CN106243186A - 可独立用于蛋白质复性或作为蛋白质复性前导操作的循环运作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了可独立用于蛋白质复性或作为蛋白质复性前导操作的循环运作方法,包括:(1)将待复性样本加入到变性溶液中溶解;(2)低温环境,变性剂从溶液中逐步析出,微观层面首次做到分子程度产生变性盐浓度平滑下降梯度,在溶液中逐渐形成复性和/或准复性态蛋白质前体,同时随着变性剂的结晶析出,溶液体积减小,蛋白质浓度获得大幅度提升;(3)分离复性和/或准复性态蛋白质前体;(4)将步骤(2)析出的变性剂的结晶与步骤(3)分离出的复性蛋白质和/或准复性蛋白质前体的溶液再溶解,回到步骤(1)的状态,完成一个生产循环。可根据情况随时对各种工作材质进行灵活的调整。该方法可高效制备复性和/或准复性态蛋白质前体。
Description
技术领域
本发明属于基础生物技术领域,具体而言,本发明涉及一种可独立用于蛋白质复性或作为蛋白质复性前导操作的循环运作方法。
背景技术
目前世界每年的重组蛋白质产品市场超过1600亿美元(1H.-P.Meyer,D.Schmidhalter inInnovations in Biotechnology(Ed.:E.Agbo),InTech,Rijeka,2012,pp.211–250.),如何高效廉价的生产蛋白质产品是科研和产业界孜孜以求的重大项目。
自上世纪30年代,科研先驱们就已经发现在缓慢降低变性剂浓度的过程中,一些变性的蛋白质可以回复生物活性。上世纪80年代,随着PCR技术的逐渐成熟,由极为廉价高效的大肠杆菌产生包涵体复性的研究一度成为科技界的焦点。但是现实确实是非常令人失望的,在进入新世纪之后,多数研究人员退出了这个领域。在生物中心法则的链条中,由肽链到生物活性蛋白质的这个环节依然困扰着人类。目前已有方法均为单向、不可控、不可逆操作。直至目前,实际使用的复性方法得率一直徘徊在10%左右。换言之,90%宝贵的未复性蛋白都只能作为高污染难处理的废弃尾液成分予以对待。可以断言,有效突破复性技术瓶颈,其学术价值等同于获得诺贝尔生物学奖的PCR技术,经济价值更是无法限量。
分析以往的技术几乎都具有一个共同的特征,为了得到变性盐缓慢下降梯度,只能用各种手法以略为稀释的变性剂去稀释复性体系。操作过程是完全不可逆状态,这也就不可避免的导致大量的高污染尾液的存在,同时自然也限制了复性体系的浓度要求。只能很明显的违反理论思路的去搞高浓度复性。并且以往的技术得到的变性盐下降梯度在微观环境看仍然“暴虐”,导致复性成功率非常低,目前实用的复性方法得率仅仅10%左右。在蛋白质复性领域总结近一个世纪的经验居然得出:每种蛋白的复性条件都不同,只能具体蛋白具体摸索,并且很多蛋白可能不能复性。
现实里面,降低溶液浓度的方式除了兑水之外还可以“取出”溶质。然而这一点在近一个世纪的复性探索中似乎都被忽略掉了。找到的方法是透析,超滤,电渗(参见清华大学化工系刘铮教授主导的专利:一种电场下蛋白质再折叠装置,申请号:CN01130790)。但是此方法仍然无法摆脱大量的尾液污染。
因此,蛋白质复性方法绝对有必要进一步研究。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的核心难点问题。为此,本发明的一个目的在于提出一种独立用于蛋白质复性或用于蛋白质复性前导操作的循环运作方法,该方法可以有效制备复性蛋白质和/或准复性态蛋白质前体,利用盐类溶解度受温度影响析出,并且析出的变性剂可回收再利用,从而大幅度削减制备复性蛋白质的生产成本,同时降低污染和综合能耗,保护环境。
