CN106290711B - 一种快速筛选对昆虫有效的物质的简便方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种快速筛选对昆虫有效的物质的简便方法，该方法包括以昆虫为靶标，将候选物质施用于昆虫中肠，观察所述昆虫的变化，从而确定候选物质对于所述昆虫的生物活性。本发明的方法成本低廉，重复性好，准确率高，不需特殊仪器，为快速、准确、高效筛选对昆虫有效的生物活性物质提供了极大的方便。

Description

一种快速筛选对昆虫有效的物质的简便方法

技术领域

本发明属于农药学领域，更具体地，本发明涉及一种快速筛选对昆虫有效的物质的简便方法。

背景技术

农业是中国国民经济的基础，随着人口的不断增加，耕地质量的不断降低，粮食问题、农业发展问题不断突出，农业经济的重要地位日益增长。为了保证农作物产量、解决粮食问题，保持社会稳定，农药不可避免地使用在农业生产中。农药在防治农作物病虫害，保证农作物正常生长，提高单位面积产量，保持社会稳定上起到了重要的作用。

农药在保障农作物产量与品质中起到重要作用的同时，在生产、运输、储存及使用过程中处理不当也会引起一系列诸如农药中毒、环境污染、农药残留、食品安全等事件，对生态环境和人体健康构成严重威胁；农药长期不当使用，也使得有害生物抗药性日趋严重；这迫切需要研究出新的高效、低毒、安全无公害、环境友好型新农药。新农药的开发应用给人类社会和生产企业带来巨大的效益，但同时也由于新农药开发的难度与费用日益增加，如何利用生物测定技术快速、高效地筛选出新化合物，并准确评价其生物活性，是决定农药创制研究成功与否的关键。

当前传统的针对农业害虫的生物活性测定主要有以下几种常用方法：(1)喷雾(粉)法：利用喷雾或喷粉装置，将定量的药剂直接喷布于有目标昆虫及其饲料的器皿内，使药剂直接与昆虫或食料接触，然后在培养箱或观察室内定期观察记录昆虫的生长、发育和死亡情况，比较或确定化合物的毒力。(2)浸渍法：将一定数量的目标昆虫(用于净纱布袋或纱笼装起来)，或将饲料植株、叶片或带虫叶片(如蚜虫、红蜘蛛等)，直接浸润于一定浓度的药液中，取出后用滤纸吸去多余药液，将试虫及饲料置于干净器皿中饲养，并补充新鲜饲料，观察、记录试虫死亡率。(3)饲料混药法：将一定量的药剂充分与试虫食料混匀，试虫取食时接触或摄入药剂而死亡。多用于贮粮害虫、家蝇、蜚蠊、蚊子或人工饲料饲养的昆虫生物测定试验。(4)点滴法：将定量的药剂滴在昆虫体壁的一定部位，使药剂透过表皮进入体内，以测定药剂触杀效果的方法。(5)夹毒叶片法：是目前常用的测定胃毒作用的经典技术，用打孔器取叶碟，加入培养皿，并注意保湿，然后把药液滴在叶碟上，待叶碟上的溶剂挥发后和另一片涂有淀粉糊的叶碟对合制成夹毒叶碟，然后饲喂供试昆虫。

这些方法都存在的缺点是：比较粗放，定量分析比较困难，重复性相对较差，受环境因素影响较大，效果不能保证，主要用于判断化合物是否有杀虫活性，并初步比较其活性大小，多用于常规筛选研究，有些还需要特殊仪器如喷雾机、沉降塔等，增加了工作量和劳动成本。如何能够高效、简便和快速的对这些化合物的进行生物效果评价是目前迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简便快捷的筛选化学合成物或生物合成物质对昆虫作用的有效的方法。

在本发明的第一方面，提供一种对候选物质进行快速生物活性测定的方法，所述方法包括：以昆虫为靶标，将候选物质施用于昆虫中肠，观察所述昆虫的变化，从而确定候选物质对于所述昆虫的生物活性。

