。在条件培养基中通过Fluorokine和Biotrak实验定量活性基质降解酶(B)。符号表示在CCL25处理的和未处理的含氧量正常的细胞(#)、CCL25处理的和未处理的含氧量低的细胞(@)、或同样地处理的含氧量正常的和含氧量低的细胞(*)之间的显著性(p<0.01)差异。

图15显示前列腺癌细胞系的CCR9表达。将前列腺癌细胞系(C4-2B、LNCaP、和PC3)和正常的前列腺细胞(RWPE-1)用FITC结合的抗人CCR9(绿色)和7AAD(核染剂；红色)染色。通过Amnis ImageStream使阳性染色细胞成像和定量。右图显示CCR9染色的平均荧光强度。

图16A-D显示前列腺组织的CCR9表达。组织微阵列(TMA)得自国立卫生研究院(NationalInstitutes of Health(NIH))、国立癌症研究所(National Cancer Institute(NCI))和在伯明翰的阿拉巴马大学并且针对CCR9进行染色。具有40X物镜的Aperio ScanScope系统捕获各载玻片的数字图像。指出前列腺癌(CaP)(A)、匹配的良性前列腺组织(MB)(B)和阴性对照的代表性实例，并且使用ImageScope软件(v.6.25)对扫描和分析的全部组织的CCR9的强度进行定量。图27D显示在MB、良性前列腺增生(BPH)和前列腺癌(PCa)之间的CCR9免疫强度(immunointensity)。星号表示在MB、BPH和PCa组织之间的免疫强度的显著性(p<0.01)差异。

图17A-D显示前列腺癌组织的CCL25表达。内分泌-旁分泌细胞表型的神经内分泌分化频繁地出现在前列腺恶性肿瘤中并且具有潜在的预后和治疗含意。旁泌性细胞表型可被认为是前列腺和前列腺癌中雄激素不敏感的有丝分裂期后的亚群。图17A图示前列腺上皮内瘤变内的旁泌性模式的CCL25的表达。双头箭头指向产生CCL25的多重旁泌性细胞(红色)；棕色箭头指表达CCR9的细胞(棕色)。图17B显示对CCL25染色成红色的细胞。棕色箭头指细胞NSE。图17A和C分别是图17D和B高倍放大图。

图18显示正常的健康供体或患有前列腺疾病的患者的血清CCL25水平。ELISA用于定量来自正常的健康供体、前列腺癌(PCa)、前列腺上皮内瘤(PIN)和良性前列腺增生(BPH)的血清中的CCL25。星号表示与正常的健康供体相比CCL25水平的显著性差异(p<0.05)。

图19A-C显示小鼠骨髓细胞的CCL25表达。将来自非荷瘤(A)小鼠和荷瘤(B)小鼠的骨髓细胞用抽吸装置抽吸并用FITC结合的抗CCL25抗体染色。用Amnis ImageStream定量阳性染色细胞(C)。使用IDEAS软件进行基于图像的分析并且表明在前列腺肿瘤攻击后骨髓细胞的CCL25表达增加1.6倍。

图20A-B显示CCR9介导的前列腺癌细胞迁移(A)和侵入(B)。测试LNCaP细胞、PC3细胞和C4-2b细胞的迁移到无添加(空心柱)、100ng/mL的CCL25(散列柱(hashed bar))或100ng/mL的CCL25+1μg/mL抗CCL25抗体(实心柱)的能力。应答CCL25(其来自用于接种迁移和侵入室的最初的104个细胞)而迁移和侵入的细胞数(±SEM)，显示迁移是CCL25依赖性的并且被抗CCL25抗体封闭抑制。星号表示在无添加与CCL25处理的细胞之间的显著性差异(p<0.01)。

图21显示CCL25诱导的LNCaP、PC3和C4-2b前列腺癌细胞系的活性基质金属蛋白酶(MMP)表达。在没有(空心箱)或具有100ng/mL CCL25(实心箱)的情况下培养细胞24小时。通过MMP活性测定法确定培养上清中MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-10和MMP-11的蛋白水平。星号显示CCL25处理的细胞系与未处理的细胞系相比MMP分泌的显著性(P<0.05)增加或减少。

图22A-F显示CCR9基因敲减(knockdown)对PC3前列腺癌细胞系的骨转移的抑制。用表达萤光素酶-和多西环素(doxycyclene)-可诱导CCR9-特异性shRNA的PC3细胞系攻击小鼠(A、D)。通过心内注射用该细胞系攻击小鼠。随后，小鼠接受饮料中无添加或添加多西环素(0.2mg/mL)21天。使用Caliper Xenogen 100体内成像系统监测转移和肿瘤生长。在攻击后24小时没有变化(B、E)，但是攻击后三周，与CCR9阳性PC3细胞(C)相比，CCR9基因敲减PC3(F)细胞生长为骨转移显著减少。

