CN106244492B - 一种以硫酸软骨素生产工业废水为原料发酵生产枯草芽孢杆菌的方法 - Google Patents

一种以硫酸软骨素生产工业废水为原料发酵生产枯草芽孢杆菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种以硫酸软骨素生产工业废水为原料发酵生产枯草芽孢杆菌的方法：以利用动物软骨提取硫酸软骨素工艺所产生的工业废水为基质，混合糖蜜作为培养基，高温灭菌后接入枯草芽孢杆菌进行液体发酵，发酵液经浓缩制得枯草芽孢杆菌浓缩液。本发明解决了硫酸软骨素产生的工业废水污染问题，有效利用废弃物工业废水生产高附加值枯草芽孢杆菌浓缩液，达到变废为宝目的。整个工艺流程简单，且工艺控制条件温和、设备要求较低、投资少、便于工业化大规模生产应用，利用本发明方法所得枯草芽孢杆菌浓缩液有效活菌高。

Description

一种以硫酸软骨素生产工业废水为原料发酵生产枯草芽孢杆 菌的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种以硫酸软骨素生产工业废水为原料发酵生产枯草芽孢杆菌的方法。
背景技术
硫酸软骨素在软骨组织中是以蛋白多糖形式存在，蛋白多糖中硫酸软骨素多糖链与核心蛋白通过共价键连接(糖肽键)，因此从动物软骨组织中提取硫酸软骨素必须要采取合适有效方法破坏多糖链与蛋白的共价结合，使多糖链与蛋白有效分离，多糖类硫酸软骨素才能高效提取。目前国内生产厂家常采用蛋白酶解蛋白+等电点沉淀蛋白的方法来进行蛋白解离，在生产过程中会产生大量的含氮有机废水，蛋白、胨类、氨基酸含量可达0.5～2％。废水中大量有机物导致COD值严重超标，如直接进入污水处理环节，会严重增加后续活性污泥法处理难度，并极易腐败变质，变臭，造成严重环境污染。考虑该废水含大量多肽、氨基酸、微量元素，如何充分利用，变废为宝，是工业生产急需解决的问题。
枯草芽孢杆菌，中华人民共和国农业部公告第2045号《饲料添加剂品种目录(2013)》已批准其可作为有益微生物(益生素)添加到饲料中使用。大量文献已证实，枯草芽孢杆菌产生的淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用，降解鸡、猪饲料中一部分不能被完全消化吸收的纤维素、蛋白质，提高饲料利用率，增加养殖动物生长速度，还可避免这些不能被养殖动物利用的蛋白质排出体外，被微生物分解产生有毒有害的氨气；同时枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对动物致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用，可有效降低动物疾病发生率。随着人们健康安全意识的增强，枯草芽孢杆菌作为绿色、安全、高效的益生菌饲料添加剂，需求量逐年增加。
综上所述，一方面硫酸软骨素工业废水急需解决，另一方面枯草芽孢杆菌需求量逐年增加，如果将两者有机结合起来，研究易于操作、组成简单、便捷生产、成本低廉的利用硫酸软骨素工业废水生产枯草芽孢杆菌，有着重要的现实意义。不仅可以实现废物利用，保护环境；还可以节约工厂处理废弃物费用，及利用工业废水生产高附加值产品，使现有资源得到最大化的利用。然而目前，尚未有文献资料公开该方面技术相关内容。
发明内容
本发明的目的是提供一种以硫酸软骨素生产工业废水为原料发酵生产枯草芽孢杆菌的方法，利用动物软骨提取硫酸软骨素工艺所产生的工业废水为基质液体发酵生产枯草芽孢杆菌，有效利用废弃物工业废水生产高附加值枯草芽孢杆菌浓缩液，达到变废为宝目的。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：一种以硫酸软骨素生产工业废水为原料发酵生产枯草芽孢杆菌的方法，以利用动物软骨提取硫酸软骨素工艺所产生的工业废水为基质，混合糖蜜作为培养基，高温灭菌后接入枯草芽孢杆菌进行液体发酵，发酵液经浓缩制得枯草芽孢杆菌浓缩液。
所述糖蜜的添加量按照质量比为0.5～2％；
所述接入枯草芽孢杆菌接菌数量为终浓度5×105～5×106个/mL培养基；
所述液体发酵条件为温度37℃，发酵36～48h；
目前常用软骨素生产工艺为动物软骨经过清洗粉碎，酶水解并结合等电点沉淀分离除蛋白，滤清液采用乙醇沉淀提取获得。乙醇沉淀后废液经酒精塔回收乙醇，余下废液再加上车间冲洗、洗脱液外排为工业废水。废水中主要成分为残留乙醇、废动物油脂、碎肉、非动物油脂、和可溶性小分子膘、胨、肽、氨基酸类物及大量氯离子。该废水具有如下特点：(1)COD含量高：废水中COD主要组成是动物蛋白、脂肪以及乙醇。CODCr值可高达1.0×106mg/L,BOD5可高达6.0×105mg/L；(2)氨氮高：废水中含有大量蛋白质，排放到自然水体中，蛋白质中的有机氮经过缺氧反应矿化成无机氮，会严重影响水体，造成水体黑臭和富营养化。因此，目前对该种废水通常的处理方式为经过混凝、生化处理，处理后其CODCr和BOD5值达到排放标准后排放。然而该处理方法不仅费时费力，最终还是排出污水，不能根本解决软骨素生产工艺废水的污染及浪费等问题。
本发明人经过实践研究发现该废水中由于含有较多的多肽、氨基酸、微量元素等营养成分可以用于发酵生产枯草芽孢杆菌。本发明人用凯氏定氮法测定了该废骨泥中含氮量，并测定酸度和主要无机盐类，分别为：总氮1.8g/L、氨基氮0.4g/L、氯化钠2.7g/L、pH6.5～7.0，结果显示硫酸软骨素生产工业废水可为饲用枯草芽孢杆菌的培养提供氮源和无机盐等营养元素，在此基础上本发明研究发现仅需要添加少量糖蜜作为碳源即可满足枯草芽孢杆菌发酵生产需要，而无需对硫酸软骨素生产工业废水进行任何预处理，且适用于所有枯草芽孢杆菌菌株。
本发明首次将硫酸软骨素生产工业废水应用于发酵生产枯草芽孢杆菌，开辟了硫酸软骨素生产工业废水的新的用途。
此外，本发明还提供一种饲料添加剂，该饲料添加剂包含所述的枯草芽孢杆菌浓缩液。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明解决了硫酸软骨素产生的工业废水污染问题。初步统计每年全国硫酸软骨素产生含氮工业废水高达1000万吨，如此大量的废水排出，造成环境的极大污染。本发明开辟了该废水的全新用途，将其用于发酵生产饲用枯草芽孢杆菌，变废为宝，不再产生任何废物或废水，绿色环保。不仅为企业减轻负担，而且还可以增加企业经济收益。