在一个优选例中，所述的昆虫包括：鳞翅目(如蚕蛾科、凤蝶等)昆虫、直翅目(如螽斯、蝗虫等)昆虫，鞘翅目(如金龟、天牛等)昆虫；所述的昆虫是龄期一致(含基本一致)的昆虫。

在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：小分子化合物，核酸，肽；较佳地，所述的候选物质设置为多种测试浓度的候选溶液。

在另一优选例中，所述的将候选物质施用于昆虫中肠包括：将候选物质经由昆虫的腹部侧方施用于昆虫中肠，或将候选物质经由昆虫的胸部侧方施用于昆虫中肠。

在另一优选例中，所述的昆虫是家蚕，将候选物质经由家蚕的胸部第2-3节侧方施用于昆虫中肠。

在另一优选例中，在施用候选物质之前和/或之后，还包括步骤：将昆虫进行麻醉处理；较佳地，采用冷处理(如放置于冰上)或二氧化碳进行麻醉处理。

在另一优选例中，确定候选物质对于所述昆虫的生物活性的方法包括(但不限于)：观察昆虫在候选物质处理前后的生存率或死亡率，观察昆虫在候选物质处理前后的体重变化，观察昆虫在候选物质处理前后的运动变化，观察昆虫在候选物质处理前后的生长发育变化。

在另一优选例中，所述方法中，设置测试组和对照组；在测试组中，将候选物质施用于昆虫中肠；在对照组中，不施用候选物质但其它处理条件同测试组；

观察测试组和对照组中昆虫的变化，若测试组中昆虫的生存率或体重或生长发育指标显著低于(如低20％以上，较佳的低50％以上；更佳的低80％以上)对照组，就表明该候选物是杀灭昆虫的潜在物质。

在本发明的另一方面，提供一种用于对候选物质进行快速生物活性测定的试剂盒，所述的试剂盒中包括：注射器；候选物质；麻醉剂；消毒剂。

在一个优选例中，所述的注射器为微量注射器。

在另一优选例中，所述的消毒剂为乙醇；较佳地其为70％乙醇；和/或

所述的麻醉剂为二氧化碳；和/或

所述的候选物质设置为多种测试浓度的候选溶液。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、以家蚕为受试动物，在其胸部第2-3节侧方进行受试药物施用的示意图。

具体实施方式

为了克服现有技术的缺陷，本发明揭示了一种以昆虫作为模式动物，评价候选物质如小分子化合物生物活性的方法。

如本文所用，所述的昆虫可以包括但不限于：鳞翅目、直翅目、鞘翅目昆虫。例如，鳞翅目的蚕蛾科昆虫可以作为靶标，更具体地如家蚕。

如本文所用，所述的候选物质包括但不限于：小分子化合物，生物大分子如核酸、肽等。

测定方法

本发明的快速筛选、评价候选物质如小分子化合物的简便方法包括：以昆虫为靶标，将候选物质施用于昆虫中肠，观察所述昆虫的变化，从而确定候选物质对于所述昆虫的生物活性。

作为本发明的优选方式，所述的将候选物质施用于昆虫中肠包括：将候选物质经由昆虫的腹部侧方施用于昆虫中肠，或将候选物质经由昆虫的胸部侧方施用于昆虫中肠。在施用时，较佳地以注射器进行适用，所述的注射器通常为微量注射器，例如容量为1～500μl，较佳地2～100μl，更佳地3～50μl的微量注射器。

作为本发明的优选方式，所述的昆虫是家蚕，将候选物质经由家蚕的胸部第2-3节侧方施用于昆虫中肠，如图1所示。

作为本发明的优选方式，在施用候选物质之前和/或之后，还包括步骤：将昆虫进行麻醉处理。多种施用于对昆虫进行麻醉的方法可应用于本发明中。较佳地，可以采用冷处理如放置于冰上，或二氧化碳进行麻醉处理，从而可快速、有效地进行测试。