图23显示肺癌患者的血清CCL25水平。进行CCL25ELISA以定量来自诊断患有腺癌(Adeno Ca；n＝14)、鳞状细胞癌(SSC；n＝17)的患者和正常的健康供体(对照；n＝9)的血清的CCL25水平。ELISA能够检测>5pg/mL的CCL25。实心圆表示个体的血清CCL25水平，而线表示各组的中值浓度。星号表示在对照组和肺癌组之间的显著性差异(p<0.01)。

图24A-D显示非肿瘤肺和肺癌组织的CCR9表达。来自非肿瘤(n＝8)(A)、腺癌(n＝54)(B)和鳞状细胞癌(n＝24)(C)用同种型对照或抗CCR9抗体染色。棕(DAB)色显示CCR9染色。具有40X物镜的Aperio ScanScope CS系统捕捉各玻片的数字图像。

图25A-D显示结肠癌组织的CCR9-CCL25表达。来自肺肿瘤(n＝8)和腺癌(n＝16)的结肠组织用同种型对照(A)、抗CCR9(B)或抗CCL25(C)抗体染色。棕色(DAB)染色表示CCR9阳性，而红紫色染色说明CCL25阳性。具有40X物镜的Aperio ScanScope CS系统捕捉数字图像。

实施例2：使用实时PCR分析检测趋化因子表达水平

引物设计

CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR5a、CXCR5b、CXCR6、CXCR7、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL24、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CCL27、CCL28、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CCR11、XCL1、XCL2、XCR1、CX3CR1或CX3CL1的信使RNA序列得自NIH-NCBI基因库数据库。使用BeaconJ 2.0计算机程序设计引物。使用计算机程序:Primer PremierJ和MITPrimer 3进行引物的热力学分析。针对整个人基因组比较所得到的引物组从而确定特异性。

实时PCR分析

在附加有非必需氨基酸、L-谷氨酸和丙酮酸钠的含有10％胎牛血清的RMPI-1640(完全培养基)中培养癌细胞系(ATCC,Rockville,MD)。原发性肿瘤和正常配对的匹配组织得自临床分离物(Clinomics Biosciences,Frederick,MD and UAB Tissue Procurement,Birmingham,AL)。使用TriReagent(Molecular Research Center,Cincinnati,OH)按照制造商的说明从106个细胞中分离信使RNA(mRNA)。通过用10U/Fl的无RNA酶的DNA酶(Invitrogen,San Diego,CA)在37℃处理15分钟而从这些样本中除去可能的基因组DNA污染。然后将RNA沉淀并重悬在RNA Secure(Ambion,Austin,TX)中。通过使用Taqman7反转录试剂(Applied Biosystems,Foster City,CA)按照制造商的说明反转录大约2μg的总RNA。随后，使用SYBR7Green PCR master mix试剂(Applied Biosystems)按照制造商的说明用针对CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR5a、CXCR5b、CXCR6、CXCR7、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL24、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CCL27、CCL28、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CCR11、XCL1、XCL2、XCR1、CX3CR1或CX3CL1的特异性的人cDNA引物扩增cDNA。使用BioRad Icycler和软件(Hercules,CA)，通过实时PCR分析评价这些目标的mRNA的拷贝水平。

使用CXCL1-、CXCL2-、CXCL3-、CXCL4-、CXCL5-、CXCL6-、CXCL7-、CXCL8-、CXCL9-、CXCL10-、CXCL11-、CXCL12-、CXCL13-、CXCL14-、CXCL15-、CXCL16-、CXCR1-、CXCR2-、CXCR3-、CXCR4-、CXCR5-、CXCR5a-、CXCR5b-、CXCR6-、CXCR7-、CCL1-、CCL2-、CCL3-、CCL4-、CCL5-、CCL6-、CCL7-、CCL8-、CCL9-、CCL10-、CCL11-、CCL12-、CCL13-、CCL14-、CCL15-、CCL16-、CCL17-、CCL18-、CCL19-、CCL20-、CCL21-、CCL22-、CCL24-、CCL25-、CCL25-1-、CCL25-2-、CCL27-、CCL28-、CCR1-、CCR2-、CCR3-、CCR4-、CCR5-、CCR6-、CCR7-、CCR8-、CCR9-、CCR10-、CCR11-、XCL1-、XCL2-、XCR1-、CX3CR1-或CX3CL1-特异性引物组得到的RT-PCR产物，由于排除了与宿主序列(NIH-NCBI基因库)退火的引物，不会与其他基因目标发生交叉反应。相对于导致CXCR5a对CXCR5b以及CCL25、CCL25-1对CCL25-2的多态性，引物产生不同尺寸的扩增子产物。为此，腺瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤和/或骨髓瘤细胞系及肿瘤组织的RT-PCR分析显示癌细胞区别地表达趋化因子和趋化因子受体。

