CN106255890A - 扫描离子电导显微术 - Google Patents

Abstract

一种用于使用SICM而检查浸在电解质溶液中的样本的表面的方法，包括：控制浸在电解质溶液中的第一电极与第二电极之间的电位以在电解质溶液中诱发离子电流，第一电极的浸没部分包含在微量移液管中，并且第二电极处于微量移液管外部；在控制微量移液管相对于支撑样本的平台移动的同时记录离子电流；以及从离子电流和校准数据确定样本的表面高度轮廓。所述电位可以根据扩频调制信号来控制。所述微量移液管移动可以是根据AC模式式样，其中AC模式式样具有大于微量移液管、第一电极以及被配置成控制所述微量移液管的z轴移动的第一压电致动器的组装件的谐振频率的调制频率。

Description

扫描离子电导显微术

技术领域

本公开涉及扫描离子电导显微术(SICM)，并且在其使用中，例如在软表面和界面，包括细胞和褶皱基质结构的软表面和界面的研究中提高效率和准确性。还公开对组合式SICM与扫描电化学显微术(SECM)技术的改进，以例如用于硬表面上发生的化学反应的研究中。

背景技术

软表面是许多自然现象，包括细胞膜和不互溶液滴，特别在浸渍在液体中时的特征。无论是动物还是植物，细胞都是生物体的最基本单元。其结构和组成以及其各种成分如何起作用的研究给出对于在集成生物系统中发生的复杂过程的有价值的见解。这需要允许实时地、非侵入式地并且以模拟生理条件以使得细胞功能性得以保持的解决方案来进行细胞样本的调查。

光学显微术(使用可见光)已广泛应用到研究活细胞。然而，分辨率由于衍射而受限于约200到250nm。许多其它成像和测量技术使用施加力的探测方法，而力可由于干扰所观测的表面而诱发误差或需要在进行此观测之前将表面改质。

例如，一种常用方法是电子显微术，其中可以获得具有约10nm的分辨率的图像。然而，对真空或低压气体的需要可在可进行成像之前使表面稳定化并移除液体。因此，通常不可以将电子显微镜用于研究活细胞。

另一可能的高分辨率技术是基于扫描探针显微术(SPM)的使用，其中尖锐探针末端紧密接近所研究的样本而扫描。可根据末端相对于样本的位置而绘制随之发生的相互作用以及因此的化学/物理特性，以产生此测量的相互作用的轮廓。通常应用到生物成像的SPM族的成员有原子力显微术(AFM)和扫描离子电导显微术(SICM)。

AFM常用于研究表面对机械力或压力的响应。AFM由悬臂组成，其中悬臂在其端部具有用于扫描试样表面的尖锐末端(探针)。当使末端接近样本表面时，末端与样本之间的力导致悬臂的偏转。然而，末端悬臂弹簧常数影响所研究的表面将因测量或检测过程而移位多少，并对可研究的表面的软度设定限制。当以接触或轻敲模式使用时，AFM的另一难点是表面有可能黏着到探针末端，从而在缩回期间更改测量，并且导致末端的污染以及对表面的机械损坏。

扫描离子电导显微术(SICM)是一种形式的扫描探针显微术(SPM)，允许在不需要任何接触或力相互作用的情况下并且在实验对象的正常液体环境中对软表面进行高分辨率成像。在SICM中，电解质填充的(通常基于玻璃、石英或碳)的微量移液管(micropipette)在浸在电解质中的样本的表面上方扫描。SICM可有效地用于通过控制此探针的位置来扫描例如活细胞的表面。离子电流在两个电极之间被诱发：一个在移液管内，并且另一个在移液管外，在电解质溶液中。

离子电流信号取决于微量移液管的电阻(R_P)和通路电阻(R_AC)的组合，其中通路电阻(R_AC)是沿着从浴到微量移液管开口的收敛路径的电阻。R_P取决于微量移液管的末端直径和锥角，而R_AC显示对浴和样本的电化学特性、几何结构和相对于探针的间距的复杂依赖性。

随着微量移液管接近样本的表面，离子电流流动从相对恒定的稳态电流改变，并且开始极快减小。微量移液管因离子电流减小而与样本相距的距离处于微量移液管的内径的两倍到一半的区中。对于玻璃微量移液管来说，此内径可小达约50nm，并且对于石英微量移液管来说，内径可小达约20nm。

允许SICM作为复杂表面的非接触式轮廓描绘方法而建立的最佳末端-样本间距是末端直径的约一半。可使用SICM实现的空间分辨率取决于微量移液管末端孔的大小，并且通常介于50nm与1.5μm之间。

通过在邻近位置处重复使微量移液管与表面接触，可形成表面的3D形貌图或图像。

SICM系统可在许多模式中操作，包括跳跃模式(hopping mode)、交流(AC)模式和手动模式。

最常用的扫描方法之一被称为跳跃模式光栅扫描。通常，在此方法中，微量移液管的位置和高度受控制器控制，其中控制器将信号发送到允许对微量移液管的X、Y和Z尺寸进行精确控制的压电挠曲平台。控制器通常经由低噪声探头平台而监视离子电流。

通常如下执行跳跃模式光栅扫描。始于某一原点，将微量移液管上升到被先验性地视为高于样本的任何特征的高度(Z轴)。微量移液管接着通过控制器来降低，而监视离子电流直到检测到指示样本的表面接近的小电流降低为止。电流降低可改变，但通常将处于标称稳态电流的0.1％到10％的区中。控制器将记录点的X、Y和Z位置，并且接着在移动到光栅扫描的下一X、Y位置之前将移液管移动回安全高度。接着再次将微量移液管降低到表面，并且由控制器记录X、Y、Z读数。此过程可继续直到进行样本的区的完全扫描为止。通常，进行涉及128个X位置和128个Y位置的阵列的光栅扫描，从而涵盖10μm²的区中的样本区域。

已提出扫描算法的各种改进。例如，可在较高高度下执行光栅扫描的第一线(以避免表面特征)，接着基于在先前线扫描中所测量的高度而在较低高度下执行后续扫描。或者，并非对线进行扫描，控制器可选择长方形的顶点。取决于长方形的表面粗糙度的量度(及其因此对正执行的调查的可能重要性)，选择另一长方形，或选择第一长方形内的点以进行检查。

在AC模式中，将正弦电流施加到用于控制移液管的Z轴位置的压电装置。移液管在样本的表面上方以小振幅振荡。随着移液管接近样本的表面，离子电流开始以与移液管的AC调制成比例的速率改变。锁定放大器可用于锁相到Z移液管调制的频率。此放大器的使用在拒绝处于调制信号的频带外的噪声方面极其有益。

在使用此AC模式调制的移液管移动的情况下，可检测AC电流的包络，并将其用于检测表面。通常，使用所检测的电流包络来调整移液管相对于表面的平均位置，以使得移液管相对于样本维持近乎恒定的距离。以此方式，可按类似于跳跃模式的方式使用光栅扫描机构来扫描样本的形貌。

在所有这些操作模式中，移液管遵循类似程序：

1.移动到XY位置；

2.等待短时间段让微量移液管的机械振荡衰退；

3.在监视电流的同时朝向样本表面缓慢降低微量移液管；

4.等待短时间段让微量移液管的机械振荡衰退；

5.在相同XY位置重复步骤3和4以针对离子电流而实现稳定样本；

6.将微量移液管升高到适当安全高度，接着移动到下一XY位置，并从步骤1重复。

上文概述的程序提供用于测量样本的3D形貌的良好的准确方法，但包括许多延迟来允许机械振荡衰退并还允许微量移液管升高和降低。从单个点收集图像所花费的时间可通常花费数十毫秒，并且这针对合理复杂性的图像，导致接近数十分钟的总扫描时间。对于需要图像的快速改变的一些应用来说，这些扫描时间可过高而不可接受。例如，活生物细胞随时改变其表面构造。在从常规SICM获得的图像中的所扫描的活细胞表面上的邻近区域之间观测到漂移和缝合效应。

