CN106279181B - 一种南极磷虾非酚性弱碱性生物碱的提取纯化及检测方法 - Google Patents

一种南极磷虾非酚性弱碱性生物碱的提取纯化及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种南极磷虾非酚性弱碱性生物碱的提取纯化及检测方法，该方法包括（1）将南极磷虾采用甲醇提取，过滤；滤液浓缩得到甲醇膏；（2）将甲醇膏采用乙醚浸提，过滤；乙醚液蒸发后得到乙醚浸膏；（3）将乙醚浸膏与乙醚接触溶解，得乙醚浸膏液，与酸水溶液接触而进行萃取，萃取得到酸水相；（4）将酸水相与氯仿进行萃取，萃取次数为3~4次，得到氯仿层A；（5）将氯仿层A采用氢氧化钠水溶液萃取，得到碱水层和氯仿层B；（6）除去溶剂，即得。本发明对南极磷虾非酚性弱碱性生物碱的提取工艺进行了优化，通过精确类别分离中萃取次数，使得类别分离后的粗提物中生物碱相对含量直接达到80%以上，能简单、高效地去除己二酸二辛酯和油酸酰胺。

Description

一种南极磷虾非酚性弱碱性生物碱的提取纯化及检测方法
技术领域
本发明涉及一种南极磷虾非酚性弱碱性生物碱的提取纯化及检测方法，属食品、药品和化工领域。
背景技术
南极磷虾(Euphausia superba Dana)因其生物储量巨大，含有丰富的天然活性物质，广泛被人们关注。近年来，关于南极磷虾的研究越来越热。南极磷虾的开发主要集中于南极磷虾剥壳工艺、脱氟技术和营养及活性成分的研究等方面。南极磷虾蛋白、酶、脂类、虾青素、甲壳素等均已有不同程度的研究进展。随着南极磷虾研究的深入，南极磷虾产品也由初级的饲料虾粉等向高端的保健、医药领域发展。加快南极磷虾研究进度有利于我国在南极磷虾产业方面占据优势地位。
生物碱主要来自于植物，又称植物碱，具有镇痛、缓解痉挛、抗菌、消炎、降血压、平喘、抗肿瘤等功效。动物源的生物碱主要来源于两栖类、海珊瑚、海绵等。虽有推测南极磷虾中含有生物碱，但并未清楚生物碱的种类，而且目前关于南极磷虾中的生物碱还未有相关文献或专利报道。
因此，研究南极磷虾生物碱的种类以及生物碱的提取纯化及检测方法，对南极磷虾资源的开发利用具有十分重要的意义。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种南极磷虾非酚性弱碱性生物碱提取纯化及检测方法。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明的第一个目的是提供一种南极磷虾非酚性弱碱性生物碱的提取纯化方法，步骤如下：
(1)将南极磷虾与甲醇接触而进行提取，过滤，得滤液；滤液蒸发浓缩得到甲醇膏；
(2)将步骤(1)中的甲醇膏与乙醚接触而进行浸提，过滤，得乙醚液；乙醚液蒸发后得到乙醚浸膏；
(3)将步骤(2)中的乙醚浸膏与乙醚接触而进行溶解，得乙醚浸膏液，使其与酸水溶液接触而进行萃取，萃取得到酸水相；
(4)将步骤(3)中的酸水相与氯仿接触而进行萃取，萃取次数为3～4次，分离得到氯仿层A；
(5)将步骤(4)中的氯仿层A与氢氧化钠水溶液接触而进行萃取，分离得到碱水层和氯仿层B；
(6)将步骤(5)中的氯仿层B蒸发除去溶剂，即得到南极磷虾非酚性弱碱性生物碱样品。
步骤(1)中，南极磷虾在接触甲醇提取前先经过冷冻干燥处理。由于南极磷虾体内的酶具有很高的活性，南极磷虾被捕捞后，其体内的内源消化酶能高活性的降解蛋白质，使死亡后的组织快速分解，加速了南极磷虾的自溶、腐败和变质；通过对南极磷虾进行冷冻干燥预处理，能够防止南极磷虾自溶，有效的保持南极磷虾的品质。
步骤(1)中，所述南极磷虾与甲醇加入量的比为1g:(6-10)mL，提取温度为75～85℃，优选80℃，甲醇提取的次数为7～9次，每次浸提的时间为1-2h，提取方式可以为回流提取或搅拌提取。甲醇回流提取的次数选为7～9次，能够尽可能多的分离提取出非酚性弱碱性生物碱。
步骤(2)中，所述甲醇膏与乙醚加入量的比为1g:(4-6)mL，加入乙醚浸提的次数为4-6次，每次浸提的时间为0.5-1h。乙醚的提取次数选为4-6次，不仅有效分离出南极磷虾中的非酚性弱碱性生物碱，还能尽量减少提取次数的增加所带来的能源浪费。
