CN106232106B - 用于诱导先天性和适应性免疫力的颗粒状疫苗制剂 - Google Patents

用于诱导先天性和适应性免疫力的颗粒状疫苗制剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于诱导对抗感染或疾病的免疫应答的组合物、试剂盒和方法。所述组合物通常包括平均有效直径为0.5‑20μm的可生物降解的粒子，并且任选地所述组合物包括佐剂、凋亡抑制剂和抗原中的一种或多种。所述组合物、试剂盒和方法可用于诱导对抗病原体或疾病的细胞介导的应答例如辅助性T细胞应答和/或体液应答。在某些实施方式中，相对于其他类型的免疫应答例如Th2应答，所述组合物、试剂盒和方法可用于优先诱导Th1应答。

Description

用于诱导先天性和适应性免疫力的颗粒状疫苗制剂
与相关申请的交叉引用
本申请要求2014年4月18日提交的美国临时申请号61/981,328和2014年4月30日提交的美国临时申请号61/986,148在35U.S.C.§119(e)下的权益，所述临时申请的内容整体通过参考并入本文。
背景技术
本发明总的来说涉及用于诱导免疫应答的组合物、试剂盒和方法的领域。具体来说，本发明涉及用于诱导对抗感染或疾病的先天性或适应性免疫力的颗粒状疫苗制剂。
辅助性T(Th)淋巴细胞根据它们的功能性能力和细胞因子概况，可以分类成两个不同的效应细胞亚类。Th1细胞产生IFN-γ、TNF-β和IL-2，并帮助激活巨噬细胞和细胞毒性T淋巴细胞。此外，Th1细胞在那些促进调理作用的抗体同种型的生产中协助其他免疫细胞。Th2细胞引发B细胞产生并分泌抗体。相反，Th2细胞在诱导B细胞产生某些抗体同种型例如IgE和IgA中特别有效，所述抗体同种型中和细胞间病原体并帮助调理作用、补体、肥大细胞和嗜酸性粒细胞激活。由于这些功能性差异，Th1和Th2在选定病原体的消除中表现出不同效率。可以通过Th1应答成功预防或治疗的疾病包括作为细胞内感染的分枝杆菌感染如结核病、麻风病、利什曼病和血吸虫病，以及某些病毒疾病。Th2应答提供对抗蠕虫以及某些细菌例如肺炎球菌和脑膜炎球菌的保护。
Th1和Th2细胞由被称为Th0的共同前体细胞产生。辅助性T细胞分化成Th1和Th2细胞是决定免疫应答的结果(即病原体是否持留，宿主是否得到保护，和/或宿主是否将经历免疫发病机理)的重要事件。相对于体液形式的免疫力，感染性病原体可能表现出诱导细胞介导形式的免疫力的倾向性。对抗细胞内病原体的成功防御倾向于伴有Th1优势和由此得到的细胞性细胞裂解活性，而对细胞外感染性病原体的抗性最通常由Th2效应物决定，这导致产生高水平的抗原特异性免疫球蛋白。因此，对有助于Th0细胞分化成Th1和Th2细胞的因素的更好的理解，将帮助便于准备更有效的预防和治疗策略。
发明内容
公开了用于诱导免疫应答的组合物、试剂盒和方法。相对于Th2细胞免疫应答，由所述组合物、试剂盒和方法诱导的免疫应答优选为Th1细胞免疫应答。
本文中公开的组合物和试剂盒包含平均有效直径为0.5-10μm的可生物降解的粒子，其在本文中已被显示有效地刺激先天性或适应性免疫应答。因此，本文中公开了用于诱导先天性或适应性免疫应答的颗粒状免疫原性组合物和疫苗制剂。
所公开的组合物和制剂的粒子是可生物降解的，并且可以包括聚合或非聚合材料。在某些实施方式中，所述可生物降解的粒子包含由糖类单体形成的聚合材料。所述可生物降解的粒子可以通过包括将液体组合物喷雾干燥以形成所述可生物降解的粒子的过程来形成。