在探针朝向表面行进期间，探针的移动可在电流降低到低于预设阈值之后持续第一时间、持续给定时间或针对给定数量的测量样本降低到低于预设阈值之后暂停。这些额外测量提供关于在接近表面的区中离子电流与从探针到该表面的距离之间的关系的信息。此关系的图形表示通常被称为接近曲线。此曲线可指示表面的特性，包括其粗糙度、其相对于周围溶液的传导率或与探针轴线正交的程度。

随着移液管(探针)接近表面而发生的离子电流的减小可用于确定关于此点的样本的表面曲率和机械特性的信息。电流的减小的形状包含关于表面的这些额外性质以及形貌的信息。例如，如果表面较软，那么移液管需要进一步向下移动以获得相同的离子电流减小，这是因为由于移液管接近表面时所施加的力，表面随着移液管接近而移动开。如果表面较弯曲，那么移液管也需要进一步向下移动。通过分析接近曲线并可选地在不同的所施加的电压——这将改变所施加的力——下在相同地点进行接近，可以获得额外信息，并且因此同时将这些额外特性绘图。因此可以将其它表面特性以及样本形貌绘图。这可在所获得的图像中提供较高对比度，从而使得某些感兴趣特征较容易检测，例如，细胞膜下的基础细胞骨架。

SICM探针可被调适成使得当接近所研究的表面而定位时，局部化的并且受控制的压力或力可经由液体通过探针的经调节的流动而施加到测量表面。此压力的施加可用于通过监视所施加的压力与表面的所得移动之间的关系来测量表面的柔性或弹性。此压力的施加还可用于刺激细胞表面组份，例如，机械敏感离子通道，其中此激励的后续测量是通过监视电生理或化学信号的随之发生的改变而进行。

如果表面足够柔韧，那么施加到表面的压力将导致表面移动。正压力，即，穿过探针朝向表面的流动具有推动表面远离探针的效果，从而增大表面与探针末端之间的间距。负压力将表面朝向探针末端吸引，从而减小间距。所施加的压力与表面的所得移动之间的关系可因此提供关于表面结构的弹性的信息。

SICM系统的另一应用是辅助根据被称为扫描电化学显微术(SECM)的过程而收集离子电流信息。SECM是用于基于物质的性质以及与物质相距的距离来对样本的电化学反应性进行电分析测量的通用工具。

通常，SECM将三电极系统用于电解质溶液中的样本。工作电极连接到样本，参考电极处于电解质溶液中，并且对置电极呈探针的形式。SECM系统中的目标是在通过测量对置电极与工作电极之间的表面活性电流来测量样本的氧化还原活性的同时在工作电极与参考电极之间维持恒定的已知电位。恒电位仪通常用于在收集表面活性电流的同时管理所需电位。

当前，SECM的注意力已转向微量移液管的使用，以在使用例如AFM或SICM等额外技术而在探针与样本表面之间测量并维持已知距离的同时，促进样本与微量移液管或探针之间的氧化还原反应的测量。

一种实施组合式SICM与SECM的方式是使用由θ毛细管制成的双筒移液管。可使用激光移液管拉针器而获得这些微量移液管的孔的极小尺寸，其中在100nm的区中的孔大小是可行的。穿过移液管的两个筒之间的弯月形层的电流流动由SICM系统使用以监视移液管相对于样本的表面的位置。来自移液管中的对置电极以及工作电极的电流的流动接着被记录，并且是样本的氧化还原活性的量度。组合SICM和SECM允许样本的SECM分析在空间上与来自样本的特征协调。SICM系统用于产生样本的形貌，并且用于将SECM微量移液管导引到感兴趣位置并且收集离子电流供SECM系统进一步分析。

SICM和SECM的常规部署通常需要并列地部署的两个微量移液管。虽然此做法被频繁使用，但在微量移液管的对准以及实现彼此紧密接近的微量移液管方面产生问题。

如前文所解释，需要一种增强的SICM方法和系统，其中该增强的SICM方法和系统无论是单独使用还是结合SECM而使用都改进SICM技术的速度、效率和准确性中的一个或更多个。

发明内容

根据第一方面，提供一种用于使用扫描离子电导显微术(SICM)而检查浸在电解质溶液中的样本的表面的方法，包括：使用扩频调制信号而控制浸在电解质溶液中的第一电极与第二电极之间的电位以在电解质溶液中诱发离子电流，第一电极的浸没部分包含在微量移液管中，并且第二电极处于微量移液管外部；在控制微量移液管相对于支撑样本的平台移动的同时记录离子电流；解调制所记录的离子电流；以及从所解调制的离子电流和校准数据确定样本的表面高度轮廓。

该扩频调制可包括在时域或频域中对多个信号多路复用。

该扩频调制可通过二进制相移键控(BPSK)来进行。该扩频调制可通过正交相移键控(QPSK)来进行。该扩频调制可通过n正交振幅调制(n-QAM)来进行。该扩频调制可通过频率调制(FM)来进行。该扩频调制可通过振幅调制(AM)来进行。

该扩频调制可在预定载波频率上执行。该载波频率可大于100Hz。

该扩频调制可使用正交扩展码来执行。所述正交扩展码可以是沃尔什码(Walshcodes)。所述正交扩展码可以是正交可变扩展因子(OVSF)码。

该扩频调制可使用2个不同扩展码来执行。该扩频调制可使用3个不同扩展码来执行。

该扩频调制可使用伪随机加扰码来执行。所述伪随机加扰码可以是金氏码序列(Gold code sequences)。所述伪随机加扰码可以是m序列。

该方法可还包括对所记录的离子电流进行滤波。该滤波可使用带通滤波器来进行。

该方法可还包括回馈表面高度轮廓数据以便控制该微量移液管移动来追踪样本表面。

表面追踪信号可使用短相关器来提供。

该扩频调制可至少使用用于表面追踪的第一扩展码以及用于成像的第二扩展码来执行。该第二码可比该第一码长。

该解调制可使用长相关器来执行。

该方法可还包括执行去卷积算法以减少微量移液管移动所导致的图像模糊。

该确定可包括以截头锥体来对所解调制的离子电流去卷积，其中该截头锥体将样本表面作为其底部，并将微量移液管孔作为其顶部。

该方法可还包括从用于扫描电化学显微术(SECM)的第三电极收集数据。

该方法可还包括相对于该第一电极将直流(DC)偏移电压施加到该第三电极。

第一压电致动器可用于微量移液管的相对精细的z轴移动控制。第二压电致动器可用于样本平台的相对粗略的z轴移动控制。

该微量移液管移动可以是根据跳跃模式式样。

该微量移液管移动可以是根据交流(AC)模式式样。

该AC模式式样可具有大于微量移液管、第一电极以及被配置成控制该微量移液管的z轴移动的第一压电致动器的组装件的谐振频率的调制频率。

根据第二方面，提供一种用于使用AC模式扫描离子电导显微术(SICM)而检查浸在电解质溶液中的样本的表面的方法，包括：控制第一压电致动器以相对于支撑样本的平台而改变包含浸没在电解质溶液中的第一电极的一部分的微量移液管的高度，使用大于致动器、微量移液管和第一电极的组装件的谐振频率的调制频率的交流电(AC)，以便在该第一电极与处于微量移液管外部并浸在电解质溶液中的第二电极之间在电解质溶液中诱发离子电流；在控制微量移液管相对于样本平台移动的同时记录离子电流，该移动具有垂直于AC高度改变的分量；以及从所记录的离子电流和校准数据确定样本的表面高度轮廓。