在本发明的一个方面,本发明提出了一种可独立用于蛋白质复性或作为蛋白质复性前导操作的循环运作方法,该方法包括:
(1)在容器中,将含有待复性蛋白质的样本加入到变性溶液中溶解,其中,所述变性溶液中含有变性剂;
(2)将所述容器置于低温环境下,使得所述变性剂从所述变性溶液中逐步析出,从而在所述变性溶液中形成变性剂浓度下降梯度,逐步削减所述变性剂的变性能力,微观层面首次做到分子程度产生变性盐浓度平滑下降梯度,以便在所述变性溶液中逐渐形成复性蛋白质和/或准复性态蛋白质前体,同时随着所述变性剂的结晶析出,溶液体积减小,并且蛋白质浓度可获得大幅度提升;
(3)分离所述复性蛋白质和/或准复性态蛋白质前体;以及
(4)将步骤(2)析出的变性剂的结晶与步骤(3)分离出的复性蛋白质和/或准复性蛋白质前体的溶液再次溶解,并可根据情况补足相应的工作材质,即可回到步骤(1)的状态,完成一个生产循环。
根据本发明实施例的可独立用于蛋白质复性或作为蛋白质复性前导操作的循环运作方法通过采用冷冻的方式使得变性剂从变性溶液中逐步析出,从而在变性溶液中形成变性剂浓度下降梯度,即达到平滑降低变性剂浓度的目的,从而逐步削减变性剂的变性能力,进而可以制备得到复性蛋白质或准复性态蛋白质前体,较以往采用稀释的复性蛋白质的技术相比,本发明几乎不产生尾液,并且低温抑制分子运动,减少肽链碰撞产生错误折叠(导致连锁反应,产生大量沉淀,直接引发操作失败,严重者可以损坏设备),提高复性效率,而且对变性溶液的初始浓度没有严格要求,同时本发明中析出的变性剂可以轻易回收并重复利用,从而可以显著降低复性蛋白质的成本,另外变性剂的析出可以使得溶液体积大幅度减少,过程中蛋白质溶液得到史无前例的有效的浓缩,从而利于进一步操作,降低复性蛋白质的制备成本。
另外,根据本发明上述实施例的蛋白质复性方法还可以具有如下附加的技术特征:
在本发明的一些实施例中,在步骤(2)中,可对所述溶液施加声波、电场、磁场、高压等辅助操作中的一种或多种。由此,可以震荡变性溶液中待复性蛋白质中的肽链,促进肽链自行塌缩进行复性,从而可以提高蛋白质复性效率。本质上也唯有结合本发明创造的近于微观静止的环境才有可能有效的施展上述各种操作,并已经实验验证其有效性。因为之前所有的复性方法为获得溶液各部变性盐均匀下降梯度,均被迫采用不同程度的溶液宏观流动或/和搅拌操作,在微观分子角度看都是极其剧烈的运动状态,上述电场、磁场等操作对肽链产生的微小振动在此情况下完全可以湮灭忽略不计。同时为了应对低温导致溶液粘度上升,析出的微小结晶不易沉淀问题,可以对溶液进行离心操作。由于复性溶液含有变性盐、肽链等大量溶质,具有导电性,在电场中可瞬时形成与外加电场大小相等,方向相反的感生电场。肽链分子特征决定两端带有不同电荷,受电场影响可以规律性排列。进一步抑制布朗运动,防止错配,提高复性率。
在本发明的一些实施例中,所述变性剂为有效打开次级键使肽链保持自由伸展态的化学试剂,优选尿素和盐酸胍中的至少一种。由此,可以显著提高蛋白质复性效率。
在本发明的一些实施例中,所述尿素的浓度为4摩尔/升以上。由此,可以进一步提高蛋白质复性效率。
在本发明的一些实施例中,所述盐酸胍的浓度为4摩尔/升以上。由此,可以进一步提高蛋白质复性效率。
在本发明的一些实施例中,所述变性溶液进一步含有还原剂和低温保护剂。
在本发明的一些实施例中,所述还原剂为可以破坏二硫键产生还原态巯基的物质。
在本发明的一些实施例中,所述还原剂可选自二巯基乙醇、二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦、还原型谷胱肝肽、硫化氢、抗坏血酸和硫代硫酸钠中的至少一种。由此,可以通过还原反应有效打开错配的二硫键,同时可以促进包涵体的溶解,并且可以进行氧化还原电对的交换,从而促进不正确折叠的肽链趋向于正确折叠。