所述组合物和制剂任选地可以包含用于所述可生物降解的粒子的赋形剂。在某些实施方式中，所述组合物和制剂包含粉末赋形剂。在其他实施方式中，所述组合物和制剂包含所述可生物降解的粒子在赋形剂中的悬液，所述赋形剂包括非离子型表面活性剂溶液。
可以将公开的包含可生物降解的粒子的组合物和制剂给药到对象，以便诱导免疫应答。在某些实施方式中，将所述公开的组合物和制剂以将所述可生物降解的粒子以约(BW/20)3/4μg至100x((BW/20)3/4)μg之间的量递送到所述对象的剂量给药到所述对象，其中BW是以克为单位的对象体重。
所述公开的包含可生物降解的粒子的组合物和制剂可以包括用于调节免疫应答的其他药剂。在某些实施方式中，所述公开的包含可生物降解的粒子的组合物和制剂还包含佐剂。甚至在其他实施方式中，所述公开的包含可生物降解的粒子的组合物和制剂还包含凋亡抑制剂。
在某些实施方式中，所述公开的包含可生物降解的粒子的组合物和制剂可以在用于在对象中诱导先天性免疫力的方法中给药到所述对象。例如，所述组合物和制剂可以由所述可生物降解的粒子和任选地佐剂和/或凋亡抑制剂构成，并且所述疫苗制剂可以不包含用于诱导适应性免疫力的抗原。
在其他实施方式中，所述公开的包含可生物降解的粒子的组合物和制剂可以在用于诱导适应性免疫力的方法中给药到对象。例如，所述组合物和制剂可以包含所述可生物降解的粒子和任选地佐剂和/或凋亡抑制剂，并且所述组合物和制剂可以进一步包含用于诱导适应性免疫力的抗原。
在所述包含可生物降解的粒子的组合物和制剂还包含用于诱导适应性免疫力的抗原的实施方式中，所述抗原可以相对于所述可生物降解的粒子的浓度以一定浓度存在。在某些实施方式中，所述组合物和制剂以0.2、0.5、1.0、2.0或5.0的摩尔比，优选地以接近1.0的摩尔比包含粒子和抗原。在所述抗原是小的肽抗原(例如具有10-50个氨基酸的肽抗原)的实施方式中，所述肽抗原可以以适合的浓度比存在于所述组合物和制剂中，所述适合的浓度比例如为0.00018飞摩尔抗原/μg可生物降解的粒子、0.0018飞摩尔抗原/μg可生物降解的粒子、0.018飞摩尔抗原/μg可生物降解的粒子、0.18飞摩尔抗原/μg可生物降解的粒子、1.8飞摩尔抗原/μg可生物降解的粒子、18.0飞摩尔抗原/μg可生物降解的粒子，以及在由任何成对的这些适合比率所定义的范围内的比率(例如0.18-1.8飞摩尔抗原/μg可生物降解的粒子)。
在所述包含可生物降解的粒子的组合物和制剂还包含用于诱导适应性免疫力的抗原的实施方式中，可以将所述疫苗制剂以将所述抗原以适合的剂量水平递送到对象的剂量给药到所述对象。在某些实施方式中，可以将所述组合物和制剂以适合的剂量水平给药到所述对象，所述适合的剂量水平为例如0.0009飞摩尔抗原/g对象体重、0.009飞摩尔抗原/g对象体重、0.09飞摩尔抗原/g对象体重、0.9飞摩尔抗原/g对象体重，以及在由任何成对的这些适合剂量水平所定义的范围内的剂量水平(例如0.09-0.9飞摩尔抗原/g对象体重)。在其他实施方式中，可以将所述组合物和制剂以适合的剂量水平给药到所述对象，所述适合的剂量水平为例如0.002pg抗原/g对象体重、0.02pg抗原/g对象体重、0.2pg抗原/g对象体重、2.0pg抗原/g对象体重，以及在由任何成对的这些适合剂量水平所定义的范围内的剂量水平(例如0.2-2.0pg抗原/g对象体重)。