实施例3：抗趋化因子和抗趋化因子受体抗体在体外和体内抑制肿瘤细胞生长

抗血清制品

将来自CXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、CXCR5a、CXCR5b、CXCL13、CXCR6、CXCL16、CCL16、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CCR9、CX3CR1和CX3CL1(SEQ ID NOS:1-SEQ ID NO:21)的15种氨基酸肽合成(Sigma Genosys,TheWoodlands,TX)并结合鸡卵溶菌酶(Pierce,Rockford,IL)以产生用于产生抗血清制品或单克隆抗体的后续免疫的抗原。通过显色的鲎阿米巴样细胞溶解物测定法(Cape Cod,Inc.,Falmouth,MS)定量趋化因子肽结合物的内毒素水平并显示为<5EU/mg。对于第一次免疫，以终体积为1.0ml，连同完全弗氏佐剂Ribi佐剂系统(RAS)一起使用100μg的抗原作为免疫原。将该混合物以100ml等分皮下地施用到兔子后背的两个位置上并且将400ml肌内地施用到各后腿肌肉中。三至四周后，对于后续3次免疫，除不完全弗氏佐剂之外，兔子还接受100μg的抗原。当抗CXCR1抗体、抗CXCR2抗体、抗CXCL1抗体、抗CXCL2抗体、抗CXCL3抗体、抗CXCL5抗体、抗CXCL6、抗CXCL7抗体、抗CXCL8抗体、抗CXCL12抗体、抗CXCR5a抗体、抗CXCR5b抗体、抗CXCL13抗体、抗CXCR6抗体、抗CXCL16抗体、抗CCL16抗体、抗CCL25抗体、抗CCL25-1抗体、抗CCL25-2抗体、抗CCR9抗体、抗CX3CR1抗体和抗CX3CL1抗体滴度达到1:1,000,000时收集抗血清。随后，将正常或抗血清热灭活并在PBS中以1:50稀释。

单克隆抗体制品

将来自CXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、CXCR5a、CXCR5b、CXCL13、CXCR6、CXCL16、CCL16、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CCR9、CX3CR1和CX3CL1的15种氨基酸肽合成(Sigma Genosys)并结合鸡卵溶菌酶(Pierce)以产生用于产生抗血清制品或单克隆抗体的后续免疫的“抗原”。通过显色的鲎阿米巴样细胞溶解物测定法(Cape Cod,Inc.,Falmouth,MS)定量趋化因子肽结合物的内毒素水平并显示为<5EU/mg。对于第一次免疫，以终体积为200ml，连同完全弗氏佐剂Ribi佐剂系统(RAS)一起使用100μg的抗原作为免疫原。将该混合物以100ml等分皮下地施用到大鼠、小鼠或免疫球蛋白-人化的小鼠的后背的两个位置处。两周后，对于后续3次免疫，除不完全弗氏佐剂之外，动物还接受100μg的抗原。收集血清并且当抗CXCR1抗体、抗CXCR2抗体、抗CXCL1抗体、抗CXCL2抗体、抗CXCL3抗体、抗CXCL5抗体、抗CXCL6、抗CXCL7抗体、抗CXCL8抗体、抗CXCL12抗体、抗CXCR5a抗体、抗CXCR5b抗体、抗CXCL13抗体、抗CXCR6抗体、抗CXCL16抗体、抗CCL16抗体、抗CCL25抗体、抗CCL25-1抗体、抗CCL25-2抗体、抗CCR9抗体、抗CX3CR1抗体和抗CX3CL1抗体滴度达到1:2,000,000时，处死宿主，并分离脾细胞，以产生杂交瘤。简言之，将来自免疫宿主的脾或淋巴结的B细胞与不死的骨髓瘤细胞系(例如，YB2/0)融合。接着在选择性培养条件(即，HAT补充培养基)和限定杂交瘤克隆的稀释方法之后分离杂交瘤。使用ELISA选择产生具有所需特异性的抗体的细胞。使用通常使用的分子生物学技术使来自正常大鼠或小鼠的杂交瘤人化。在克隆高亲和力和丰产的杂交瘤后，从腹水或培养上清中分离抗体以及调节至1:2,000,000的滴度并在PBS中以1:50稀释。

抗血清或单克隆抗体处理

免疫缺陷的裸NIH-III小鼠(8至12周龄,Charles River Laboratory,Wilmington,MA)(缺乏T细胞、B细胞和NK细胞)皮下地接受1x 10⁶癌细胞，从而建立肿瘤。然后，将所建立的实体瘤从宿主中移除，用于立即移植或为随后移植而储存在液氮中。使用外科手术将新近分离或液氮冷冻的肿瘤组织(1g)移植在肠内脂肪组织中以产生肿瘤。一旦异种移植肿瘤生长达到5mm大小，就使NIH-III小鼠每三天接受200μl腹腔内注射抗血清或单克隆抗体并且监测肿瘤生长的进展和退化。

数据分析

使用SigmaStat 2000(Chicago,IL)软件分析和确认数据的统计显著性。随后，使用双因子不成对检验，通过史蒂顿特氏t检验(Student's t-test)分析数据。在该分析中，比较处理的样本和未处理的对照。显著性水平设定为p<0.05。