步骤(3)中，不同条件所得乙醚浸膏量不同，乙醚复溶时加入乙醚的量可以根据实际情况进行调整。一般所述乙醚浸膏与乙醚的加入量比为1g：8～12mL(优选1g:10mL)，乙醚膏先用适量乙醚溶解，再与酸水萃取，可以增加与酸水的接触面积，保证碱性物质充分溶于酸水层。
乙醚很容易旋蒸，即便全部整除，花费的时间也较短。其次实验发现，用旋蒸保留的乙醚不能使乙醚浸提物全部溶解。
步骤(3)中，所述酸水溶液为硫酸水溶液或者酒石酸水溶液，优选的为硫酸水溶液；所述乙醚浸膏液与酸水溶液加入量的体积比为1:(10-30)。所述硫酸水溶液的体积分数为 1～3％，优选的，所述硫酸水溶液的体积分数为2％，选择该浓度的硫酸水溶液既能保证足够的酸性以去除酸性杂质，又防止硫酸浓度过高引起目的物的氧化分解。
步骤(4)中，所述酸水相和氯仿的体积比为1～2：1，优选的，所述酸水层和氯仿的体积比为1：1。氯仿与酸水相的搅拌萃取次数为3-4次，每次搅拌萃取时间为1～1.5h(优选搅拌时间为1h)，充分混匀，尽可能使目标物质溶于氯仿层。
本发明的萃取工序的萃取溶剂为氯仿时，不仅在萃取效率、分液性方面而且在萃取溶剂的易获得性方面，特别优选。
所述氯仿与酸水相的搅拌萃取次数为3-4次，发明人经过试验发现，通过调整限定萃取次数为3～4次，不仅能尽可能的使目标生物碱溶于氯仿层，又能减少其他杂质，尤其是己二酸二辛酯和油酸酰胺的引入。
步骤(5)中，所述氯仿层A和氢氧化钠水溶液的体积比为1～2：1，优选的，所述氯仿层A和氢氧化钠水溶液的体积比为1：1。所述氢氧化钠水溶液的体积分数为1～3％。
加入氯仿与氢氧化钠水溶液的搅拌萃取次数为6-7次，每次搅拌萃取时间为1～1.5h(优选为1h)，充分混匀，尽可能除去弱酸性杂质。
发明人经过试验发现，将萃取次数限定为6～7次，能有效的除去步骤(4)引入的少许己二酸二辛酯和油酸酰胺及其他小分子酰胺类杂质。
本发明中的搅拌方式为机械搅拌或磁力搅拌。
本发明中采用分液漏斗进行静置分液的方式进行萃取。
本发明的第二个目的是提供采用上述提取纯化方法制备得到的南极磷虾非酚性弱碱性生物碱样品，其中，所述样品至少包含两种非酚性弱碱性生物碱，分别是5,10-二乙氧基
-2,3,7,8-四氢-1H,6H-吡咯并[1,2-a；1’,2’-d]吡嗪 (5,10-diethoxy-2,3,7,8-tetrahydro-1H,6H-dipyrrolo[1,2-a；1′,2′-d]pyrazine,简称DTDP)、六氢 -3-(2-甲基丙基)-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮{Cyclo(Pro-Leu)}。优选的，所述样品还包含六氢-3-(苯基甲基)-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮{Cyclo(Pro-Phe)}。
本发明的第三个目的是提供一种采用上述方法提取的南极磷虾非酚性弱碱性生物碱的检测方法，该方法采用气相色谱-质谱法(GC-MS)分析检测，检测条件为：DB-1色谱柱；载气：氦气；流速：0.8～1.2mL/min，溶剂延迟2～2.2min；升温程序：初始温度为45～55℃，以1.8～2.2℃/min升温到55～65℃，再以25～35℃/min升到240～260℃，保持5～10min。离子化方式:EI，60～80eV；离子源温度:240～260℃；载气:氦气；柱流速：0.8～1.2mL/min。以上条件是在对被分离检测物质的种类以及性质并不明确的情况下，本发明人经过大量实验与分析，进行摸索得到的色谱-质谱条件。
优选的，为有效分离检测提取得到的物质成分，所述检测条件为：DB-1色谱柱，型号为30m×0.25mm×0.25μL；载气：氦气；流速：1mL/min，溶剂延迟2.06min；升温程序：初始温度为50℃，以2℃/min升温到60℃，再以30℃/min升到250℃，保持8min。离子化方式:EI，70eV；离子源温度:250℃；载气:氦气；柱流速：1.0mL/min。