用于所述包含可生物降解的粒子的组合物和制剂的适合的抗原可以包括肽抗原。例如，适合的抗原可以包括氨基酸长度小于约100、50、40、30或20个氨基酸的肽抗原。适合的抗原可以包括分子量小于约10、5、4、3或2kD的肽抗原。
本文中设想的方法包括由组合物和制剂的给药构成的方法，所述组合物和制剂基本上由所述可生物降解的粒子构成。在某些实施方式中，所述方法由组合物和制剂的给药构成，所述组合物和制剂基本上由所述可生物降解的粒子的悬液构成，例如所述可生物降解的粒子在非离子型表面活性剂的溶液中的悬液。在其他实施方式中，所述方法由组合物和制剂的给药构成，所述组合物和制剂基本上由所述可生物降解的粒子的悬液构成，例如所述可生物降解的粒子在非离子型表面活性剂和佐剂的溶液中的悬液。甚至在其他实施方式中，所述方法由组合物和制剂的给药构成，所述组合物和制剂基本上由所述可生物降解的粒子的悬液构成，例如所述可生物降解的粒子在非离子型表面活性剂、佐剂和凋亡抑制剂的溶液中的悬液。甚至在其他实施方式中，所述方法由组合物和制剂的给药构成，所述组合物和制剂基本上由所述可生物降解的粒子的悬液构成，例如所述可生物降解的粒子在非离子型表面活性剂、佐剂、凋亡抑制剂和抗原(例如肽抗原或肽抗原的混合物)的溶液中的悬液。
在所公开的方法中，可以将所述公开的组合物和制剂给药到对象，以便刺激T细胞免疫力。例如，可以将所述公开的疫苗组合物给药到对象，以便刺激对抗病原体感染的T细胞免疫力。在某些实施方式中，可以将所述公开的组合物和制剂给药到对象，以便刺激Th1细胞免疫应答。
本发明人已发现，当将所述公开的包含可生物降解的粒子的组合物和制剂给药到对象时，所述对象与尚未给药所述组合物和制剂的对象相比以更高的相对速率增加重量。因此，所述公开的方法包括给药所述公开的组合物和制剂以在对象中引起重量增加的方法。所述公开的方法还包括将所述公开的组合物和制剂给药到对象以在所述对象中提高饲料转化率的方法。所述公开的方法还包括将所述公开的组合物和制剂给药到对象以提高存活率的方法。适合于所述用于引起重量增加和/或用于提高饲料转化率的方法的对象可以包括但不限于家禽例如鸡和火鸡、猪和反刍动物例如牛、绵羊和山羊。
附图说明
图1.A.由PLGA-PEG:Pluronic L121＝3:2构成的喷雾干燥的微粒的扫描电子显微照片。B.在免疫刺激剂给药后第21天激惹时的存活百分数。C.在免疫刺激剂给药后第11天激惹时的存活百分数。D.在免疫刺激剂给药后第1天激惹时的存活百分数。
图2.A.给药PLGA RG502H粒子组合物+Pluronic
Figure GDA0001270167420000061
的小鼠与给药PLGARG502H组合物且不给药Pluronic
Figure GDA0001270167420000062
的小鼠相比，累计存活比例随羊流产衣原体(C.abortus)激惹后天数的变化曲线。B.给药PLGA RG502H粒子组合物+Pluronic
Figure GDA0001270167420000063
的小鼠与给药PLGA RG502H组合物且不给药Pluronic
Figure GDA0001270167420000064
的小鼠相比，体重减轻随羊流产衣原体(C.abortus)激惹后天数的变化曲线。C.给药PLGA RG502H组合物+雷西莫特(Resiquimod)的小鼠与给药PLGA RG502H粒子组合物且不给药Pluronic