该AC调制频率可至少20倍于该谐振频率。

该AC调制频率可以是约60kHz。

在该记录之前，该AC模式移动可通过低于该AC调制频率的初始AC频率来启用，其中该初始AC频率根据斜坡函数(ramp function)历经预定时间段而逐渐升高到该AC调制频率。

该斜坡函数可以是该组装件的谐振的复数包络的倒数(inverse of a complexenvelope of resonances of said assembly)。

该预定时间段可以是约3ms。

该方法可还包括根据通过所记录的离子电流的复数包络的量值所调制的信号而驱动第二压电致动器以控制该样本平台的z轴移动。

电压校正可应用到被配置成控制该样本平台的z轴移动的第二压电致动器。该电压校正可随着所检测的离子电流线性地缩放。

该缩放的比例常数可经由校准过程和/或从与电解质溶液相关联的预定常数确定。

被配置成控制该样本平台的z轴移动的第二压电致动器的驱动信号的带宽可小于该第二压电致动器与微量移液管、样本平台、样本容器、电解质与样本的组装件的谐振频率。

该方法可还包括使用扩频调制信号而控制该第一电极与该第二电极之间的电位。该确定可包括解调制所记录的离子电流。

该扩频调制可包括在时域或频域中对多个信号多路复用。

该扩频调制可通过二进制相移键控(BPSK)来进行。该扩频调制可通过正交相移键控(QPSK)来进行。该扩频调制可通过n正交振幅调制(n-QAM)来进行。该扩频调制可通过频率调制(FM)来进行。该扩频调制可通过振幅调制(AM)来进行。

该扩频调制可在预定载波频率上执行。该载波频率可大于100Hz。

该扩频调制可使用正交扩展码来执行。所述正交扩展码可以是沃尔什码。所述正交扩展码可以是正交可变扩展因子(OVSF)码。

该扩频调制可使用2个不同扩展码来执行。该扩频调制可使用3个不同扩展码来执行。

该扩频调制可使用伪随机加扰码来执行。所述伪随机加扰码可以是金氏码序列。所述伪随机加扰码可以是m序列。

该方法可还包括可选地使用带通滤波器来对所记录的离子电流进行滤波。

该方法可还包括回馈表面高度轮廓数据以便控制该微量移液管移动来追踪样本表面。

表面追踪信号可使用短相关器来提供。

该扩频调制可至少使用用于表面追踪的第一扩展码以及用于成像的第二扩展码来执行，该第二码比该第一码长。

该解调制可使用长相关器来执行。

该方法可还包括执行去卷积算法(de-convolution algorithm)以减少微量移液管移动所导致的图像模糊。

该确定可包括以截头锥体(truncated cone)来对所解调制的离子电流去卷积(deconvolving)，其中该截头锥体将样本表面作为其底部，并将微量移液管孔作为其顶部。

该方法可还包括从用于扫描电化学显微术(SECM)的第三电极收集数据。

该方法可还包括相对于该第一电极将直流(DC)偏移电压施加到该第三电极。

第一压电致动器可用于微量移液管的相对精细的z轴移动控制。第二压电致动器可用于样本平台的相对粗略的z轴移动控制。

该校准数据可包括记录离子电流的每一XY位置的复合接近曲线。所述复合接近曲线可以是从在训练序列期间测量的多个校准接近曲线确定。

所述复合接近曲线可以是根据所述相应XY位置与所述多个校准曲线的XY位置相距的线性距离而加权的所述多个校准曲线的线性组合。

所述多个校准曲线可以是在控制微量移液管相对于样本平台移动的同时记录离子电流的该步骤之前和/或在该步骤期间和/或在该步骤之后收集。

附图说明

现将通过举例方式且参照附图来描述本发明的方面。在附图中：

图1图示实例SICM系统；

图2图示光栅扫描跳跃模式；

图3是扩展(spreading)、加扰(scrambling)与调制系统的示意性图示；

图4是实例解调制器的示意性图示；

图5图示追踪模式；

图6A和图6B示出实例接近曲线；

图7图示实例组合式SECM与SICM系统；

图8图示光栅扫描AC模式；

图9、图10A和图10B示出AC模式响应。

具体实施方式

下文描述被呈现以使本领域的技术人员能够制作和使用系统，并且是在特定应用的上下文中提供。对所公开的实施例的各种修改对于本领域的技术人员是容易清楚的。

本文所定义的一般原理可应用到其它实施例和应用而不偏离本发明的精神和范围。因此，本发明不希望限于所示出的实施例，而是符合与本文所公开的原理和特征一致的最广范围。

术语“检查(interrogate)”希望表示监视结构的表面处的改变，例如，检测单个位置处或随着探针扫描表面在表面上或表面处的结构改变，或测量结构的高度的能力。在某些情形下，表面可以是柔韧的，并且允许对表面下方的结构(例如，细胞表面下方的细胞骨架)进行成像。这包括在该术语中。不希望该术语限于检测结构改变，并且例如电生理或化学改变的监视也被包括在其中。

如本文所使用的术语“像素”表示特定位置处的所测量且处理的数据点。扫描中的像素的数量可由系统的用户选择。

图1所示的实例SICM系统100包括扫描头101、控制器102和PC 103。扫描头优选包含电子器件和电动机以放大弱离子电流，并且移动移液管108与样本容器(例如，陪替式培养皿)111两者。扫描头可包括压电致动器与电动机104。压电致动器可按处于1nm的区中的移动分辨率或更好的移动分辨率和通常100μm的行进范围在XYZ轴上操作。电动机(例如，直流(DC)电动机)可只用作粗略定位装置，并且将按约1μm的准确性并且在约20mm的行进范围上定位移液管108与样本固持器111两者。

扫描头101包括输入/输出(IO)电子器件105，例如，用于对信号进行放大和滤波的放大器和滤波器。

移液管108可按将允许移液管末端的XYZ位置受压电平台与粗略电动机平台104两者控制的方式附接到扫描头。在优选实施例中，压电平台和粗略电动机平台还将包括测量样本固持器111与移液管108的位置的伺服系统。伺服测量位置和实际命令位置可用于回馈系统中以确保移液管与样本固持器两者的位置是准确已知的。移液管被填充以某电解质溶液109并且包括连接到IO平台105的电极106。

在样本固持器111内，存在将测量的样本113、第二电极110和电解质液体112。样本固持器可位于XYZ平台118上，其中XYZ平台118包括压电致动器与电动机以提供样本固持器和样本的精细移动与粗略移动两者。XYZ样本平台118的控制是通过经由扫描头101来自控制器102的信号119而进行。

压电平台和电动机平台可组合成位于样本上方或样本平台内的单个平台。

控制器可包括现场可编程门阵列(FPGA)和中央处理单元(CPU)114以及模数转换器(ADC)和数模转换器(DAC)115。还可包括数字信号处理器(DSP)。一些或全部处理可以在PC 103中进行。控制器的目的是计算哪些信号应发送到扫描头101以按某一指定方式来促进扫描头的操作。FPGA和CPU可分摊控制扫描头的任务。通常，FPGA将执行时间要求严格的任务，并且CPU将执行数字密集的任务。扫描头与控制器之间的连接116可以是许多导线。这些导线携载数字或模拟信号以控制并检测离子电流，移动压电平台与电动机平台。例如，压电致动器扫描可经由模拟信号来控制，并且粗略电动机可经由数字信号来控制。

离子电流可通过递送到IO部105和移液管中的电极106的控制器内所产生的电压而建立，从而经由电极110通过样本电解质112回到IO部105而建立离子电流。离子电流的产生和离子电流的检测可或者是处于扫描头101或PC 103中。