通过观察昆虫的一种或多种指标来确定候选物质对于受试昆虫的影响情况。作为本发明的优选方式，所述的确定候选物质对于所述昆虫的生物活性的方法包括但不限于：观察昆虫在候选物质处理前后的生存率或死亡率，观察昆虫在候选物质处理前后的体重变化，观察昆虫在候选物质处理前后的运动变化，观察昆虫在候选物质处理前后的生长发育变化。可以用各种软件进行统计分析，计算各处理的LC50、LC95和95％置信限等值，评价候选物质对靶标昆虫的影响。

作为本发明的优选方式，为了更清晰地了解候选物质对于靶标昆虫的影响情况，所述方法中，设置测试组和对照组；在测试组中，将候选物质施用于昆虫中肠；在对照组中，不施用候选物质但其它处理条件同测试组；观察测试组和对照组中昆虫的变化，若测试组中昆虫的生存率或体重或生长发育指标显著低于对照组，就表明该候选物是杀灭昆虫的潜在物质。

作为本发明的优选方式，在进行测试时，不管是测试组还是对照组中，所述的昆虫是龄期一致或基本一致的昆虫，这有利用采取统一的方法进行衡量、统计。

作为本发明的优选方式，为了观察候选物质的浓度对于靶标昆虫的影响，所述的候选物质设置为多种测试浓度的候选溶液。

在本发明的优选实施方式中，提供了测试方法如下；(1)供试虫准备：挑选龄期一致的昆虫，记录每头的平均重量；(2)药剂处理：把供试虫放在冰上或者用二氧化碳进行麻醉处理，使用微量注射器分别吸取供试的一系列候选物质，从昆虫的腹部侧方刺入昆虫中肠，然后往昆虫尾部方向插入，缓慢的注射定量药剂，停0留3秒后，缓慢拔出注射器，供试昆虫再置于冰上5-10分钟，然后取出，按正常的方法进行饲养，到达预定的时间后观测供试昆虫的死亡或体重变化情况，进而确定候选物质的活性。

本发明提供了一种以昆虫为靶标对小分子化合物的效果进行快速生物活性测定的简便方法。利用本发明的方法能够简便、快速的评价待测的小分子化合物对昆虫的毒力。本发明的方法成本低廉，重复性好，准确率高，不需特殊仪器，为快速、准确、高效筛选对昆虫有效的生物活性物质提供了极大的方便。

试剂盒

基于本发明的上述方法，还提供了一种用于对候选物质进行快速生物活性测定的试剂盒，所述的试剂盒中包括：注射器；候选物质；麻醉剂。所述的注射器通常为微量注射器，例如容量为1～500μl，较佳地2～100μl，更佳地3～50μl的微量注射器。所述的麻醉剂例如二氧化碳。所述的消毒剂例如为70％乙醇。

此外，所述的试剂盒中还可包括说明如何利用该试剂盒对候选物质进行快速生物活性测定的使用说明书，以指导本领域人员应用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、以BT晶体蛋白作为小分子化合物的试验

(1)用电子天平称取BT晶体蛋白0.01g，用灭菌水进行系列稀释，稀释至浓度为10μg/ml的溶液，置于冰上备用。

(2)选取大小较一致的5龄2天的家蚕幼虫，置于冰上20分钟，进行麻醉处理。

(3)供试家蚕用70％乙醇对将要注射的部位进行表面消毒，并稍晾干，再使用微量注射器对家蚕胸部第2-3节侧方进行BT溶液注射中肠，如图1，每头家蚕注射10μl，对照注射10μl灭菌水，注射完后，在冰上再冰冻5分钟，然后取出家蚕幼虫，进行正常饲养，24h后统计家蚕死亡数量。常规试验对照用夹毒叶片饲喂法，把含10μg/ml BT晶体蛋白溶液10μl涂抹到打成小圆盘的新鲜的桑叶上，进行喂饲，对照用等量的灭菌水涂抹。每个处理均使用30头处理，三次重复，24小时后检查实验结果。