体外生长研究

在具有或没有特异性针对CXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6CXCL7、CXCL8、CXCR4、CXCL12、CXCR5a、CXCR5b、CXCL13、CXCR6、CXCL16、CCL16、CCR9、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CX3CR1或CX3CL1的抗体的存在下，在完全培养基中使腺瘤、癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤和/或骨髓瘤细胞系生长。CXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7或CXCL8的抗体抑制表达CXCR1和/或CXCR2的癌细胞系的生长。同样地，CXCR4或CXCL12的抗体抑制表达CXCR4的癌细胞系的生长。CXCR5a、CXCR5b或CXCL13的抗体抑制表达CXCR5a或CXCR5a的癌细胞系的生长。CXCR6或CXCL16的抗体抑制表达CXCR6的癌细胞系的增殖。CCR9、CCL25、CCL25-1或CCL25-2的抗体抑制表达CCR9的癌细胞系的生长。CX3CR1或CXC3L1的抗体抑制表达CX3CR1的癌细胞系的繁殖。有兴趣的是，抗可溶性配体、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL12、CXCL13、CXCL16、CCL16、CCL25、CCL25-1、CCL25-2或CX3CL1的抗体，它们针对膜受体，在生长抑制方面更加有效。

体外血管发生研究

在血管发生的体外测定法中(BD-Biocoat,Hercules,CA)，在具有或没有特异性针对CXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCR4、CXCL12、CXCR5a、CXCR5b、CXCL13、CXCR6、CXCL16、CCL16、CCR9、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CX3CR1或CX3CL1的抗体的存在下，按照供应商的说明使微血管内皮细胞细胞(Cell Systems,Kirkland,WA)生长并且使其形成微血管小静脉。抗CXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCR4、CXCL12、CXCR6或CXCL16的抗体抑制血管发生。

体内生长研究

将癌细胞系或原发性肿瘤组织继承性(adoptively)转移到NIH-III小鼠中并使其形成目的异种移植肿瘤。针对CXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCR4、CXCL12、CXCR5a、CXCR5b、CXCL13、CXCR6、CXCL16、CCL16、CCR9、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CX3CR1或CX3CLl的抗体有区别地影响肿瘤大小的进展和退化。在某些情况下，针对CXCR1、CXCR2、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCR4、CXCL12、CXCR6或CXCL16的抗体有效地导致肿瘤生长退化并阻止肿瘤生长的进展。针对CXCR4、CXCL12、CXCR5a、CXCR5b、CXCL13、CCL16、CCR9、CCL25、CCL25-1、CCL25-2、CX3CR1或CX3CL1的抗体有效地抑制肿瘤尺寸的增加。

在NIH-NCBI基因库中记录了本文中所用的趋化因子的蛋白质序列如下：(1)CXCR1(ACCESSION#NP 000625)，SEQ ID NO:1，(2)CXCR2(ACCESSION#NP 001548)，SEQ ID NO:2，(3)CXCL1(ACCESSION#NP 001502)，SEQ ID NO:3，(4)CXCL2(ACCESSION#NP 002080)，SEQID NO:4，(5)CXCL3(ACCESSION#NP 002081)，SEQ ID NO:5，(6)CXCL5(ACCESSION#NP002985)，SEQ ID NO:6，(7)CXCL6(ACCESSION#NP 002984)，SEQ ID NO:7，(8)CXCL7(ACCESSION#NP 002695)，SEQ ID NO:8，(9)CXCL8(IL-8，ACCESSION#NP 000575)，SEQ IDNO:9，(10)CXCR4(ACCESSION#NP 003458)，SEQ ID NO:10，(11)CXCL12(ACCESSION#NP000600)，SEQ ID NO:11，(12)CXCR5A(ACCESSION#NP 116743)，SEQ ID NO:12，(13)CXCR5B(ACCESSION#NP 001707)，SEQ ID NO:13，(14)CXCL13(ACCESSION#NP 006410)，SEQ ID NO:14，(15)CXCR6(ACCESSION#NP 006555)，SEQ ID NO:15，(16)CXCL16(ACCESSION#NP071342)，SEQ ID NO:16，(17)CCL16(ACCESSION#NP 004581)，SEQ ID NO:17，(18)CCL25(ACCESSION#NP-005615.2)，SEQ ID NO:18，(19)CCL25-1(ACCESSION#NP 005615)，SEQ IDNO:19，(20)CCL25-2(ACCESSION#NP 683686)，SEQ ID NO:20，(21)CX3CR1(ACCESSION#NP001328)，SEQ ID NO:21，和(22)CX3CL1(ACCESSION#NP 002987)，SEQ ID NO:22。