本发明中的一个技术方案具有如下的有益效果：
(1)本发明采用以上提取纯化和检测方法，首次发现三种非酚性弱碱性生物碱，并从南极磷虾中提取分离得到了三种稳定存在的具有较强生物活性的非酚性弱碱性生物碱：5,10-二乙氧基-2,3,7,8-四氢-1H,6H-吡咯并[1,2-a；1’,2’-d]吡嗪(5,10-diethoxy-2,3,7,8 -tetrahydro-1H,6H-dipyrrolo[1,2-a；1′,2′-d]pyrazine,简称DTDP)；六氢-3-(2-甲基丙基)-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮{Cyclo(Pro-Leu)}；六氢-3-(苯基甲基)-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮 {Cyclo(Pro-Phe)}。经过本发明的研究得到，南极磷虾中主要存在三种非酚性弱碱性生物碱，对南极磷虾资源的开发利用具有十分重要的意义。
(2)本发明针对南极磷虾这一特定的海洋原料，经过大量的实验与分析，探索研究得到一种提取率和纯度相对较高的提取方法，该提取方法简单，通过控制分离步骤的萃取次数，使得类别分离后的粗提物中生物碱相对含量直接达到80％以上，能简单、高效地去除己二酸二辛酯和油酸酰胺以及其他小分子酰胺类杂质。
(3)本发明主要是针对南极磷虾非酚性弱碱性生物提取过程杂质的去除，尤其是己二酸二辛脂和油酸酰胺的去除进行了研究，这对优化南极磷虾生物碱提取、简化工艺，降低成本有着十分重要的意义。
(4)本发明通过大量的实验和分析，选择了具有一定参数的气相色谱-质谱法(GC-MS) 对提取的未知生物碱进行分析检测，该检测方法能有效、准确的分离和检测生物碱的种类和含量。
附图说明
图1为实施例1样品的GC-MS总离子流色谱图；
图2为实施例2样品的GC-MS总离子流色谱图；
图3为实施例3样品的GC-MS总离子流色谱图。
图4为对比例1样品的GC-MS总离子流色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1
称取100g冷冻干燥的南极磷虾，加入甲醇800ml，80摄氏度回流提取7次，每次1h，至浸提液无色。过滤，滤液旋蒸后得甲醇膏。向甲醇膏中加入乙醚浸提4次，每次1h，过滤得乙醚浸提液；乙醚浸提液旋蒸浓缩后得乙醚浸膏。乙醚浸膏加适量乙醚溶解，比例为 1g：10mL，再加入10倍体积的体积分数为2％的H2SO4水溶液搅拌萃取，分液得酸水层。向酸水层加入等体积的氯仿搅拌萃取3次，每次搅拌1h，静置后分液得氯仿层A。向氯仿层A中加入等体积的体积分数为2％NaOH水溶液搅拌萃取6次，每次搅拌1h，静置后分液得氯仿层B。氯仿层B蒸干氯仿后，得样品1，约9.98mg。
对样品1采用GC-MS法对物质成分进行检测，检测条件如下：
检测仪器：Agilent 7890GC-5975MS；
GC-MS条件：DB-1色谱柱(30m×0.25mm×0.25μL)；载气：氦气；流速：1mL/min，溶剂延迟2.06min；升温程序：初始温度为50℃，以2℃/min升温到60℃，再以30℃/min升到250℃，保持8min。离子化方式:EI，70eV；离子源温度:250℃；载气:氦气；柱流速：1.0mL/min；进样方式:分流，比例50:1；进样体积:0.2μL。
经检测，所得样品1中生物碱成分总相对含量达到96.33％，且不含己二酸二辛酯和油酸酰胺。其GC-MS总离子流色谱图如图1所示。所得样品中主要生物碱成分如下表1。
表1：GC-MS分析样品1中主要生物碱成分
从表1和图1可以看出，本实施例的提取纯化方法从南极磷虾中分离得到了三种稳定存在的具有较强生物活性的非酚性弱碱性生物碱，三种生物碱的相对含量较高，且杂质较少。
实施例2