测定供试虫的重量变化或者校正死亡率。计算方法如下：

P1为死亡率，K为死亡虫数，N为处理总虫数；

校正死亡率(％)P2为校正死亡率，P1为处理死亡率，P0空白对照死亡率。

(4)统计分析：根据家蚕死亡数量的试验结果，进行统计分析。

实验结果如表1。

表1、不同方法处理对家蚕的毒力比较

处理	药剂浓度	药前虫数	药后死虫数	死亡率(％)	校正死亡率(％)
						BT注射	10μg/ml	90	90	100.0	99.9
灭菌水注射	/	90	3	3.3	/
						BT饲喂	10μg/ml	90	13	14.4	12.5
灭菌水饲喂	/	90	2	2.2	/

实施例2、化合物筛选试验

(1)设置测试组和对照组：

测试组：将待检测小分子化合物在合适的溶剂中进行溶解，配制成母液，并稀释到一系列供试浓度，密封保存备用。

对照组(对照溶液)：不含受试化合物的与测试组相同的溶剂。

(2)选取大小较一致的5龄2天的家蚕幼虫，置于冰上20分钟，进行麻醉处理。

(3)供试家蚕用70％乙醇对将要注射的部位进行表面消毒，并稍晾干，再在微量注射器中装入受试化合物溶液或对照溶液，对家蚕胸部第2-3节侧方进行注射中肠，每头家蚕注射10μl，对照注射10μl灭菌水，注射完后，在冰上在冰冻5分钟，然后取出家蚕幼虫，进行正常饲养，24h后统计家蚕死亡数量。以不含受试化合物的灭菌水进行同样注射，作为对照组。

测定供试虫的重量变化或者校正死亡率。计算方法如下：

P1为死亡率，K为死亡虫数，N为处理总虫数

校正死亡率(％)P2为校正死亡率，P1为处理死亡率，P0空白对照死亡率。

(4)统计分析：根据家蚕死亡数量的试验结果，进行统计分析。若测试组的家蚕死亡率在统计学上显著高于对照组，则说明该受试化合物为对于杀灭昆虫有效的物质，对于制备农药是有用的。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.一种对候选物质进行快速生物活性测定的方法，其特征在于，所述方法包括：

以昆虫为靶标，将候选物质施用于昆虫中肠，观察所述昆虫的变化，从而确定候选物质对于所述昆虫的生物活性；所述的将候选物质施用于昆虫中肠包括：将候选物质经由昆虫的腹部侧方施用于昆虫中肠，或将候选物质经由昆虫的胸部侧方施用于昆虫中肠；

其中，所述的昆虫包括：鳞翅目昆虫、直翅目昆虫或鞘翅目昆虫；所述的昆虫是龄期一致的昆虫。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的候选物质包括：小分子化合物，核酸或肽。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的候选物质设置为多种测试浓度的候选溶液。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在施用候选物质之前和/或之后，还包括步骤：将昆虫进行麻醉处理。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，采用冷处理或二氧化碳进行麻醉处理。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，确定候选物质对于所述昆虫的生物活性的方法包括：观察昆虫在候选物质处理前后的生存率或死亡率，观察昆虫在候选物质处理前后的体重变化，观察昆虫在候选物质处理前后的运动变化，或观察昆虫在候选物质处理前后的生长发育变化。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法中，设置测试组和对照组；在测试组中，将候选物质施用于昆虫中肠；在对照组中，不施用候选物质但其它处理条件同测试组；

观察测试组和对照组中昆虫的变化，若测试组中昆虫的生存率或体重或生长发育指标显著低于对照组，就表明该候选物是杀灭昆虫的潜在物质。