cDNA序列是已知的并且可以在NIH-NCBI基因库中得到，以下列登录号：(23)CXCR1(ACCESSION#NM 000634)，SEQ ID NO:23，(24)CXCR2(ACCESSION#NM 001557)，SEQ ID NO:24，(25)CXCL1(ACCESSION#NM 001511)，SEQ ID NO:25，(26)CXCL2(ACCESSION#NM002089)，SEQ ID NO:26，(27)CXCL3(ACCESSION#NM 002090)，SEQ ID NO:27，(28)CXCL5(ACCESSION#NM 002994)，SEQ ID NO:28，(29)CXCL6(ACCESSION#NM 002993)，SEQ ID NO:29，(30)CXCL7(ACCESSION#NM 002704)，SEQ ID NO:30，(31)CXCL8(IL-8，ACCESSION#NM 000584)，SEQ IDNO:31，(32)CXCR4(ACCESSION#NM 003467)，SEQ ID NO:32，(33)CXCL12(ACCESSION#NM000609)，SEQ ID NO:33，(34)CXCR5A(ACCESSION#NM 032966)，SEQ ID NO:34，(35)CXCR5B(ACCESSION#NM 001716)，SEQ ID NO:35，(36)CXCL13(ACCESSION#NM 006419)，SEQ ID NO:36，(37)CXCR6(ACCESSION#NM 006564)，SEQ ID NO:37，(38)CXCL16(ACCESSION#NM022059)，SEQ ID NO:38，(39)CCL16(ACCESSION#NM 004590)，SEQ ID NO:39，(40)CCL25(ACCESSION#NM_005624.3)，SEQ ID NO:40，(41)CCL25-1(ACCESSION#NM 005624)，SEQ IDNO:41，(42)CCL25-2(ACCESSION#NM 148888)，SEQ ID NO:42，(43)CX3CR1(ACCESSION#NM001337)，SEQ ID NO:43，和(44)CX3CL1(ACCESSION#NM 002996)，SEQ ID NO:44。

如下表所示，大多数的所有肿瘤表达的特定趋化因子可以变化。本申请的方法可专门用于特定患者，这取决于患者自身肿瘤过表达的趋化因子。可以使用本申请的方法识别肿瘤中过表达的特定趋化因子并且施用对抗过表达的趋化因子的抗体。为癌症患者量身定制的治疗是新颖的，并且应用特别有价值。

表1显示在所研究的特定肿瘤中过表达的特定趋化因子的不同数量。

实施例4：与PCa化学抗性相关的CCR9-CCL25诱导的抗细胞凋亡和/或存活信号

在使用或不使用多柔比星(1μM/2μM/4μM)、依托泊苷(20μM/40μM)、雌莫司汀(4μM/10μM)或多西他赛(10nM/20nM/40nM)的情况下，使LNCaP(激素应答，野生型p53表达)、PC3(激素不应，p53null)和DU145(激素不应，p53突变的)细胞系生长4、8、12和24小时。通过实时PCR和蛋白质印迹来评价细胞存活、促细胞凋亡和抗细胞凋亡信号(Akt、Src、CamKII、FAK、FKHR、FOXO、CREB、NF-κB、Myc、Fos、Jun Apaf1、Bax、Bcl2、BclX_L、BaK、Bad、Bik、Bim、TP53、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-6、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9、存活素、玻璃体结合蛋白、β-连环蛋白)和造成耐药性或新陈代谢的分子(Twist-1、Snail-1、谷胱甘肽-S-转移酶-π(GST-π)、p53、拓扑异构酶I、IIα、IIβ、和ABC药物转运体)。简言之，细胞处理后，使用实时PCR测试基因表达的变化。此外，使用磷酸化特异性抗体(即，蛋白质印迹分析)测试信号分子的激活。为了进一步证实活化的信号分子的作用，在CCL25处理后，使用化学抑制剂或siRNA抑制候选分子的表达或活性，并且通过实时PCR分析目标基因。随后，通过Vybrant细胞凋亡测定(Molecular probes)试剂盒评价处理的细胞对化学治疗药物的反应。

RNA分离和实时PCR

使用Trizol ^TM(Invitrogen)方法分离总RNA并通过UV分光光度测定法定量。通过电泳分析RNA的品质。使用iScript^TM cDNA synthesis kit(BioRad)按照制造商的说明完成cDNA合成。按照制造商的说明使用IQ^TM SYBR green supermix(BioRad)和针对FAK、FKHR、FOXO、Apaf1、Bax、Bcl2、BclX_L、BaK、Bad、Bid、XIAP、Bik、Bim、TP53、细胞色素C、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-6、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9、存活素、核纤层蛋白、CamKII、玻璃体结合蛋白、β-连环蛋白、钙粘素、Twist-1、Snail-1、CREB、NF-κB、Myc、Fos、Jun、β-肌动蛋白和GAPDH设计的引物进行实时PCR。通过△Ct计算结果以定量与未处理组相比mRNA的倍数变化。

蛋白质印迹法

将细胞收集并重悬浮在裂解缓冲液中以提取总蛋白质。裂解缓冲液包含50mMTris-HCl、pH7.4、150mM NaCl、1％Triton X-100、1％脱氧胆酸盐、0.1％SDS、附加有蛋白酶抑制剂的5mM EDTA、1mM苯基甲基磺酰氟化物、1mM苄脒、10μg/mL大豆胰蛋白酶抑制剂、50μg/mL亮肽酶素、1μg/mL胃酶抑素和20μg/mL抑肽酶。将细胞溶解产物在冰上保持30分钟，在4℃离心(14000xg)20分钟，并且将上清液用于基因的蛋白质印迹分析，证明在mRNA水平上的显著性调变。同样地，磷光体特异性抗体用于测试Akt1/2/3、mTOR、FAK、FKHR、FOXO和GSK-3β的磷酸化(phophorylation)水平的变化。此外，使用特异性抗体评价裂解之后半胱天冬酶和PARP的活化。使用Image J图像分析软件(NIH)，针对β-肌动蛋白和/或GAPDH，对X光片上的通过ECL加试剂(Pharmecia)对蛋白质带进行化学发光检测之后得到的结果进行归一化处理。