在本发明的一些实施例中,所述低温保护剂为选自脱脂乳、明胶、蛋白质、蛋白质水解物、多肽、酵母、肉汤、糊精、甲基纤维素、血清、蛋白胨、硫代硫酸钠、乳酸钙、谷氨酸钠、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、醋酸氨、氯化铵、蔗糖、乳糖、岩藻糖、麦芽糖、葡萄糖、棉子糖、果糖、己糖、山梨醇、乙醇、乙二醇、甘油、甘露醇、肌醇、木糖醇、柠檬酸、磷酸、酒石酸、氨基酸、乙二氨四乙酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、葡聚醣、聚乙二醇和PVP中的至少一种。由此,可以保护蛋白质在低温下的活性。
在本发明的一些实施例中,所述变性溶液的pH为4.0~10.0。由此,可以进一步提高蛋白质的复性效率。
在本发明的一些实施例中,在步骤(2)中,所述低温环境的温度为低于零上4摄氏度。由此,可以进一步提高蛋白质的复性效率。
在本发明的一些实施例中,在所述变性溶液中,所述待复性蛋白质的浓度为0.001μg/ml~50mg/ml。
在本发明的一些实施例中,所述待复性蛋白质的至少一部分可呈现包涵体的形式。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1是根据本发明一个实施例的可独立用于蛋白质复性或作为蛋白质复性前导操作的循环运作方法的流程示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例,所述实施例的示例在附图中示出,其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的,旨在用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
在本发明的一个方面,本发明提出了一种可独立用于蛋白质复性或作为蛋白质复性前导操作的循环运作方法,下面参考图1对本发明实施例的可独立用于蛋白质复性或作为蛋白质复性前导操作的循环运作方法进行详细描述。根据本发明的实施例,该方法包括:
S100:将含有待复性蛋白质的样本加入到变性溶液中溶解
根据本发明的实施例,在容器中,将含有待复性蛋白质的样本加入到变性溶液中溶解,根据本发明的具体实施例,变性溶液中可以含有变性剂。
根据本发明的实施例,变性剂的具体类型并不受特别限制,根据本发明的具体实施例,变性剂可以为有效打开次级键使肽链保持自由伸展态的化学试剂,例如可以为选自尿素和盐酸胍中的至少一种。由此,可以显著提高蛋白质的复性效率。
根据本发明的实施例,尿素和盐酸胍的浓度并不受特别限制,根据本发明的具体实施例,尿素和盐酸胍的浓度均可以为4摩尔/升以上。由此,可以进一步提高蛋白质的复性效率。
根据本发明的实施例,变性溶液可以进一步含有还原剂和低温保护剂。根据本发明的实施例,变性溶液中的还原剂的具体类型并不受特别限制,根据本发明的具体实施例,还原剂为可以破坏二硫键产生还原态巯基的任何物质,根据本发明的具体示例,还原剂可以为选自二巯基乙醇、二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦、还原型谷胱肝肽、抗坏血酸、硫化氢和硫代硫酸钠中的一种或多种。具体地,采用尿素和盐酸胍作为变性剂可以显著降低非正确折叠肽链的稳定性,从而促进非正确折叠肽链的解折叠,同时通过加入可以打开二硫键的还原剂能使得不正确折叠的蛋白质结构以及不正确连接的二硫键变得不稳定,使肽链折叠趋向于正确方向进行,由此,可以大幅度地提高蛋白质的折叠效率,进而提高蛋白质的复性效率。需要说明的是,在使用过程中,还原剂的浓度可以根据蛋白质中二硫键的多寡增加或减少。