图2图示光栅扫描跳跃模式。在跳跃模式中，移液管208在远离样本213的位置始于某开始位置201。控制器经由扫描头而监视流经移液管和样本固持器中的电解质的离子电流。在扫描的开始时，移液管以受控制的下降速率接近202样本的表面。下降可例如是以小离散梯级进行，或可以是线性下降。随着移液管接近样本表面203，离子电流开始减小。一旦电流已降低预定义量，那么控制器暂停接近。记录移液管在XYZ轴上的位置，并且接着将移液管撤回204安全高度201。

在SICM系统的实际实施例中，额外保护措施可如下包括在设计中。在安全高度201下，不管作为扫描的开始还是作为正在进行的扫描中的下一点，XY平台都可移动到新XY位置。XY平台的移动将动量引入到移液管和附接到移液管的移动平台，或样本固持器和附接到样本固持器的移动平台。一旦达到XY位置，那么移动质量的动量将随着移动停止而诱发某振荡。此振荡在所扫描的样本中产生噪声。因此，可在扫描201的顶部包括小暂停或延迟以允许移液管或样本固持器的任何谐振或振动衰退。取决于移液管移动系统或样本固持器移动系统的质量，暂停的量值是约几ms。移液管移动系统包括(取决于需要什么移动，而在X和/或Y和/或X轴上)移动移液管所需的所有元件，并且样本固持器移动系统包括样本固持器和移动样本固持器211所需的移动平台。

相对于样本而下降或接近202可以是按受控制的速率进行。如果发出高接近速度的命令，那么存在损坏移液管末端或在移液管移动系统中产生过多动量的危险。然而，接近速度越低，完成扫描的时间越长。可基于移液管特性以及电解质溶液209和212的特性经由实验而进行接近速度的选择。一旦抵达表面203，便可引入额外暂停或延迟以允许移液管和样本固持器的机械组件中的振荡衰退，并且允许移动所诱发的离子电流的改变稳定化。

可进行数次接近表面，并且取离子电流的平均值，或取离子电流的最终值。目标是以预定义离子电流减小的准确估计但以最小的延迟抵达表面。

在已标识表面203的位置之后，移液管缩回204。缩回的速率可大于接近。移液管可在开始第二和后续接近之前缩回到安全高度201。

可按高安全高度201进行光栅扫描的第一线，但在后续扫描线中，可使用基于样本的特征高度的所获得的知识而选择的较低安全高度。以此方式，可由于将减小移液管必须行进的距离而减少总扫描时间。

概括地说，光栅扫描跳跃模式的典型操作引入延迟和暂停，这增加样本的总扫描时间。

扩展、加扰与调制系统的实例呈现在图3中。代替寻常的DC，扩频调制电流用于产生经过移液管和样本固持器中的电解质溶液的离子电流。

扩频调制方案包括扩展功能302、加扰功能303以及滤波与调制功能304。这些实体的组合将被称为调制系统306。调制系统提供用于产生在时域中多路复用的多个信号的方法。多路复用可或者处于频域中。在频域中，可利用多个独立频率信号，或在时域中，可利用时间多路复用信号。

调制系统306的输入301是具有对应代码编号的至少一个DC偏移。DC偏移定义将施加到在调制系统的输出305处出现的特定代码信道的DC电平，并且代码编号定义扩展码中的哪一个将应用于特定输入。

扩展码可以是从例如沃尔什码或正交可变扩展因子码等正交二进制码的族产生。所选择的特定代码和代码的长度由代码编号定义。控制器可负责选择哪些代码用于不同信道。

两个代码可用于纯SICM应用，并且三个或更多个代码用于组合式SICM与SECM应用。替代实例可将单个代码用于纯SICM应用，也用于组合式SICM和SECM应用。

针对纯SICM应用，可选择短代码与长代码。代码的长度可由控制器选择，其中例如短代码是128个符号，并且长代码是1024个符号或更长。不同条件和扫描速度可保证不同长度代码的选择。短代码可用于追踪样本表面上方的移液管的高度，并且长代码用于对表面的细节进行成像。

加扰码用于对来自扩展系统的数据符号加扰。加扰码可以是例如金氏码序列或m序列等伪随机序列。加扰码的目的是将扩展码的结构随机化，并且在频域中将所得信号正规化。

滤波与调制平台304接收经扩展和加扰的数据符号。滤波可在调制之后发生。要使用的调制方案存在许多选择，例如，二进制相移键控(BPSK)、正交相移键控(QPSK)、n正交振幅调制(n-QAM，其中“n”是指定调制的阶的偶数整数，例如，4、8、16、64)、频率调制(FM)、振幅调制(AM)等。来自扩展与加扰系统的输入是用于调制信号的相位的极性信号。扩展码和DC电平影响极性信号的振幅，并且因此影响来自调制器的相位分量的量值。

IQ调制器可用于在标准载波频率上产生信号。添加载波频率的益处在于，载波频率可用于远离预期存在大量噪声和干扰的频率(例如，DC到～100Hz)而移动经调制的信号。

滤波可以在调制之后进行。滤波器可以是移除信号的不良高阶分量的低通滤波器，或可以是用于分别移除低阶频率或两者的高通或带通滤波器。滤波器可使用具有例如，巴特沃斯或切比雪夫的滤波器特性的FIR或IIR数字滤波器而实施在FPGA中。

在调制系统的输出305处，产生施加到移液管电极的信号。信号诱发穿过电解质溶液的离子电流，其中该离子电流由控制器经由IO系统来监视。

实例解调制器406示出在图4中。解调制器406包括许多块：滤波功能402、获取与解加扰功能403以及相关器与解扩展功能404。替代实施例可将块的次序互换，组合所述块乃至移除一个或更多个所述块。解调制器406可实施在FPGA、CPU、DSP或PC中。

输入信号401从一个或更多个电极抵达解调制器。输入信号使用滤波子系统402来滤波以提供不良噪声和干扰的拒绝。滤波器可例如是可拒绝低频噪声和干扰(例如，在DC到100Hz下)以及高频噪声和干扰的带通滤波器。截止频率和拒绝的速率可被选择成优化系统行为，但是可取决于载波信号是否由调制系统使用而不同。滤波器可经由数字滤波器来实施或使用例如开关电容器滤波器、有源滤波器或许多不同类型的无源滤波器等其它技术来实施。

经滤波的信号被传递到获取与加扰功能403。获取系统以类似于其它扩频系统中所使用的搜索的方式进行获取并与所接收的信号同步。解加扰系统从所接收的信号移除加扰码。这些功能可例如实施在FPGA中。

来自解加扰功能403的输出被传递到相关器与解扩展块404。块的其它输入是类似于调制器子系统中的DC电平和代码的DC电平和代码编号407。对于仅SICM系统来说，可存在两个代码，而不存在DC电平。对于组合式SICM/SECM系统来说，可存在三个或更多个代码和不同DC电平。可在相关器/解扩展块之前移除任何DC电平。将适当代码应用到相关器/解扩展块，以使得可从复合的所接收的信号提取个别代码。在调制系统中使用正交码的结果是应完美地隔离从个别相关器/解扩展器提取的信号。可每代码使用单个相关器/解扩展器。或者，耙式接收器可用于捕获码域信号的多个延迟版本。相关器/解扩展器404可实施在FPGA中。

从解调制器提取的不同信号405可被传递到控制器中的CPU。基于这些信号，控制器可操作接近、缩回、信号提取和来自样本的成像。

在实例SICM系统中，结构类似于图1，具有处于控制器102中的FPGA 114的调制系统和解调制系统。

在此实例中，存在单个电极110，但替代实例可包括额外电极以分离追踪码和成像码。

以类似于光栅扫描跳跃模式的方式，移液管接近样本113的表面。调制器子系统应用两个代码：例如长度为128个符号的追踪码以及长度为1024个符号的成像码。所述代码可以是选自例如正交可变扩展因子(OVSF)码等可变长度正交码的族。