细胞色素C释放的检测

将细胞收集，在PBS中洗涤，并重悬浮在含有220mM甘露醇、68mM蔗糖、50mM PIPES-KOH、pH 7.4、50mM KCl、5mM EGTA、2mM MgCl₂、1mM DTT、和蛋白酶抑制剂的提取缓冲液中。冰上孵育30分钟后，使用Glass-Teflon匀浆器匀化细胞，并且匀浆将以14,000g被旋转15分钟。细胞溶质提取物用于使用抗细胞色素C单克隆抗体(PharMingen)的蛋白质印迹分析。

siRNA转染、化学抑制剂、和细胞凋亡检测

使用LipofectAMINE 2000(Invitrogen)用基因特异性和非特异性对照siRNA(Dharmacon)转染前列腺癌细胞系。最佳的基因敲减时间和siRNA浓度是通过蛋白质印迹分析而被确认，并且进一步在使用或没有使用CXCL16、对照抗体、和/或抗CXCR6抗体进行药物处理之后评价细胞存活。评价生活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的检测如下：使用FACScan流式细胞仪和CellQuest^TM软件(BD Pharmingen)，按照制造商的说明用Vybrant细胞凋亡测试细胞存活。使用实时PCR和蛋白质印迹法测试在基因敲减之后下游基因表达的变化。

用CCL25处理的细胞显示出细胞存活和药物转运体蛋白的表达的增强，这显示在激素应答和不应答细胞中的它们的表达图形的不同。抗CCL25Abs有效地逆转PCa细胞中CCL25的作用。在没有进行CCL25处理(或CCR9封闭)的情况下，多柔比星、雌莫司汀、依托泊苷和多西他赛诱导PCa细胞的凋亡。

实施例5：CCR9-CCL25诱导ABC药物转运体的改变

如前所述，在使用或没有使用CCL25、抗CCL25抗体、对照抗体和/或抗CCR9抗体连同使用或没有使用多柔比星、雌莫司汀、依托泊苷或多西他赛的情况下，使LNCaP细胞、PC3细胞和DU145细胞生长4小时、8小时、12小时或16小时。处理后，使用针对ABC和Twist-1cDNA的特异性引物，如上所述，通过实时PCR定量ABC转运体和Twist-1mRNA表达的变化。进一步通过蛋白质印迹分析测试证明mRNA表达的显著性改变的基因。通过染色质免疫沉淀(ChIP)测定评价经处理的细胞的核提取物以确定由CXCL16诱导的转录因子是否结合ABC转运体和Twist-1的启动子区。

染色质免疫沉淀(ChIP)

实施例4的结果提供了关于被调节的基因以及可调节通过CCR9-CCL25相互作用而被活化的转录因子的基因的信息。基于这些结果，选择目标转录因子和基因。针对这些含有转录因子的结合位点的基因的启动子区设计特异性PCR引物。PCR引物用于扩增与转录因子一起被沉淀的DNA。在20mM丁酸盐的存在下，通过胰蛋白酶消化收获细胞。将50,000个细胞重悬浮在500μl PBS/丁酸盐中。将蛋白质和DNA在室温下用1％甲醛交联8分钟并且在5分钟内用125mM甘氨酸使交联停止。将细胞在4℃使用温和减速设置在甩平式转头中以470g离心10分钟，并在0.5ml冰冷PBS/丁酸盐中通过涡旋接着离心洗涤两次。通过加入裂解缓冲液(50mM Tris–HCl、pH 8、10mM EDTA、1％SDS、蛋白酶抑制剂混合剂(Sigma-Aldrich)、1mMPMSF、20mM丁酸盐使细胞裂解，涡旋以及随后离心。已知该操作产生500bp的染色质片段。将超声处理的溶解产物在含有蛋白酶抑制剂混合剂、1mM PMSF和20mM丁酸盐(RIPA ChIP缓冲液)的RIPA缓冲液中稀释8倍。将RIPA ChIP缓冲液(330μl)加入到沉淀物中并通过涡旋使其混合。通过使用针对特异性转录因子的抗体完成ChIP物质的免疫沉淀和洗涤。将染色质等分到含有抗体-珠复合物的管中。将加入样本置于用于酚氯仿异戊醇分离的管中。将免疫沉淀的物质洗涤三次并转移到具有TE的新管中。在68℃在单一步骤中在2小时内进行在1％SDS中的DNA洗脱、交联逆转和蛋白酶K消化。DNA使用酚氯仿异戊醇提取，在丙烯酰胺载体(Sigma-Aldrich)存在下乙醇沉淀，并溶解在TE中。通过实时PCR分析来自3–4个独立ChIP的免疫沉淀的DNA。实时PCR数据被表示为在三次独立重复进行的ChIP测定中相对于所加入的DNA沉淀的(抗体-结合的)DNA的百分比(±SD)。