根据本发明的实施例,变性溶液中低温保护剂的具体类型并不受特别限制,根据本发明的具体实施例,低温保护剂可以为选自脱脂乳、明胶、蛋白质、蛋白质水解物、多肽、酵母、肉汤、糊精、甲基纤维素、血清、蛋白胨、硫代硫酸钠、乳酸钙、谷氨酸钠、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、醋酸氨、氯化铵、蔗糖、乳糖、岩藻糖、麦芽糖、葡萄糖、棉子糖、果糖、己糖、山梨醇、乙醇、乙二醇、甘油、甘露醇、肌醇、木糖醇、柠檬酸、磷酸、酒石酸、氨基酸、乙二氨四乙酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、葡聚醣、聚乙二醇和PVP中的至少一种。发明人发现,该类低温保护剂可对溶液冰点降低起到相应作用,对维持溶液状态,保持蛋白活性起到非常好的作用,由此,可以保护蛋白质在低温下的活性。例如可以采用浓度为25重量%的蔗糖溶液和浓度为10重量%的甘油作为低温保护剂。需要说明的是,低温保护剂即可以保护蛋白质又可能促进变性盐的析出。到目前,发明人发现,采用浓度为25g每100mL的蔗糖溶液和浓度为10%体积的甘油作为保护剂可以明显优于其他保护剂在低温下保护蛋白质活性,同时可以提高溶液的粘度,由此可以减少分子碰撞的机会,使得肽链趋向于“自我正确折叠”,从而提高蛋白质的复性效率。根据本发明的实施例,变性溶液的pH并不受特别限制,根据本发明的具体实施例,变性溶液的pH可以为4.0~10.0,优选6.5~8.5,更优选7.0~8.0。由此,可以进一步提高蛋白质复性效率。
根据本发明的实施例,变性溶液中,待复性蛋白质的浓度并不受特别限制,根据本发明的具体实施例,待复性蛋白质的浓度可以为0.001μg/ml~50mg/ml。由此,可以进一步提高蛋白质复性效率。
根据本发明的实施例,待复性蛋白质的具体形式并不受特别限制,根据本发明的具体实施例,待复性蛋白质的至少一部分可呈现包涵体的形式。例如,待复性蛋白质可以为失活EGF,也可以为由大肠杆菌表达的EGF包涵体。具体的,EGF包涵体可以通过以下步骤得到:将平板转液体活化基因工程大肠杆菌BL21(pet30b-EGF)转接到1L LB培养基上,待长到OD0.8后加入300uM的IPTG,在16摄氏度下诱导过夜,并离心收集菌液,利用Trisbuffer(Tris-HCl 20mmol/L,pH7.5)洗涤3次,然后超声破碎细胞,超速离心后取沉淀,沉淀用Triton 100缓冲液(Tris-HCl 20mmol/L,pH7.5,EDTA 10mmol/L,NaCl 0.5mol/L,Triton X-100,1%)洗涤5次,然后用乙醇洗涤,烘干。
S200:将容器置于低温环境,使得变性剂从变性溶液中逐步析出
根据本发明的实施例,将容器置于低温环境下,使得变性剂从变性溶液中逐步析出,从而在变性溶液中形成变性剂浓度下降梯度,逐步削减变性剂的变性能力,以便在变性溶液中逐渐形成复性蛋白质和/或准复性态蛋白质前体,同时随着变性剂的结晶析出,溶液体积减小,并且蛋白质浓度可获得大幅度提升。发明人发现,较以往采用稀释的复性蛋白质的技术相比,本发明不会产生大量的尾液,并且对变性溶液的初始浓度没有严格要求,同时本发明中析出的变性剂可以回收并重复利用,从而可以显著降低复性蛋白质的成本,另外变性剂的析出可以使得复性过程中溶液体积减小,蛋白质溶液得到近于翻倍的浓缩,从而进一步降低复性蛋白质的制备成本。