Figure GDA0001270167420000065
的小鼠相比，累计存活比例随羊流产衣原体(C.abortus)激惹后天数的变化曲线。D.给药PLGARG502H组合物+雷西莫特的小鼠与给药PLGA RG502H粒子组合物且不给药Pluronic
Figure GDA0001270167420000066
的小鼠相比，体重减轻随羊流产衣原体(C.abortus)激惹后天数的变化曲线。
图3.给药免疫刺激剂的鸡与给药缓冲液对照的鸡相比，累计存活比例随在孵化时处理后天数的变化曲线。
图4.给药免疫刺激剂的鸡与给药缓冲液对照的鸡相比，21天后的体重。
图5.给药免疫刺激剂的鸡与给药缓冲液对照的鸡相比，从第0天到第21天的饲料转化率。
图6.给药含有或不含凋亡抑制剂Q-VD-OPH的奈非那韦粒子组合物和Pluronic
Figure GDA0001270167420000067
的小鼠的累计存活比例随羊流产衣原体(C.abortus)激惹后天数的变化曲线。
图7.A.给药含有凋亡抑制剂Q-VD-OPH的疫苗的小鼠与给药不含凋亡抑制剂的疫苗的小鼠相比，在激惹后第11天的体重减轻百分数。B.给药疫苗载体的小鼠与给药活疫苗的小鼠相比，在激惹后第11天的体重减轻百分数。C.给药含有凋亡抑制剂Q-VD-OPH的疫苗的小鼠与给药不含凋亡抑制剂的疫苗的小鼠相比，在激惹后第11天的肺重量。D.给药疫苗载体的小鼠与给药活疫苗的小鼠相比，在激惹后第11天的肺重量。E.给药含有凋亡抑制剂Q-VD-OPH的疫苗的小鼠与给药不含凋亡抑制剂的疫苗的小鼠相比的羊流产衣原体(Cabortus)载量。F.给药疫苗载体的小鼠与给药活疫苗的小鼠相比的羊流产衣原体(Cabortus)载量。
图8.A.给药含有凋亡抑制剂Q-VD-OPH的疫苗的鸡与给药不含凋亡抑制剂的疫苗的鸡相比，用IBDV激惹后第7天的法氏囊重量。B.给药悬浮缓冲液对照的鸡与未激惹的鸡相比，用IBDV激惹后第7天的法氏囊重量。C.给药含有凋亡抑制剂Q-VD-OPH的疫苗的受到激惹的鸡与给药不含凋亡抑制剂的疫苗的受到激惹的鸡相比的法氏囊炎症评分。D.给药悬浮缓冲液对照的受到激惹的鸡与未激惹的鸡相比的法氏囊炎症评分。E.给药含有凋亡抑制剂Q-VD-OPH的疫苗的鸡与给药不含凋亡抑制剂的疫苗的鸡相比，对炎症评分进行校正后的用IBDV激惹后第7天的法氏囊重量。F.给药悬浮缓冲液对照的鸡与未激惹的鸡相比，对炎症评分进行校正后的用IBDV激惹后第7天的法氏囊重量。G.给药含有凋亡抑制剂Q-VD-OPH的疫苗的鸡与给药不含凋亡抑制剂的疫苗的鸡相比的疾病防护百分数。H.给药悬浮缓冲液对照的鸡与未激惹的鸡相比的疾病防护百分数。
图9.给药奈非那韦粒子组合物、Poly(PC)和1飞摩尔羊流产衣原体(C.abortus)肽的小鼠与未处理的小鼠相比，累计存活比例随羊流产衣原体(C.abortus)激惹后天数的变化曲线。
图10.给药奈非那韦粒子组合物、Pluronic
Figure GDA0001270167420000071
和1飞摩尔羊流产衣原体(C.abortus)肽的小鼠与未处理的小鼠相比，累计存活比例随羊流产衣原体(C.abortus)激惹后天数的变化曲线。