取决于配置，解调制器附接到单个电极110或两个电极110。在单个电极的状况下，解调制器从同一信号提取两个代码。对于双电极配置来说，可使用两个解调制器，每个电极一个，但两个解调制器之间进行了同步。

相关器/解调制器与代码的长度成正比而减小经扩展的信号的带宽。此解扩展减小信号的有效带宽，并且因此改进信噪比。对于128符号的追踪码来说，信噪比(SNR)存在以因子128进行的改进，或以对数表达的21dB的改进，而较长扫描码将以1024或30dB改进SNR。可基于根据实验实际上存在的SNR来设想较长代码与较短代码两者的替代实例。

较短追踪码当在相关器中解扩展时将产生比较长代码快的对离子电流的响应，尽管是在因从较短代码获得的较低处理增益所致的增大的噪声限度为代价的前提下。

用于检测离子电流的改变的机构可基于在参考接近曲线时的离子电流的直接改变或基于在参考接近曲线时的差分电流的改变。

控制器利用从解调制器中的相关器获得的解扩展信号，以调整移液管108或样本平台118的Z高度。由于移液管的较低质量，移液管可移动以进行小调整，而样本平台可移动以进行较大调整。

来自追踪码的所检测的离子电流的实例输出在图5中图示在501处，与样本513的表面一起示出以进行比较。可随着进行光栅扫描的线而针对XY的改变来进行移液管508在Z上的连续改变。或者，可基于来自解扩展追踪码的许多样本来进行Z上的梯级改变。

与光栅扫描跳跃模式相比，以此方式使用追踪码来控制z轴移动的益处在于，避免方向的不连续的改变，并且因此不再需要被引入以改善效果的延迟/暂停。通过平滑地追踪样本的表面上方的安全高度，避免不连续跳跃，并且因此避免移液管移动平台和/或样本预定平台的振动和振荡。这显著减少系统中的噪声，并且还加速系统的扫描时间。

通过用于管理移液管在样本上方的位置的追踪码，成像码可用于导出移液管下方的图像。成像码较长，花费较多样本来相关，但改进SNR并且因此改进对样本在移液管下方的高度的估计。

成像程序的最后阶段是成像信号的去卷积，以获得对样本的基础形态的准确响应。成像过程可以是离散时间系统，其中每符号采集样本至少一次。移液管在XY平面中移动的速率意味在给定XY位置处(例如，在+/-10nm窗口内)，存在成像码的有限数量的样本。随着移液管横向移动(并且在更小程度上，垂直移动)，所得所检测的图像是实际图像形状与移液管下方的电流收集包络的形状的卷积。通常，电流收集包络的横截面的形状是梯形，其中梯形的较小平行边是移液管的末端孔的直径，并且较宽平行边接近样本表面。电流收集包络的完整三维(3D)形状是围绕移液管的Z轴旋转180的梯形形状，即，截头锥体。(3D电流收集包络的准确结构可以是从实验测量和校准定义。)

在针对3D电流收集包络的形状进行假设的情况下，去卷积算法可用于估计样本的基础图像。不管是在存在3D电流收集包络的先前知识的情况下还是在不存在该先前知识的情况下(盲2D去卷积)，存在图像的2D去卷积的许多方法。例如，可使用涉及维纳滤波器或线性预测编码的各种算法。2D去卷积可实施在控制器的FPGA 114内。

实例接近曲线被图示出在图6A中。X轴定义移液管相对于某一任意参考点的位置，以微米为单位。Y轴示出穿过移液管的离子电流，以nA为单位。随着移液管接近样本，离子电流开始降低。样本的表面可见于图6A中，处于与起始点，即，电流以指数方式降低到零之处相距480nm的区中的某处。

图6B图示具有128的平均因子的相同接近曲线，如在追踪码相关器的输出处可见。在图6B中，电流在接近的开始处被归一化为0，并且最后128个样本由于在结束时存在足够数据来执行平均化而被省略。从图6B清楚的是，图6A中可见的接近曲线中的噪声已减少。

与图6B的接近曲线类似的接近曲线可用作从解调制器获得的表面检测的参考。在扫描开始之前，可在围绕样本的区中收集许多接近曲线，并且针对具体点而制作复合接近曲线。

可基于相对于曲线的线性距离而从来自其它点的接近曲线的线性组合创建此复合接近曲线。针对围绕样本的任意数量的点而创建复合接近曲线的表达式是：

$\frac{\frac{K1}{|M1-P1|}+\frac{K2}{|M2-P2|}+\mathrm{...}\frac{Kn}{|Mn-Pn|}}{\frac{1}{|M1-P1|}+\frac{1}{|M1-P2|}+\mathrm{...}\frac{1}{|M1-Pn|}}---\left(1\right)$

其中M1(在XY坐标中)是必须计算接近曲线的位置，P1、P2、Pn是接近曲线已知的点，并且K1、K2、Kn是接近曲线值。度量|M1-P1|是XY平面中点M1与P1之间的欧几里得距离的绝对值。

表达式(1)基于测量点(M1)与具体校准接近曲线(P1、P2等)相距有多远而制作接近曲线的线性组合。必须注意针对测量点与校准点相同(即，M1＝P1)的状况而管理方程式中的渐近线。此状况应独立处置以在数字计算机上避免除以零的问题。在此状况下，接近曲线应刚好为K1。在所有点相对于测量点等距离的状况下(即，|M1-P1|＝|M1-P2|...＝|M1-Pn|，复合接近曲线应是所有Kn校准曲线的平均值。

替代复合接近曲线可例如取测量点与校准点之间的距离的平方来构造。实际上，可使用从校准曲线提取复合接近曲线以使得获得曲线的平滑改变的任何合理度量。

除在扫描之前制作的接近曲线之外，还在扫描期间制作额外接近曲线是有益的。这些额外接近曲线点是基于当前扫描区域内的位置。所制作的额外接近曲线的数量受控制器控制。每一额外接近曲线将增加总扫描时间，因此，必须在总扫描时间与成像分辨率之间做出权衡。

一旦完成扫描，系统便可估计与扫描期间所进行的点相同的点处的接近曲线特性。这些最终点可用于考量可在扫描期间在移液管中发生的磨损。扫描后接近曲线的使用让成像码获得表面拓扑的最准确估计。独立使用扫描前复合接近曲线来计算图像还是随后通过包括扫描后接近曲线而校正图像是实施决策。

存在用于组合扫描前、扫描期间和扫描后接近曲线的许多接近，最简单的方法是使用时间延迟加权，例如，基于|t1-t2|的因子可用于基于测量的时间(t1)与相同点处的接近曲线中的每一者的时间(t2)来对具体接近曲线加权，以使得在时间上最近的校准接近曲线将具有比在时间上较远离的校准接近曲线大的权重。方程式的准确形式可改变，但可例如极类似于上文的(1)，不同之处在将时间差而不是距离用作度量。

参照类似于图1的图7而定义组合式SECM与SICM扫描的系统架构，不同之处在于具有额外电极，例如，712。在此实例中，存在用于SICM系统的两个电极707和703以及用于SECM系统的一个或更多个电极，例如，712和703。对于每一电极来说，存在解调制器系统。

在替代实例中，可存在以允许多个移液管702一起接近表面的方式连接的多个移液管702。可对SICM形貌与成像分配一个移液管，并且对SECM测量分配一个或更多个移液管。除SECM电极内的电解质705之外，还可将额外涂层涂覆到SECM移液管的内部或外部以促进正被测量的具体电化学效果。在所示出的实例中，每移液管有一个电极712，但替代实施例可每移液管利用多个电极。所利用的电极中的每一者可附接到独立解调制器子系统。

如上所述，两个代码可被分配给SICM系统。对于SECM系统来说，可分配一个或更多个代码；分配可以是灵活性的。在一些实验中，可每移液管需要多个SECM代码与单个或多个电极712。

