CN101178400B - 对有机磷农药抗性野桑蚕种群的检验方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种对有机磷农药抗性野桑蚕种群的检验方法，其特征在于：首先提取待检野桑蚕的血液，使血液与含有β-乙酸萘酯的底物溶液反应，再用固兰B盐进行显色分析，当反应颜色略带紫色时，判定该野桑蚕个体对有机磷农药有抗性。本发明用于对野外害虫的抗性进行检验，具有客观的代表性；其操作方便，检验成本低，灵敏度高，检验快速，特别适合于现场检验。
Description
技术领域
本发明涉及一种野桑蚕的研究方法，具体涉及一种野桑蚕抗药性的研究方法。
背景技术
野桑蚕(Bombyx mandarina M.)属于鳞翅目昆虫，和家蚕具有共同的起源，栖息在桑树上，取食桑树的叶片，是危害桑树的主要害虫之一。由于长期的自然选择，现有的野桑蚕对农药的抗性远高于家蚕。由于其发生规律和家蚕的蚕期具有同步性，蚕期使用农药防治野桑蚕，桑叶残留的农药会造成家蚕的农药中毒，给野桑蚕的防治带来一定的困难。
目前有机磷类农药是防治野桑蚕的主要农药之一，伴随着有机磷农药的大量使用，野桑蚕在有机磷农药的压力选择下，其对有机磷农药有抗性有来断增强的趋势，我国的主要蚕区都报道过有对有机磷农药抗性野桑蚕种群的出现，严重影响蚕桑的正常生产。对野桑蚕种群的有机磷农药抗性进行检验，鉴定其为敏感种群和抗性种群，对于科学防治方法的确立，具有重要意义。敏感种群可采用常规浓度的防治方法，避免过量使用农药，以减少农药对环境的危害；抗性种群可采用农药品种替换和暂停饲养家蚕集中防治相结合的方法，以提高防治效果。
目前，我国对野桑蚕种群的有机磷农药抗性研究开展的较少，通常使用的方法是把野桑蚕采集后，集中添毒进行试验。由于采用家蚕的饲养方法很难饲养野桑蚕，另外，室内长期饲养的野桑蚕的生理机能较野外的差，不具有客观的代表性，研究发明针对野外生存的野桑蚕种群的有机磷抗性检验方法，对于解决野桑蚕的防治难题具有重要的现实意义。
发明内容
本发明目的是提供一种快速、经济、方便、灵敏度高的对有机磷农药抗性野桑蚕种群的检验方法。
为达到上述目的，本发明通过野桑蚕血液里的酯酶和底物的反应，利用滤纸的显色来检验野桑蚕种群对有机磷农药的敏感性。
本发明采用的技术方案是：一种对有机磷农药抗性野桑蚕种群的检验方法，包括下列步骤：
(1)材料的准备，包括，
将β-乙酸萘酯溶解在丙酮中，浓度为2-3mg/mL，然后加入25倍体积的pH 7.0的磷酸盐缓冲液，再用蒸馏水稀释至2倍，配制成底物溶液；
在桑田随机收集野桑蚕5龄幼虫至少100头，保存在3～8℃培养冰箱中备用；
(2)试验：
取1头上述野桑蚕5龄幼虫，用剪刀剪去幼虫的腹足，取其血液滴于准备好的滤纸上；吸有血液的滤纸浸入37℃的底物溶液中至少15秒，然后放于玻璃板上，在滤纸上放0.2-0.3mL 0.4％的固兰B盐，1分钟后，加0.2-0.3mL的三氯乙酸；
(3)显色分析：
滤纸吸收酶液的部分及四周，反应颜色略带紫色的个体为对有机磷抗性个体，反应颜色不明显的个体为敏感个体；
(4)重复步骤(2)、(3)，记录抗性个体和敏感个体的数量。
上述步骤(4)中，根据所记录的抗性个体和敏感个体的数量，得出对有机磷农药抗性的比率为
上述技术方案中，所述的滤纸选用色谱分析滤纸，应符合下列要求：质地均匀平整，具有一定机械强度，必须不含会影响色谱效果的杂质，也不应与所用显色剂起作用，以免影响分离和鉴别效果。
上述技术方案中，所述底物溶液为随配随用，不适合于长时间保存。
上述技术方案中，试验材料的取样要随机分布，以保证实验结果具有代表性。
上述技术方案中，滴有血液的滤纸应尽快浸入底物溶液里，以免酚氧化酶的氧化作用，影响显色的观察效果。