根据本发明的实施例,低温环境的具体温度并不受特别限制,根据本发明的具体实施例,低温环境可以为不高于零上4摄氏度。例如,将容器置于零下20度的低温环境中,然后进行缓慢程序降温,随着变性剂(尿素)晶体析出,在容器中逐渐形成变性剂浓度梯度,当有大量变性剂(尿素)晶体析出时,将之捞出,剩余的继续冻结至出冰块,待上面的冰块和下面的尿素结晶明显有个分界区,取出上面的冰块到离心管在零下20摄氏度冻存。发明人发现,在整个复性过程中可以通过完全依赖温度的缓慢变化来达到平滑降低变性剂浓度,并且在复性容器中设置纵向和横向的滞流隔板以控制液体的对流,保证了溶液的宏观安静状态,即在宏观环境上保证了肽链复性的不受干扰,同时温度降低意味着分子运动的减弱,也就意味着分子相互碰撞的减少和减弱,而通常肽链含有大量的易于产生错配的二硫键或者次级键位置,分子运动的减弱也就意味着肽链可以在一个相对“安静”的微观环境中,从而由肽链的一级结构驱动其“自我正确折叠”,另外该方法可以显著降低稀释液的使用成本,并且对变性溶液的初始浓度没有严格要求。
根据本发明的实施例,可以对容器施加声波、电场、磁场、高压中的一种或多种。由此,可以震荡变性溶液中待复性蛋白质中的肽链,促进肽链塌缩,从而可以提高蛋白质复性效率。通过离心可以有效解决低温环境导致液体粘滞系数增高导致的微小结晶难以有效沉淀的问题,从而可以进一步提高蛋白质复性效率。
S300:分离复性蛋白质和/或准复性态蛋白质前体
根据本发明的实施例,分离复性蛋白质或准复性态蛋白质前体。该步骤中,具体的,在冻结的情况下可以直接对冰块进行提取,而未冻结情况可以用吸管抽取,或用隔板直接分离该区域再做后续处置。
需要说明是,若作为蛋白质复性前导操作的方法,在得到准复性态蛋白质前体后,可以进一步采用其他复性方法得到复性蛋白质。
S400:将步骤S200析出的变性剂的结晶与步骤S300分离出的复性蛋白质和/或准复性蛋白质前体的溶液再次溶解,并可根据情况补足相应的工作材质
根据本发明的实施例,将步骤S200析出的变性剂的结晶与步骤S300分离出的复性蛋白质和/或准复性蛋白质前体的溶液再次溶解,并可根据情况补足相应的工作材质,即可回到步骤(1)的状态,完成一个生产循环,并且实际操作中还可根据情况随时对各种工作材质进行方便灵活的调整。
根据本发明实施例的可独立用于蛋白质复性或作为蛋白质复性前导操作的循环运作方法通过采用冷冻的方式使得变性剂从变性溶液中逐步析出,从而在变性溶液中形成变性剂浓度下降梯度,即达到平滑降低变性剂浓度的目的,从而逐步削减变性剂的变性能力,进而可以制备得到复性蛋白质或准复性态蛋白质前体,较以往采用稀释的复性蛋白质的技术相比,本发明几乎不产生污染尾液,并且对变性溶液的初始浓度没有严格要求,同时本发明中析出的变性剂可以回收并重复利用,从而可以显著降低复性蛋白质的成本,另外变性剂的析出可以使得复性过程中蛋白质溶液得到有效的浓缩,从而进一步降低复性蛋白质的制备成本。
下面参考具体实施例,对本发明进行描述,需要说明的是,这些实施例仅仅是描述性的,而不以任何方式限制本发明。
实施例1
首先将250毫升的浓度为8摩尔/升的尿素溶液与50微升的二巯基乙醇进行第一混合处理,得到变性溶液;取所得到的变性溶液200毫升与20毫克的压碎的EGF包涵体进行第二混合处理,得到浓度为0.1mg/ml的包涵体溶液;向所得到的包涵体溶液中加入50克25wt%的蔗糖和20毫升10wt%的甘油,并利用碳酸钠溶液将变性溶液的pH调节至7~8;将所得到混合溶液放置零下20摄氏度进行程序降温,待有大量尿素晶体析出时,将之捞出,剩余的继续冻结至出冰块,待上面的冰块和下面的尿素结晶明显有个分界区,取出上面的冰块到离心管在零下20摄氏度冻存,分离得到复性蛋白质,然后随机取所得复性蛋白质样品3份,使用博士德生物人表皮生长因子ELISA试剂盒检测所得复性蛋白质活性。按照说明书进行操作,显示黄色为有活性。使用北京六一WD-2102A全自动酶标仪测样品的吸光度,具体实验数据如表1所示:
表1各样品的吸光度
吸光度 | |
空白对照 | 0.001 |
样品1 | 0.135 |
样品2 | 0.152 |
样品3 | 0.139 |
实施例2
首先将250毫升的浓度为8摩尔/升的尿素溶液与0.2毫升的二巯基乙醇进行第一混合处理,得到变性溶液;取所得到的变性溶液1.4升与140毫克的压碎的EGF包涵体进行第二混合处理,得到浓度为0.1mg/ml的包涵体溶液;向所得到的包涵体溶液中加入100ml甘油作为防冻保护剂,并调整溶液冰点,并利用碳酸钠溶液将变性溶液的pH调节至7.1;容器包裹几层毛巾保温,将所得到混合溶液放置零下20摄氏度进行程序降温,观察析出情况,并捞出过多的结晶,待表层液体冻结后,提取浮冰层,并对所得蛋白融化后即可获得复性蛋白质,然后随机取所得复性蛋白质样品3份,使用博士德生物人表皮生长因子ELISA试剂盒检测所得复性蛋白质活性。按照说明书进行操作,显示黄色为有活性。使用北京六一WD-2102A全自动酶标仪测样品的吸光度,具体实验数据如表2所示:
表2各样品的吸光度
吸光度 | |
空白对照 | 0.001 |
样品1 | 0.089 |
样品2 | 0.100 |
样品3 | 0.104 |
实施例3
首先将250毫升的浓度为8摩尔/升的尿素溶液与0.2毫升的二巯基乙醇进行第一混合处理,得到变性溶液;取所得到的变性溶液1.4升与140毫克的压碎的EGF包涵体进行第二混合处理,得到浓度为0.1mg/ml的包涵体溶液;向所得到的包涵体溶液中加入100ml甘油作为防冻保护剂,调整溶液冰点,并利用碳酸钠溶液将变性溶液的pH调节至7.1;容器包裹几层毛巾保温,然后将所得到混合溶液放置零下14摄氏度进行程序降温,直接可倒出大量浓缩溶液,其中含有EGF准复性前体。此即为前导操作,所得溶液可轻易衔接其他复性方法,并且对所得准复性前体按照1比5倍稀释,然后随机取所得准复性前体样品3份,使用博士德生物人表皮生长因子ELISA试剂盒检测所得准复性前体活性。按照说明书进行操作,显示黄色为有活性。使用北京六一WD-2102A全自动酶标仪测样品的吸光度,具体实验数据如表3所示:
表3各样品的吸光度
实施例4
首先将250毫升的浓度为8摩尔/升的尿素溶液与0.2毫升的二巯基乙醇进行第一混合处理,得到变性溶液;取所得到的变性溶液1.4升与30毫克的压碎的BSA进行第二混合处理,得到浓度为0.1mg/ml的包涵体溶液;向所得到的包涵体溶液中加入100ml甘油作为防冻保护剂,并调整溶液冰点,并利用碳酸钠溶液将变性溶液的pH调节至7.2;容器包裹几层毛巾保温,然后将所得到混合溶液放置零下25摄氏度进行程序降温,取早期融化出的液体进行做5倍稀释,然后随机取所得样品3份,使用上海通蔚实业有限公司牛血清白蛋白试剂盒检测复性蛋白活性。按照说明书进行操作,显示黄色为有活性。使用北京六一WD-2102A全自动酶标仪测样品的吸光度,具体实验数据如表4所示:
表4各样品的吸光度
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (13)
1.一种可独立用于蛋白质复性或作为蛋白质复性前导操作的循环运作方法,其特征在于,包括:
(1)在容器中,将含有待复性蛋白质的样本加入到变性溶液中溶解,其中,所述变性溶液中含有变性剂;