(2)本发明工艺简单，易操作。本发明所用废水无需经过预处理，直接添加少量糖蜜即可满足枯草芽孢杆菌发酵生产需要。整个工艺流程简单，且工艺控制条件温和、设备要求较低、投资少、便于工业化大规模生产应用。
(3)本发明方法成本低廉，可大幅降低枯草芽孢杆菌价格。利用动物软骨提取硫酸软骨素过程中产生的大量工业废水，其中含有较多的多肽、氨基酸、微量元素等营养成分，以前都是作为废水排出，无经济价值。而添加的糖蜜是制糖工艺的副产品，经济价值也不高，便宜易得。且原料无需经过任何处理，整体生产成本更为低廉。因为目前，枯草芽孢杆菌活菌制剂生产过程中一般用的培养基原料有：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、淀粉、葡萄糖、尿素及其他无机盐，显然本发明方法发酵成本低廉的多。显然本发明方法可以大幅降低枯草芽孢杆菌价格。
(4)所得枯草芽孢杆菌浓缩液有效活菌高。发酵后蒸馏浓缩10～20倍即可。按照GB/T26428-2010《饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测》方法检测枯草芽孢杆菌数量达到6～50×1010个/g。可用于动物饲料及微生物菌肥，促进绿色生态农业的发展，产生良好的经济效益和社会效应。
附图说明
图1为不同糖蜜添加量对枯草芽孢杆菌菌数的影响。
图2为不同接菌量对枯草芽孢杆菌菌数的影响。
图3为不同培养时间对枯草芽孢杆菌菌数的影响。
具体实施方式
下面结合具体试验方法和附图对本发明的技术方案及其所产生的技术效果进行进一步的阐述，下述说明仅是为了解释本发明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明中所使用的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例所用的工业废水为同一批次用动物软骨提取硫酸软骨素工艺中得到。
实施例1：用动物软骨提取硫酸软骨素工艺所产生的工业废水10L，按照0.5％质量比加入糖蜜50g，混匀溶解后用NaOH或HCl微调节pH＝6.5～7.0，121℃条件下高温灭菌20min，冷却，按终浓度5×105个/mL培养基接入适量枯草芽孢杆菌，10L液体发酵罐具体参数如下：温度控制37℃，罐压0.05mpa，0-6h转速150rpm,通气量1:0.5；6-24h转速250rpm，通气量1:1.2；24h后转速150rpm，通气量1:0.5.发酵36h，按GB/T 26428-2010《饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测》法检测枯草芽孢杆菌数量＞6.0×1010个/mL。发酵液经双效浓缩器浓缩10～20倍后可制备枯草芽孢杆菌浓缩液，蒸馏所得热水可循环至硫酸软骨素提取工艺中使用，无工业废水产生。
实施例2：用动物软骨提取硫酸软骨素工艺所产生的工业废水10L，按照2.5％质量比加入糖蜜120g，混匀溶解后用NaOH或HCl微调节pH＝6.5～7.0，121℃条件下高温灭菌20min，冷却，按终浓度1×106个/mL培养基接入适量枯草芽孢杆菌，10L液体发酵罐具体参数如下：温度控制37℃，罐压0.05mpa，0-6h转速150rpm,通气量1:0.5；6-24h转速250rpm，通气量1:1.2；24h后转速150rpm，通气量1:0.5.发酵48h，按GB/T 26428-2010《饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测》法检测枯草芽孢杆菌数量＞5.0×1011个/mL。发酵液经双效浓缩器浓缩10～20倍后可制备枯草芽孢杆菌浓缩液，蒸馏所得热水可循环至硫酸软骨素提取工艺中使用，无工业废水产生。
实施例3：用动物软骨提取硫酸软骨素工艺所产生的工业废水10L，按照5.0％质量比加入糖蜜200g，混匀溶解后用NaOH或HCl微调节pH＝6.5～7.0，121℃条件下高温灭菌20min，冷却，按终浓度5×106个/mL培养基接入适量枯草芽孢杆菌，10L液体发酵罐具体参数如下：温度控制37℃，罐压0.05mpa，0-6h转速150rpm,通气量1:0.5；6-24h转速250rpm，通气量1:1.2；24h后转速150rpm，通气量1:0.5.发酵42h，按GB/T 26428-2010《饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测》法检测枯草芽孢杆菌数量＞3.0×1011个/mL。发酵液经双效浓缩器浓缩10～20倍后可制备枯草芽孢杆菌浓缩液，蒸馏所得热水可循环至硫酸软骨素提取工艺中使用，无工业废水产生。
实验例1.分别考察糖蜜添加量、培养时间、接菌量等因素对发酵产枯草芽孢杆菌的影响
(1)糖蜜作为枯草芽孢杆菌碳源，添加量对枯草芽孢杆菌生长至关重要，影响菌体产量与质量。依照本发明提供方法，采用单因素实验设计，将糖蜜添加量分别设置为0.1％、0.2％、0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％，进行枯草芽孢杆菌培养，实验结果如图1所示。
从图1可以看出，糖蜜添加量0.5％～2％时，枯草芽孢杆菌菌数相对较多。其中添加量1.0％时，枯草芽孢杆菌菌数达到最大。因此糖蜜添加量1.0％是本发明方法培养芽孢杆菌最佳糖蜜添加量。
(2)初始接菌量多少与发酵周期相关，依照本发明提供方法，采用单因素实验设计，将接菌量分别设置为1×105、3×105、5×105、1×106、3×106、5×106、1×107个/mL培养基，进行枯草芽孢杆菌培养，实验结果如图2所示。
从图2可以看出，接菌量0.5～5.0×106个/mL枯草芽孢杆菌菌数相对较多，其中接菌量1×106个/mL培养基，枯草芽孢杆菌菌数达到最高，为本发明方法培养芽孢杆菌最适宜接菌量。
(3)微生物培养中，发酵时间是一个重要指标，时间长达影响菌体生长，也与生产成本、生产能耗直接相关。依照本发明提供方法，采用单因素实验设计，将培养时间分别设置为12h、24h、36h、48h、60h、72h，进行枯草芽孢杆菌培养，实验结果如图3所示。
从图3可以看出，培养36～48h枯草芽孢杆菌菌数相对较多，其中培养时间36h，枯草芽孢杆菌菌数达到最高，因此本发明方法培养芽孢杆菌最适宜培养时间为36h。