称取100g冷冻干燥的南极磷虾，加入甲醇1000ml，80摄氏度回流提取8次，每次1.5h，至浸提液无色。过滤，滤液旋蒸后得甲醇膏。向甲醇膏中加入乙醚浸提5次，每次1h,过滤得乙醚浸提液；乙醚浸提液旋蒸浓缩后得乙醚浸膏。乙醚浸膏加适量乙醚溶解，比例为1g：10mL，再加入20倍体积的体积分数为1％的H2SO4水溶液搅拌萃取，分液得酸水层。向酸水层加入等体积的氯仿搅拌萃取3次，每次搅拌1h，静置后分液得氯仿层A。向氯仿层A中加入等体积的体积分数为1％NaOH水溶液搅拌萃取7次，每次搅拌1h，静置后分液得氯仿层B。氯仿层B蒸干氯仿后，得样品2，约9.87mg。
对样品采用GC-MS法对物质成分进行检测，检测方法同实施例1。经检测，所得样品1中生物碱成分总相对含量达到86.79％，且不含己二酸二辛酯和油酸酰胺。其GC-MS总离子流色谱图如图2所示。
表2：GC-MS分析样品1中主要生物碱成分
从表2和图2可以看出，本实施例的提取纯化方法从南极磷虾中分离得到了两种稳定存在的具有较强生物活性的非酚性弱碱性生物碱，两种生物碱的相对含量较高，且杂质较少。
实施例3
称取100g冷冻干燥的南极磷虾，加入甲醇600ml，80摄氏度回流提取9次，每次2h，至浸提液无色。过滤，滤液旋蒸后得甲醇膏。向甲醇膏中加入乙醚浸提6次，每次0.5h，过滤得乙醚浸提液；乙醚浸提液旋蒸浓缩后得乙醚浸膏。乙醚浸膏加适量乙醚溶解，比例为1g：10mL，再加入体积分数为3％的H2SO4水溶液搅拌萃取，分液得酸水层。向酸水层加入等体积的氯仿搅拌萃取4次，每次搅拌1h，静置后分液得氯仿层A。向氯仿层A中加入等体积的体积分数为3％NaOH水溶液搅拌萃取7次，每次搅拌1h，静置后分液得氯仿层 B。氯仿层B蒸干氯仿后，得样品3，约9.76mg。
对样品采用GC-MS法对物质成分进行检测，检测方法同实施例1。经检测，所得样品1中生物碱成分总相对含量达到82.70％，且不含己二酸二辛酯和油酸酰胺。其GC-MS总离子流色谱图如图3 所示。
表3：GC-MS分析样品1中主要生物碱成分
从表3和图3可以看出，本实施例的提取纯化方法从南极磷虾中分离得到了三种稳定存在的具有较强生物活性的非酚性弱碱性生物碱，三种生物碱的相对含量较高，且杂质较少。
对比例1
称取100g冷冻干燥的南极磷虾，加入甲醇800ml，80摄氏度回流提取7次，每次1h，至浸提液无色。过滤，滤液旋蒸后得甲醇膏。向甲醇膏中加入乙醚浸提4次，每次1h，过滤得乙醚浸提液；乙醚浸提液旋蒸浓缩后得乙醚浸膏。乙醚浸膏加适量乙醚溶解，比例为 1g：10mL，再加入10倍体积的体积分数为2％的H2SO4水溶液搅拌萃取，分液得酸水层。向酸水层加入等体积的氯仿搅拌萃取6次，每次搅拌1h，静置后分液得氯仿层A。向氯仿层A中加入等体积的体积分数为2％NaOH水溶液搅拌萃取6次，每次搅拌1h，静置后分液得氯仿层B。氯仿层B蒸干氯仿后，得样品1，约17.78mg。
对样品1采用GC-MS法对物质成分进行检测，检测条件如下：
检测仪器：Agilent 7890GC-5975MS；
GC-MS条件：DB-1色谱柱(30m×0.25mm×0.25μL)；载气：氦气；流速：1mL/min，溶剂延迟2.06min；升温程序：初始温度为50℃，以2℃/min升温到60℃，再以30℃/min升到250℃，保持8min。离子化方式:EI，70eV；离子源温度:250℃；载气:氦气；柱流速：1.0mL/min；进样方式:分流，比例50:1；进样体积:0.2μL。
经检测，所得样品中主要非酚性弱碱性生物碱成分如下表4，其主要生物碱成分为5,10- 二乙氧基-2,3,7,8-四氢-1H,6H-吡咯并[1,2-a；1’,2’-d]吡嗪(5,10-diethoxy-2,3,7,8 -tetrahydro-1H,6H-dipyrrolo[1,2-a；1′,2′-d]pyrazine,简称DTDP)、六氢-3-(2-甲基丙基)-吡咯并 [1,2-a]吡嗪-1,4-二酮{Cyclo(Pro-Leu)}、六氢-3-(苯基甲基)-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮 {Cyclo(Pro-Phe)}；主要杂质为油酸酰胺和己二酸二辛酯以及其他小分子酰胺类杂质。对 GC-MS总离子流色谱图如图4所示。