所分配的所有代码可选自例如前述OVSF码等可变长度正交码的相同族。可基于测量的要求而选择SECM码的长度。较长码提供电流的较准确的估计，但增加扫描时间，而较短码实现较快扫描，但降低对引入到系统中的噪声和干扰的免疫能力。可基于正进行的实验来选择代码的长度，但控制器管理代码的分配以确保正交性被保留。

除代码编号(长度和身份)之外，可将DC偏移应用到SECM系统以诱发额外电化学效果。可每移液管702应用DC偏移。每一解调制器具有关于应用到每一移液管的DC偏移的知识，并且能够在解调制过程中补偿DC偏移(例如，通过基于在获取系统中进行的测量而减去DC分量的量值)。在替代实例中，可允许保持DC偏移，但记录其量值和改变，以用于后续处理贬值。

一般来说，DC偏移将充当对系统的干扰。然而，只要代码的长度充足，那么利用扩展与加扰码具有使DC偏移的影响衰减的效果。控制器可负责估计DC偏移可对系统产生的影响，并且限制其量值或经由PC向用户通知干扰可对SECM测量和/或SICM成像导致损坏。

概括地说，描述例如正交扩展码可与加扰码组合的系统。这些代码允许以限制电压与电流之间的相互作用的方式经由SICM或SICM/SECM系统建立多个电压和电流。

在SICM系统中，可使用多个代码；一个用于范围追踪环路(以调整移液管保持在样本上方相对恒定的高度处)，并且较长代码可准确地测量穿过移液管的电流，并且经由接近曲线校准(例如，存储在查找表中)而估计与样本相距的距离并且因此估计样本的拓扑。

多个移液管和多个电极可用于系统中。将代码分配给移液管和电极是灵活性的，并且取决于将调查的具体效果。以此方式，SICM和SECM测量可与两者之间的有限的干扰共存。

扩展与加扰码固有地对抗噪声与干扰两者。特别严重的形式的干扰是来自AC干线信号，通常50到60Hz。系统将允许对受损害的频率(例如，DC到100Hz)进行直接滤波来移除干扰或使用代码内所存在的干扰拒绝，经由解扩展与解加扰的隐含作用而使干扰衰减。

此外，如果信号的调制处于载波频率，那么可明确定义载波中心频率和带宽以避免低端频率(例如，DC到100Hz)。

追踪码的使用在测量与样本相距的距离并因此调整距离的同时，允许移液管平滑地遵循样本的外形。此表面追踪减少对在X、Y、Z轴中的任一者上进行不连续跳跃的需要。不连续性的减小以及因此对移液管与样本固持器两者的动量的大的改变减少允许系统在测量之间稳定化所需的时间。此举的净结果是可提高扫描速度，从而导致扫描速度超过二十倍地改进。

在大于单个测量像素的距离上成像的成像码所导致的可能的模糊可通过在1D(每线)或2D模式中使用去卷积技术来补偿。

传统光栅扫描跳跃模式系统在24分钟内进行128×128个像素(测量点)的测量。如果我们将此作为基准线，那么可计算针对此处所定义的实例代码长度，针对所定义的样本速率，当量扫描时间将是多少，或者，针对不同长度的代码，扫描时间将是多少。

假设128符号的追踪码以及1024符号的成像码。正常扫描时间通常是16,384个像素1,440秒(平均每像素是约88ms，忽略在第一线上花费较多时间的可能性)。假设100ksamps/s，那么在像素之间存在约8,789个样本。假设我们想要在像素之间具有至少4个追踪码长度(即，像素之间是512样本)，那么可增加扫描速度以使得总扫描时间以因子17从24分钟减少到84秒。

或者，如果我们将样本频率增大到400ksamps/s并且在像素之间维持相同数量的追踪码长度，那么扫描时间以因子69减少，并且总扫描时间从24分钟减少到21秒。

在这两种状况下，通过长度为1024个符号的所假设的成像码，成像码将与两个像素重叠，并且因此要求使用去卷积来恢复原始图像。成像码可减少到4倍于追踪码以防止像素重叠(这对应于512个符号)，但这将是以降低的噪声性能为代价。

本文中提供一种用于使用SICM来检查表面的实例方法，包括以下步骤：

(a)控制器产生例如基于正交扩展码和/或伪随机加扰码的使用而使用扩频调制方案来调制的离子电流；

(b)控制器移动得靠近样本的表面，并且记录离子电流；

(c)控制器使用许多相关器中的一个而对所记录的离子电流进行滤波、解扩展和解加扰，以在样本的区中产生离子电流的窄带表示；

(d)控制器接着基于在训练时间段期间导出的样本的接近曲线的所存储的版本直接从离子电流或从离子电流的差(当前离子电流样本减去先前位置处的先前离子电流样本)推断微量移液管与表面相距的距离；

(e)短相关器用于产生相对于表面的位置以提供表面追踪信号；

(f)表面追踪信号可用于将微量移液管相对于表面的高度连续调整到足够高而避免预期之外的特征，但足够低以产生足够电流改变以允许收集准确高度信息；

(g)第二较长相关器可用于对所记录的离子电流进行解扩展和解加扰(较长相关器因可从较大相关器获得的较大处理增益而进一步减少离子电流信号中的任何噪声)；

(h)接近曲线再次用于将所测量的离子电流转换为对相对于样本的表面的高度的估计。

去卷积算法可在控制器中用于在离子电流被收集的同时移除由微量移液管的移动所导致的图像模糊中的一些。

多个正交扩展码可在系统中被指派以允许根据以下步骤同时收集多个离子电流流动：

(a)对SICM拓扑成像系统指派适用于表面追踪的长度的正交扩展码；

(b)对SICM拓扑成像系统指派适用于表面的3D成像的长度的正交扩展码；

(c)对SECM测量系统指派适用于SECM系统的离子电流的检测的长度的正交扩展码；

(d)控制器产生并收集不同的扩频调制电流信号(信号的信号路径不需要是相同的，但为了易于部署，全部可使用相同移液管)；

(e)可使用浸渍在样本容器中的电解质中的额外电极(例如，SICM电极和SECM电极可以是不同的，但后续离子电流经由两个不同输入连接器而传递到控制器；

(f)可经由浸渍在样本容器中的电解质内的不同电极来收集两个不同SICM正交码；

(g)适当长度的额外正交扩展码可用于SICM、SECM或需要离子电流的独立测量的其它应用的额外离子电流流动的收集。

针对SICM系统在AC模式中操作，也已开发出其它改进。

本文中描述一种用于使用SICM来检查表面的方法，包括以下步骤：

(a)控制器产生改变移液管在表面上方的位置的AC Z移液管调制电流，调制信号的频率超出移液管和压电挠曲平台的自然谐振频率；

(b)控制器将z轴移液管移动得靠近样本的表面，并且记录所检测的离子电流；

(c)控制器实施锁定放大器并对所检测的电流进行滤波和放大；

(d)控制器使用所检测的离子电流以调制Z样本平台的位置来确保移液管相对于样本的位置保持大致上恒定。

图8图示光栅扫描AC模式。在实例AC模式中，移液管808在远离样本813的位置始于某开始位置801。移液管的Z轴位置802的AC调制由控制器应用到Z轴移液管致动器。随着移液管接近样本的表面，移液管的AC调制诱发离子电流的AC调制。

离子电流经由扫描头而传递到控制器，此处离子电流经由ADC而被数字化。数字信号可接着被传递到可实施锁定放大器的FPGA/CPU，其中AC信号的频率用于对所需AC分量进行滤波和放大，并且拒绝在感兴趣带宽之外的任何噪声。