Claims (5)

1.一种以硫酸软骨素生产工业废水为原料发酵生产枯草芽孢杆菌的方法，其特征是，以利用动物软骨提取硫酸软骨素工艺所产生的工业废水为基质，混合糖蜜作为培养基，高温灭菌后接入枯草芽孢杆菌进行液体发酵，发酵液经浓缩制得枯草芽孢杆菌浓缩液；
所述糖蜜的添加量按照质量比为0.5～5％；
所述接入枯草芽孢杆菌接菌数量为终浓度5×105～5×106个/mL培养基；
所述液体发酵条件为温度37℃，发酵36～48h。
2.如权利要求1所述以硫酸软骨素生产工业废水为原料发酵生产枯草芽孢杆菌的方法，其特征是，所述糖蜜的添加量按照质量比为2.5％。
3.如权利要求1所述以硫酸软骨素生产工业废水为原料发酵生产枯草芽孢杆菌的方法，其特征是，所述接入枯草芽孢杆菌接菌数量为终浓度1×106个/mL培养基。
4.如权利要求1所述以硫酸软骨素生产工业废水为原料发酵生产枯草芽孢杆菌的方法，其特征是，硫酸软骨素生产工业废水10L，按照0.5～5％质量比加入糖蜜50～250g，混匀溶解后调节pH＝6.5～7.0，121℃条件下高温灭菌20min，冷却，按终浓度5×105～5×106个/mL培养基接入枯草芽孢杆菌；10L液体发酵罐具体参数如下：温度控制37℃，罐压0.05mpa，0-6h转速150rpm,通气量1:0.5；6-24h转速250rpm，通气量1:1.2；24h后转速150rpm，通气量1:0.5，发酵36～48h，发酵液经双效浓缩器浓缩10～20倍后获得枯草芽孢杆菌浓缩液。
5.一种饲料添加剂，其特征是，包含权利要求4中所述的枯草芽孢杆菌浓缩液。
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