经由CCR9-CCL25信号途径的如CREB、Fos、Jun和NFkB的转录因子的磷酸化和活化随后导致ABC转运体和Twist-1的表达的增加。如果在相同启动子中存在负调控元件，观察基因表达的下降。因为激素依赖的和不应的PCa细胞具有不同的这些细胞内信号分子的表达，所以它们显示了将要通过激素依赖的和不应的状态而被调节的基因的变化。基因表达的调变显示了在CCL25存在下和在没有CCL25处理情况下使用药物处理的不同。

实施例6：CCL25-定向治疗的体内评价

用表达萤光素酶的雄激素敏感(LNCaP-Luc)和非敏感(PC3-Luc)细胞皮下攻击雄性裸小鼠。通过使用体内成像系统非侵入地测定肿瘤发展。在可测定的肿瘤建立之后，将小鼠分为治疗组(A、B、C、D和E)和对照组(F、G、H、I、J和K)。“A”组每隔一天接受CCL25中和抗体(12.5mg/kg/天)并且对照(F组)接受同种型对照抗体(12.5mg/kg/天)。“B”组、“C”组、“D”组和“E”组分别在多柔比星的腹腔内注射(在第1～3天，5mg/kg/天，随后在第15～17天施用)、依托泊苷的静脉注射(10mg/kg/天；在第1、5、9、14、19和24天)、雌莫司汀的静脉注射(4mg/kg/天在第1-5天和第26-31天)、或者多西他赛的腹腔内注射(8mg/kg/天，4周，每周2次)的情况下，接受CCL25中和抗体(12.5mg/kg/天)。使用同种型对照抗体(12.5mg/kg/天)，采用相似的浓度和注射方案，使这些处理组的对照接受这些药物。“K”组接受PBS且作为对照剂。在治疗和对照中肿瘤增长和退化通过体内非侵入成像评价。对来自处理组和未处理对照组的肿瘤进行分离并通过免疫组织化学评价细胞存活和耐药性蛋白质方面的变化。在此所使用的上下文中，术语“CCL25中和抗体”是指抗CCL25抗体和/或抗CCR9抗体。

统计学(显著性)和样本尺寸

样本尺寸(或者放大率)计算与初步研究设计相关并且确定了对于建议试验的要求。为了解释我们的结果，显著性检验和统计分析也是重要的。使用常规α-值，即，p＝0.01来评价这一研究的统计显著性。建议的试验将需要每组10只小鼠的最小量。将数据表示为均值±SEM并通过使用用于常规分布样本的两尾配对(或不配对)史蒂顿特氏t检验或者用于非常规分布样本的不成对Mann Whitney U检验(Mann Whitney U test)进行比较。使用SYSTAT(Systat software Inc.)统计程序分析结果。单因子和双因子方差ANOVA分析分别用于评价组和亚组。因此，如果p值<0.05，结果被认为是统计显著的。

动物

六到八周龄成年雄性裸鼠皮下注射PCa细胞。简要地，将5x10⁶个表达荧光素酶的PC3细胞在100μl无菌PBS中再悬浮并且在异氟烷麻醉下注射进裸鼠的侧腹。表达荧光素酶的LNCaP细胞(5x10⁶细胞)与50％基质胶(Becton Dickinson)混合并且在异氟烷麻醉下注射进裸鼠的侧腹。

体内肿瘤生长分析

在成像之前15分钟，使用25x5/8”计量注射针，通过腹膜内注射，荷肿瘤裸鼠接受150mg/kg D-萤光素(Xenogen)。使用IVIS100体内成像系统使小鼠成像，并且结果以光子/秒/cm²/sr表示。肿瘤体积通过使用测径器测量，并且通过公式(较大直径)x(较小直径)²x0.5来计算。

细胞存活、细胞凋亡和耐药基因表达分析

在处理方案完成后三天，切除所有组的肿瘤。将肿瘤固定在4％PFA中，并且埋入石蜡中。将石蜡切片(厚度为7μm)置于载玻片上，去石蜡化，并且再水化(二甲苯处理5分钟；纯的、95％和70％乙醇各自处理1分钟)。再水化的切片用于对于药物转运体、PI3K、Akt、FAK、FKHR、FOXO、Apaf1、Bax、Bcl2、BclX_L、BaK、Bad、Bid、XIAP、Bik、Bim、TP53、细胞色素C、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-6、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9、存活素、核纤层蛋白、CamKII、玻璃体结合蛋白、β-连环蛋白、钙粘素、Twist-1、CREB、NF-κB、Myc、Fos、Jun、CCR9和CCL25的基于过氧化物酶的免疫组织化学染色。在染色之后，用Aperio scanscope(Aperio)系统扫描载玻片并且分析。