(2)将所述容器置于低温环境下,使得所述变性剂从所述变性溶液中逐步析出,从而在所述变性溶液中形成变性剂浓度下降梯度,逐步削减所述变性剂的变性能力,微观层面首次做到分子程度产生变性盐浓度平滑下降梯度,以便在所述变性溶液中逐渐形成复性蛋白质和/或准复性态蛋白质前体,同时随着所述变性剂的结晶析出,溶液体积减小,并且蛋白质浓度可获得大幅度提升;
(3)分离所述复性蛋白质和/或准复性态蛋白质前体;以及
(4)将步骤(2)析出的变性剂的结晶与步骤(3)分离出的复性蛋白质和/或准复性蛋白质前体的溶液再次溶解,并可根据情况补足相应的工作材质,即可回到步骤(1)的状态,完成一个生产循环。
2.根据权利要求1所述的可独立用于蛋白质复性或作为蛋白质复性前导操作的循环运作方法,其特征在于,在步骤(2)中,可对所述溶液施加电场、磁场、高压、声波和离心操作中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的可独立用于蛋白质复性或作为蛋白质复性前导操作的循环运作方法,其特征在于,所述变性剂为有效打开次级键使肽链保持自由伸展态的化学试剂,优选尿素和盐酸胍中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的可独立用于蛋白质复性或作为蛋白质复性前导操作的循环运作方法,其特征在于,所述尿素的浓度为4摩尔/升以上。
5.根据权利要求3所述的可独立用于蛋白质复性或作为蛋白质复性前导操作的循环运作方法,其特征在于,所述盐酸胍的浓度为4摩尔/升以上。
6.根据权利要求1所述的可独立用于蛋白质复性或作为蛋白质复性前导操作的循环运作方法,其特征在于,所述变性溶液进一步含有还原剂和低温保护剂。
7.根据权利要求6所述的可独立用于蛋白质复性或作为蛋白质复性前导操作的循环运作方法,其特征在于,所述还原剂为可以破坏二硫键产生还原态巯基的物质。
8.根据权利要求7所述的可独立用于蛋白质复性或作为蛋白质复性前导操作的循环运作方法,其特征在于,所述还原剂可选自二巯基乙醇、二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦、还原型谷胱肝肽、抗坏血酸、硫化氢和硫代硫酸钠中的一种或多种。
9.根据权利要求6所述的可独立用于蛋白质复性或作为蛋白质复性前导操作的循环运作方法,其特征在于,所述低温保护剂为选自脱脂乳、明胶、蛋白质、蛋白质水解物、多肽、酵母、肉汤、糊精、甲基纤维素、血清、蛋白胨、硫代硫酸钠、乳酸钙、谷氨酸钠、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、醋酸氨、氯化铵、蔗糖、乳糖、岩藻糖、麦芽糖、葡萄糖、棉子糖、果糖、己糖、山梨醇、乙醇、乙二醇、甘油、甘露醇、肌醇、木糖醇、柠檬酸、磷酸、酒石酸、氨基酸、乙二氨四乙酸、氢氧化钠、碳酸氢钠、葡聚醣、聚乙二醇和PVP中的至少一种。
10.根据权利要求1所述的可独立用于蛋白质复性或作为蛋白质复性前导操作的循环运作方法,其特征在于,所述变性溶液的pH为4.0~10.0。
11.根据权利要求1所述的可独立用于蛋白质复性或作为蛋白质复性前导操作的循环运作方法,其特征在于,在步骤(2)中,所述低温环境的温度为低于零上4摄氏度。
12.根据权利要求1所述的可独立用于蛋白质复性或作为蛋白质复性前导操作的循环运作方法,其特征在于,在所述变性溶液中,所述待复性蛋白质的浓度为0.001μg/ml~50mg/ml。
13.根据权利要求1所述的可独立用于蛋白质复性或作为蛋白质复性前导操作的循环运作方法,其特征在于,所述待复性蛋白质的至少一部分可呈现包涵体的形式。
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