本发明的技术方案的工作原理为：野桑蚕的血液中含有一定量的酯酶(包括羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶)，抗性个体的酯酶活性相对较强，敏感个体的酯酶活性较弱。酯酶可以和底物β-乙酸萘酯反应，其产物可以和固兰B盐发生显色反应，在酸性条件下带紫色的为抗性个体，不明显的为敏感个体。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：
1.本发明检验方法的对象为野外害虫，具有客观的代表性；
2.本发明检验方法采用幼虫血液与底物溶液反应，并用显色剂进行显色来判断野桑蚕对农药的抗性，操作方便，检验成本低，特别适合于现场检验。
3.本检验方法的灵敏度高，检验快速。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
实施例一：一种对有机磷农药抗性野桑蚕种群的检验方法，通过野桑蚕血液里的酯酶和底物的反应，利用滤纸的显色来检验野桑蚕种群对有机磷农药的敏感性。
其中，所述的选用色谱分析滤纸应质地均匀平整，具有一定机械强度，必须不含会影响色谱效果的杂质，也不应与所用显色剂起作用，以免影响分离和鉴别效果，使用前剪成2cm×2cm的正方形备用。
试验样本的采集时应注意随机选取样本，样本个数在100头以上，以提高检验结果的代表性；要注意不选取生病的野桑蚕，以免影响检验结果。
检验程序包括：
(1)底物溶液的配制
β-乙酸萘酯溶解在丙酮中，浓度为2.5mg/mL，取2mL然后加入50mL pH7.0的磷酸盐缓冲液，再用蒸馏水稀释至104mL，配制成底物溶液；
(2)试验材料的收集
在桑田随机收集野桑蚕5龄幼虫100头以上保存在5℃培养箱中。
(3)试验
用剪刀剪去幼虫的腹足，取其血液100μL滴于准备好的滤纸上，吸有酶液的滤纸浸入37℃的底物溶液中15秒，然后放于玻璃板上，在滤纸上放0.3mL0.4％的固兰B盐，1分钟后，加0.2mL的三氯乙酸。
(4)显色分析：滤纸吸收酶液的部分及四周，反应颜色略带紫色的个体为对有机磷抗性个体，反应颜色不明显的个体为敏感个体。
分别取不同种群的野桑蚕进行上述检测，测试对农药抗性的比率，结果如下表所示：
| 取样数量 | 敏感个体 | 抗性个体 | 比率％ | |
| 种群一 | 100 | 72 | 28 | 28.00 |
| 种群二 | 140 | 25 | 115 | 82.14 |
| 种群三 | 136 | 126 | 10 | 7.35 |
采用本检验方法，可实现经济、快速、准确检验一个地区野桑蚕对有机磷农药的抗性情况，对于有针对性地选择防治方法，提高野桑蚕的防治效果，具有重要意义。
Claims (2)
1. 一种对有机磷农药抗性野桑蚕种群的检验方法，其特征在于，包括下列步骤：
(1)材料的准备，包括，
将β-乙酸萘酯溶解在丙酮中，浓度为2-3mg/mL，然后加入25倍体积的pH 7.0的磷酸盐缓冲液，再用蒸馏水稀释至2倍，配制成底物溶液；
在桑田随机收集野桑蚕5龄幼虫至少100头，保存在3～8℃培养冰箱中备用；
(2)试验：
取1头上述野桑蚕5龄幼虫，用剪刀剪去幼虫的腹足，取其血液滴于准备好的滤纸上；吸有血液的滤纸浸入37℃的底物溶液中至少15秒，然后放于玻璃板上，在滤纸上放0.2-0.3mL 0.4％的固兰B盐，1分钟后，加0.2-0.3mL的三氯乙酸；
(3)显色分析：
滤纸吸收酶液的部分及四周，反应颜色略带紫色的个体为对有机磷抗性个体，反应颜色不明显的个体为敏感个体；
(4)重复步骤(2)、(3)，记录抗性个体和敏感个体的数量。
2. 根据权利要求1所述的有机磷农药抗性野桑蚕种群的检验方法，其特征在于：上述步骤(4)中，根据所记录的抗性个体和敏感个体的数量，得出对有机磷农药抗性的比率为
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