AC调制离子电流被传递到检测AC离子电流的量值和相位的复数包络检测器。离子电流的复数包络的量值用于辨识样本的表面的存在，可选地使用接近曲线数据来提高准确性。

随着移液管接近表面，与样本相距的平均距离可通过将DC电平与驱动Z轴移液管压电致动器的AC调制电压相加来调整以将移液管保持在与样本相距的恒定距离处。系统的扫描时间性能通常受Z轴移液管的调制频率限制。在现有技术中，这些调制频率通常低于Z轴移液管致动器的谐振频率并且处于1到2kHz的区中。

除将AC模式调制用于检测表面之外，可在光栅扫描模式中对表面进行扫描，其中光栅扫描模式本质上迫使移液管横穿表面的X轴方向，从而在递增Y轴位置并重复X轴扫描之前在适当像素位置处进行测量。下一Y位置可紧接在先前Y位置上方(即，X位置保持相同)，或在替代实例中，每一线可每次始于相同开始X坐标(例如，X＝0)。可针对扫描的第一线执行缓慢扫描，以估计主要形貌特征，并且基于该起始开始点，可在更新样本的形貌轮廓的记录的同时执行较快扫描。

将Z轴移液管和致动器的模型视为二阶谐振系统，并将AC模式调制应用到移液管和致动器且记录移液管的振幅改变，可观测到与图9所示的波形类似的波形。系统的瞬态启动之后紧接着到稳态性能中的移动。移液管的振幅是以伏特为单位示出(如伺服系统所测量)。图中的时间轴已被归一化以使得谐振频率是1Hz。在实际系统中，实际谐振频率将较接近3kHz。

在本文中，认识到，AC调制的频率可高于Z轴移液管和压电致动器的谐振频率。

图10A示出系统对20倍于谐振频率的所施加的AC调制频率(在该实例中是20Hz，但实际上较接近60kHz)的响应。图中的起始瞬态是在与系统的谐振频率相关的速率下发生，但随着时间，这些瞬态衰退到稳态值。

参照示出稍后时间的图10B，Z轴移液管的振幅接近稳态条件，并且(复数包络的)峰值调制振幅变得恒定。应注意，在此实例中，Z轴移液管的调制的最大振幅由于二阶系统所引入的衰减而以约一千的因子减小。此振幅减小不是问题，因为我们仅需要Z轴移动的小偏差。

高频AC调制的振幅可缓慢增大以防止图10A中可见的瞬态对移液管导致不当的损坏。斜坡的形状未必是线性的，而是斜坡的形状可以是逐步的，例如，Z轴移液管压电致动器中的谐振的复数包络的倒数。参照图10A，斜坡将在时间＝0始于低值，并且在处于8秒的区中的时间上升到其最大稳态值。应注意，图10已被归一化，并且实际时间和振幅值将取决于Z轴移液管压电致动器谐振频率和AC调制信号的频率的准确值。(在约3kHz的谐振下，斜坡持续时间可以是例如约3ms。)

所测量的AC调制离子电流被传递到FPGA/CPU，其中锁定放大器可提供噪声和干扰拒绝，并且复数包络检测过程得以实施，通过此方式，可提取离子电流的振幅和相位。

所测量的离子电流复数包络的量值在与接近曲线校准技术组合时，提供对移液管相对于样本表面的位置的准确估计。

为了将移液管保持在样本表面上方指定位置处，必须调整样本与移液管之间的距离。然而，Z轴移液管的高度的额外改变可能在过驱动二阶系统中导致不稳定性。因此，对改变调制信号的平均值的替代可以是优选的。

为了将改变提供给移液管-样本距离，离子电流的复数包络的量值可用于将驱动信号调制给Z样本平台压电致动器。因此，例如，随着离子电流降低到某设定点以下，认为移液管过于接近样本，并且施加到Z样本平台压电致动器的电压被调整(例如，基于接近曲线校准技术)以相对于样本维持恒定且已知的距离。同样，随着离子电流增大，电压被调整以减小移液管与样本之间的距离。所检测的离子电流与所应用的电压校正之间的关系可通过经由校准步骤而确定或针对每一特定电解质溶液而固定的某比例常数而是线性的。

可测量Z轴致动器和移液管系统的振荡模式并且因此将其特性化，并且基于此模态分析，可定义诱发正确AC模式电流以及AC信号的平均值的适当改变的驱动信号。维持稳定性的适当驱动信号可在其特征向量/特征值方面通过整个系统的分析来导出。分析与合成阶段可以是在控制器的FPGA/CPU中执行。

在此上下文中，图5中的501可被视为Z样本平台压电致动器可随着移液管跨越表面移动而采取的典型轨迹。Z样本平台的信号可观测的特征在于，驱动信号的改变速率远低于Z移液管压电致动器的改变速率，并且因此Z样本平台压电致动器的驱动信号的带宽低于Z轴样本平台致动器的谐振频率。

假设基于许多测量点(像素)来执行光栅扫描。作为实例，考虑32×32像素的区域的扫描。假设在锁定放大器(例如，实施在FPGA/CPU)滤除噪声和干扰并且递送离子电流的稳定样本的情况下，以AC模式调制频率(例如，在60kHz的区中)的速率采集离子电流样本，那么执行完全扫描所花费的时间处于17ms的区中。可取静态平均值(在阶梯式光栅扫描中，X或Y)或移动平均值(在连续移动光栅扫描中，X或Y)。例如，可采集离子电流的量值的六个样本并取平均值，在此状况下，总扫描时间减少到约100ms。应注意，需要一些额外时间以在每一线的结束升高移液管，并且移动到下一线的开始，但此额外时间因素较小，并且将不显著影响总性能。

作为比较，此扫描时间约20倍快于AC模式调制的频率接近Z轴移液管压电致动器的谐振频率的系统。

可使用具有处于100μm的区中的行进范围的Z轴移液管压电致动器。如果使用20倍于致动器的谐振频率的频率，那么因AC调制信号的过驱动所致的移位的衰减导致振幅的约一千倍的减小。这导致处于100nm的区中的Z轴AC调制振幅，如此适用于产生AC调制离子电流。

概括地说，描述Z轴移液管压电致动器和Z轴样本压电致动器用于允许移液管追踪并测量样本的表面的形貌的系统。Z轴移液管压电致动器使用控制器所产生的AC调制电压而在高于致动器的谐振频率的频率(例如，超过20倍于谐振频率)下，诱发移液管的稳定调制。当移液管接近样本时，诱发离子电流调制，其中调制电流的频率等于移液管AC调制的频率。针对高频AC调制而调谐的锁定放大器用于滤除不良噪声和干扰。AC调制离子电流被传递到控制器中提取离子电流的复数包络的量值的复数包络检测器。Z轴样本压电致动器位置用于将离子电流的包络的量值用作驱动电压来追踪样本的表面。光栅扫描的速度由于Z轴移液管压电致动器的速度的提高而提高。接近曲线校准用于提高形貌估计的准确性。扫描时间以超过20的因子改进是可行的，其中在100ms的区中扫描32×32像素的图像。

考虑到本文所公开的说明书和实践，其它实施例对于本领域的技术人员来说是清楚的。希望说明书和实例仅被视为示范性的。

此外，本申请已按具体次序列出方法或程序的步骤，但可以乃至在某些情形下适宜改变执行一些步骤的持续，并且希望本文所阐述的方法或程序权利要求的特定步骤不被解释为次序特定的，除非在该权利要求中明确陈述此次序特定性。也就是说，可按任何次序执行操作/步骤，除非另有指定，并且实施例可包括额外操作/步骤，或比本文所公开的操作/步骤少的操作/步骤。还预期，在另一操作之前、与另一操作同时或在另一操作之后执行特定操作/步骤符合所描述的实施例。

Claims (50)

1.一种用于使用扫描离子电导显微术(SICM)而检查浸在电解质溶液中的样本的表面的方法，包括：

使用扩频调制信号而控制浸在所述电解质溶液中的第一电极与第二电极之间的电位以在所述电解质溶液中诱发离子电流，所述第一电极的浸没部分包含在微量移液管中，并且所述第二电极处于所述微量移液管外部；