表4：GC-MS分析样品1中主要生物碱成分
从表4和图4可以看出，本对比例的提取方法虽然从南极磷虾中分离得到了三种稳定存在的具有较强生物活性的非酚性弱碱性生物碱，但是杂质较多，主要杂质为油酸酰胺和己二酸二辛酯以及其他小分子酰胺类杂质。经过分析，主要原因是酸水相和氯仿萃取的次数不合适，导致引入较多的油酸酰胺和己二酸二辛酯杂质以及其他小分子酰胺类杂质。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种南极磷虾非酚性弱碱性生物碱的提取纯化方法，其特征是，步骤如下：
(1)将南极磷虾与甲醇接触而进行提取，过滤，得滤液；滤液蒸发浓缩得到甲醇膏；
(2)将步骤(1)中的甲醇膏与乙醚接触而进行浸提，过滤，得乙醚液；乙醚液蒸发后得到乙醚浸膏；
(3)将步骤(2)中的乙醚浸膏与乙醚接触而进行溶解，得乙醚浸膏液，使其与酸水溶液接触而进行萃取，萃取得到酸水相；
(4)将步骤(3)中的酸水相与氯仿接触而进行萃取，萃取次数为3～4次，分离得到氯仿层A；
(5)将步骤(4)中的氯仿层A与氢氧化钠水溶液接触而进行萃取，分离得到碱水层和氯仿层B；
(6)将步骤(5)中的氯仿层B蒸发除去溶剂，即得到南极磷虾非酚性弱碱性生物碱样品；所述样品包含5,10-二乙氧基-2,3,7,8-四氢-1H,6H-吡咯并[1,2-a；1’,2’-d]吡嗪和六氢-3-(2-甲基丙基)-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮。
2.如权利要求1所述的提取纯化方法，其特征是：所述样品还包含六氢-3-(苯基甲基)-吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮。
3.如权利要求1所述的提取纯化方法，其特征是：步骤(1)中，南极磷虾在接触甲醇提取前先经过冷冻干燥处理。
4.如权利要求1所述的提取纯化方法，其特征是：步骤(1)中，所述南极磷虾与甲醇加入量的比为1g:(6-10)mL，提取温度为75～85℃，甲醇提取的次数为7-9次，每次浸提的时间为1-2h，提取方式为回流提取或搅拌提取。
5.如权利要求1所述的提取纯化方法，其特征是：步骤(2)中，所述甲醇膏与乙醚加入量的比为1g:(4-6)mL，加入乙醚浸提的次数为4-6次，每次浸提的时间为0.5-1h。
6.如权利要求1所述的提取纯化方法，其特征是：步骤(3)中，所述乙醚浸膏液与酸水溶液加入量的体积比为1:(10-30)。
7.如权利要求1所述的提取纯化方法，其特征是：步骤(3)中，所述酸水溶液为硫酸水溶液或酒石酸水溶液。
8.如权利要求7所述的提取纯化方法，其特征是：所述硫酸水溶液的体积分数为1～3％。
9.如权利要求1所述的提取纯化方法，其特征是：步骤(4)中，所述酸水相和氯仿的体积比为1～2：1，每次搅拌萃取时间为1～1.5h。
10.如权利要求1所述的提取纯化方法，其特征是：步骤(5)中，所述氯仿层A和氢氧化钠水溶液的体积比为1～2：1，所述氢氧化钠水溶液的体积分数为1～3％；加入氯仿与氢氧化钠水溶液的搅拌萃取次数为6～7次，每次搅拌萃取时间为1～1.5h。
11.如权利要求1所述的提取纯化方法，其特征是：所述提取纯化方法提取得到的生物碱的检测方法为：采用气相色谱-质谱法，检测条件为：DB-1色谱柱，载气：氦气。
12.如权利要求11所述的提取纯化方法，其特征是，所述提取纯化方法提取得到的生物碱的检测方法还包括以下检测条件：流速：0.8～1.2mL/min，溶剂延迟2～2.2min；升温程序：初始温度为45～55℃，以1.8～2.2℃/min升温到55～65℃，再以25～35℃/min升到240～260℃，保持5～10min；离子化方式：EI，60～80eV；离子源温度：240～260℃；载气：氦气；柱流速：0.8～1.2mL/min。
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