CCL25中和导致降低了对药物响应的细胞存活，从而减小肿瘤体积。但是，这种响应在由激素敏感(LNCaP)和激素不应(PC3细胞)形成的肿瘤中也发生变化。此外，化学治疗药物在具有功能性CCR9-CCL25轴线(可以提高已知将这些药物转运到细胞之外的ABC蛋白的表达)的肿瘤中具有较低功效。

上述描述用于教导本领域普通技术人员如何实施本发明的目的，其不意味着试图详述所有那些在本领域技术人员阅读说明书时能够明确的内容的显而易见的修改和变化。但是，可以理解，这些显而易见的修改和变化包括在本申请的范围内，其由以下权利要求书所定义。该权利要求书应理解为覆盖了任何顺序的有效适用在此所需目的组成和步骤，除非上下文做出了相反的特定指示。在申请文件中引用的所有参考文献在此以引用方式全部并入本申请。

Claims (10)

1.多个癌症标记物的抗体在制备检测受试者体内癌症存在的试剂盒中的用途，其中，所述检测包括以下步骤：

检测从所述受试者获得的生物样本中的所述多个癌症标记物的表达水平；以及

将所述生物样本中的所述多个癌症标记物的表达水平与所述多个癌症标记物的正常表达水平相比较，其中，所述生物样本中所述多个癌症标记物的高于正常的表达水平意味着所述受试者体内存在癌症，

其中，所述多个癌症标记物的所述正常表达水平是预定值或者是从与所述生物样本相同的起源或类型的已知正常非癌细胞的对照样本中获得的，

其中，所述癌症为选自脑癌、结肠直肠癌、肺癌、前列腺癌、骨癌、胰腺癌或胃癌的癌，并且

其中，所述多个癌症标记物包括：(1)CCL25，或CCR9，或CCL25和CCR9的组合；和(2)CXCL13，或CXCR5，或CXCL13和CXCR5的组合。

2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述多个癌症标记物进一步包括CXCL16，或CXCR6，或CXCL16和CXCR6的组合。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述生物样本为血浆、唾液或者尿液。

4.多个癌症标记物的抗体在制备评价患有癌症的受试者的预后的试剂盒中的用途，所述评价包括以下步骤：

确定来自所述受试者的生物样本中的所述多个癌症标记物的表达水平；以及

将所述生物样本中的所述多个癌症标记物的表达水平与所述多个癌症标记物的对照表达水平相比较，

其中，所述生物样本中的所述多个癌症标记物的相对于所述对照水平的较高表达水平意味着所述受试者的预后差，

其中，所述生物样本中的所述多个癌症标记物的相对于所述对照水平的较低或相似表达水平意味着所述受试者的预后良好，

其中，差的预后意味着所述癌症是攻击型的或者侵入型的，

其中，所述癌症为选自脑癌、结肠直肠癌、肺癌、前列腺癌、骨癌、胰腺癌或胃癌的癌，并且

其中，所述多个癌症标记物包括：(1)CCL25，或CCR9，或CCL25和CCR9的组合；和(2)CXCL13，或CXCR5，或CXCL13和CXCR5的组合。

5.根据权利要求4所述的用途，其中，所述多个癌症标记物进一步包括CXCL16，或CXCR6，或CXCL16和CXCR6的组合。

6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述生物样本为血浆、唾液或者尿液。

7.多个癌症标记物的抗体在制备用于监测受试者的癌症治疗过程的试剂盒中的用途，所述监测包括以下步骤：

在治疗过程中或治疗之后，确定从所述受试者获得的一个或多个生物样本中的所述多个癌症标记物的表达水平；以及

将所述一个或多个生物样本中的所述多个癌症标记物的表达水平与所述多个癌症标记物的对照表达水平相比较，其中，所述多个癌症标记物的所述对照水平是所述受试者体内的所述多个癌症标记物的治疗前的水平，或者预定参考水平，

其中，如果所述一个或多个生物样本中的所述多个癌症标记物相似于或者低于所述对照水平，则所述治疗被认为是有效的，

其中，所述癌症为选自脑癌、结肠直肠癌、肺癌、前列腺癌、骨癌、胰腺癌或胃癌的癌，并且

其中，所述多个癌症标记物包括：(1)CCL25，或CCR9，或CCL25和CCR9的组合；和(2)CXCL13，或CXCR5，或CXCL13和CXCR5的组合。

8.根据权利要求7所述的用途，其中，所述多个癌症标记物进一步包括：CXCL16，或CXCR6，或CXCL16和CXCR6的组合。

9.根据权利要求7所述的用途，其中，所述多个癌症标记物进一步包括选自CXCL16、CXCR6、CCL1、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL21、CCL22、CCL27、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL7、CXCL8、CXCL12、CX3CL1、CCR2、CCR7、CCR8、CCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR7和CX3CR1中的一个或多个癌症标记物。

10.根据权利要求7所述的用途，其中，所述生物样本为血浆、唾液或者尿液。