在控制所述微量移液管相对于支撑所述样本的平台移动的同时记录所述离子电流；

解调制所记录的离子电流；以及

从所解调制的离子电流和校准数据确定所述样本的表面高度轮廓。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述扩频调制包括在时域或频域中对多个信号多路复用。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所述扩频调制是通过以下各者中的一者进行：二进制相移键控(BPSK)、正交相移键控(QPSK)、n正交振幅调制(n-QAM)、频率调制(FM)或振幅调制(AM)。

4.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中所述扩频调制是在预定载波频率上执行，所述载波频率可选地大于100Hz。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述扩频调制是使用正交扩展码、可选地使用沃尔什码或正交可变扩展因子(OVSF)码来执行。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述扩频调制是使用2个或3个不同扩展码来执行。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述扩频调制是使用伪随机加扰码、可选地使用金氏码序列或m序列来执行。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括可选地使用带通滤波器来对所记录的离子电流进行滤波。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括回馈表面高度轮廓数据以便控制所述微量移液管移动来追踪所述样本表面。

10.根据权利要求9所述的方法，其中表面追踪信号是使用短相关器来提供的。

11.根据权利要求9或10中任一项所述的方法，其中所述扩频调制至少使用用于表面追踪的第一扩展码以及用于成像的第二扩展码来执行，所述第二码比所述第一码长。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述解调制是使用长相关器来执行。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括执行去卷积算法以减少微量移液管移动所导致的图像模糊。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述确定包括以截头锥体来对所解调制的离子电流去卷积，所述截头锥体将所述样本表面作为其底部，并将微量移液管孔作为其顶部。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括从用于扫描电化学显微术(SECM)的第三电极收集数据。

16.根据权利要求15所述的方法，还包括相对于所述第一电极将直流(DC)偏移电压施加到所述第三电极。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中第一压电致动器用于所述微量移液管的相对精细的z轴移动控制，并且第二压电致动器用于所述样本平台的相对粗略的z轴移动控制。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微量移液管移动是根据跳跃模式式样。

19.根据前述权利要求1到18中任一项所述的方法，其中所述微量移液管移动是根据交流(AC)模式式样。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述AC模式式样具有比所述微量移液管、所述第一电极以及被配置成控制所述微量移液管的z轴移动的第一压电致动器的组装件的谐振频率大的调制频率。

21.一种用于使用AC模式扫描离子电导显微术(SICM)而检查浸在电解质溶液中的样本的表面的方法，包括：

控制第一压电致动器以相对于支撑所述样本的平台而改变包含浸没在所述电解质溶液中的第一电极的一部分的微量移液管的高度，

使用比所述致动器、所述微量移液管和所述第一电极的组装件的谐振频率大的调制频率的交流电(AC)，以便在所述第一电极与处于所述微量移液管外部并浸在所述电解质溶液中的第二电极之间在所述电解质溶液中诱发离子电流；

在控制所述微量移液管相对于所述样本平台移动的同时记录所述离子电流，所述移动具有垂直于AC高度改变的分量；以及

从所记录的离子电流和校准数据确定所述样本的表面高度轮廓。

22.根据权利要求20或21中任一项所述的方法，其中所述AC调制频率至少20倍于所述谐振频率。

23.根据权利要求20到22中任一项所述的方法，其中所述AC调制频率是约60kHz。

24.根据权利要求20到23中任一项所述的方法，其中在所述记录之前，所述AC模式移动通过低于所述AC调制频率的初始AC频率来启用，所述初始AC频率根据斜坡函数历经预定时间段而逐渐升高到所述AC调制频率。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述斜坡函数是所述组装件的谐振的复数包络的倒数。

26.根据权利要求24或25中任一项所述的方法，其中所述预定时间段是约3ms。

27.根据权利要求20到26中任一项所述的方法，还包括根据通过所记录的离子电流的复数包络的量值所调制的信号而驱动第二压电致动器以控制所述样本平台的z轴移动。

28.根据权利要求20到27中任一项所述的方法，其中电压校正应用到被配置成控制所述样本平台的z轴移动的第二压电致动器，所述电压校正随着所检测的离子电流线性地缩放。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述缩放的比例的常数是经由校准过程和/或从与所述电解质溶液相关联的预定常数确定。

30.根据权利要求20到29中任一项所述的方法，其中被配置成控制所述样本平台的z轴移动的第二压电致动器的驱动信号的带宽小于所述第二压电致动器与所述微量移液管、样本平台、样本容器、电解质与样本的组装件的谐振频率。

31.根据权利要求21到30中任一项所述的方法，还包括使用扩频调制信号而控制所述第一电极与所述第二电极之间的电位；

其中所述确定包括解调制所记录的离子电流。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述扩频调制包括在时域或频域中对多个信号多路复用。

33.根据权利要求31或32中任一项所述的方法，其中所述扩频调制是通过以下各者中的一者进行：二进制相移键控(BPSK)、正交相移键控(QPSK)、n正交振幅调制(n-QAM)、频率调制(FM)或振幅调制(AM)。

34.根据权利要求31到33中任一项所述的方法，其中所述扩频调制是在预定载波频率上执行，所述载波频率可选地大于100Hz。

35.根据权利要求31到34中任一项所述的方法，其中所述扩频调制是使用正交扩展码、可选地使用沃尔什码或正交可变扩展因子(OVSF)码来执行。

36.根据权利要求31到35中任一项所述的方法，其中所述扩频调制是使用2个或3个不同扩展码来执行。

37.根据权利要求31到36中任一项所述的方法，其中所述扩频调制是使用伪随机加扰码、可选地使用金氏码序列或m序列来执行。

38.根据权利要求31到37中任一项所述的方法，还包括可选地使用带通滤波器来对所记录的离子电流进行滤波。

39.根据权利要求31到38中任一项所述的方法，还包括回馈表面高度轮廓数据以便控制所述微量移液管移动来追踪所述样本表面。

40.根据权利要求39所述的方法，其中表面追踪信号是使用短相关器来提供的。

41.根据权利要求39或40中任一项所述的方法，其中所述扩频调制至少使用用于表面追踪的第一扩展码以及用于成像的第二扩展码来执行，所述第二码比所述第一码长。

42.根据权利要求31到41中任一项所述的方法，其中所述解调制是使用长相关器来执行。

43.根据权利要求31到42中任一项所述的方法，还包括执行去卷积算法以减少微量移液管移动所导致的图像模糊。

44.根据权利要求31到43中任一项所述的方法，其中所述确定包括以截头锥体来对所述所解调制的离子电流去卷积，所述截头锥体将所述样本表面作为其底部，并将微量移液管孔作为其顶部。

45.根据权利要求31到44中任一项所述的方法，还包括从用于扫描电化学显微术(SECM)的第三电极收集数据。

46.根据权利要求45所述的方法，还包括相对于所述第一电极将直流(DC)偏移电压施加到所述第三电极。

47.根据权利要求31到46中任一项所述的方法，其中所述第一压电致动器用于所述微量移液管的相对精细的z轴移动控制，并且第二压电致动器用于所述样本平台的相对粗略的z轴移动控制。

48.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述校准数据包括记录所述离子电流的每一XY位置的复合接近曲线，所述复合接近曲线是从在训练序列期间测量的多个校准接近曲线确定。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述复合接近曲线是根据所述相应XY位置与所述多个校准曲线的XY位置相距的线性距离而加权的所述多个校准曲线的线性组合。

50.根据权利要求48或49中任一项所述的方法，其中所述多个校准曲线是在控制所述微量移液管相对于所述样本平台移动的同时记录所述离子电流的所述步骤之前和/或在所述步骤期间和/或在所述步骤之后收集。