图11.A.给药包含0.0、0.02-0.2或2.0飞摩尔的来自于羊流产衣原体(C.abortus)的5种保护性蛋白质的交叠肽的疫苗和活疫苗的小鼠在激惹后第11天的体重减轻百分数。B.给药包含0.0、0.02-0.2或2.0飞摩尔的来自于羊流产衣原体(C.abortus)的5种保护性蛋白质的交叠肽的疫苗和活疫苗的小鼠在激惹后第11天的肺重量。C.给药包含0.0、0.02-0.2或2.0飞摩尔的来自于羊流产衣原体(C.abortus)的5种保护性蛋白质的交叠肽的疫苗和活疫苗的小鼠的羊流产衣原体(C abortus)载量。D.给药包含0.02-0.2或2.0飞摩尔的来自于羊流产衣原体(C.abortus)的5种保护性蛋白质的交叠肽的疫苗的小鼠的体重减轻百分数随激惹后天数的变化曲线。E.给药包含0.0或0.02-0.2飞摩尔的来自于羊流产衣原体(C.abortus)的5种保护性蛋白质的交叠肽的疫苗的小鼠的体重减轻百分数随激惹后天数的变化曲线。F.给药包含0.0或2.0飞摩尔的来自于羊流产衣原体(C.abortus)的5种保护性蛋白质的交叠肽的疫苗的小鼠的体重减轻百分数随激惹后天数的变化曲线。G.给药包含0.0飞摩尔的来自于羊流产衣原体(C.abortus)的5种保护性蛋白质的交叠肽的疫苗和活疫苗的小鼠的体重减轻百分数随激惹后天数的变化曲线。
图12.A.给药包含0.0、0.54或3.82-191.2飞摩尔的IBDV肽的疫苗的鸡与未激惹的鸡相比，在激惹后第7天的法氏囊重量。B.给药包含0.0、0.54或3.82-191.2飞摩尔的IBDV肽的疫苗的鸡与未激惹的鸡相比，在激惹后第7天的法氏囊炎症评分。C.给药包含0.0、0.54或3.82-191.2飞摩尔的IBDV肽的疫苗的鸡与未激惹的鸡相比，对炎症评分进行校正后的用IBDV激惹后第7天的法氏囊重量。D.给药包含0.0、0.54或3.82-191.2飞摩尔的IBDV肽的疫苗的鸡与未激惹的鸡相比的疾病防护百分数。
图13.A.给药包含2.0飞摩尔的来自于羊流产衣原体(C.abortus)的5种保护性蛋白质的交叠肽的疫苗和活疫苗的小鼠在激惹后第11天的体重减轻百分数。B.给药包含2.0飞摩尔的来自于羊流产衣原体(C.abortus)的5种保护性蛋白质的交叠肽的疫苗和活疫苗的小鼠在激惹后第11天的肺重量。C.给药包含2.0飞摩尔的来自于羊流产衣原体(C.abortus)的5种保护性蛋白质的交叠肽的疫苗和活疫苗的小鼠的羊流产衣原体(Cabortus)载量。D.给药包含2.0飞摩尔的来自于羊流产衣原体(C.abortus)的5种保护性蛋白质的交叠肽的疫苗和活疫苗的小鼠的体重减轻百分数随激惹后天数的变化曲线。
具体实施方式
本文中公开了用于诱导对抗疾病的免疫应答的组合物、试剂盒和方法，它们可以使用如下讨论的几个定义来描述。
除非另有规定或上下文指明，否则没有具体数量的指称意味着“一个或多个”。此外，除非另有规定或上下文指明，否则单数名词例如“佐剂”、“凋亡抑制剂”和“抗原”，应该被解释为分别意味着“一种或多种佐剂”、“一种或多种凋亡抑制剂”和“一种或多种抗原”。
当在本文中使用时，“约”、“大约”、“大体上”和“显著地”应该被本领域普通技术人员所理解，并且在某种程度上随着它们所用于的语境而变。如果对于本领域普通技术人员来说所述术语的用法在使用它的上下文中没有清楚地给出，则“约”和“大约”意味着特定项的正负≤10％，“大体上”和“显著地”意味着特定项的正负>10％。
当在本文中使用时，术语“包括”与术语“包含”具有相同的含义。术语“包含”应该被解释为“开放性”过渡术语，其允许包含除了在权利要求中叙述的组分之外的其他组分。术语“由……构成”应该被解释为“封闭性”过渡术语，其不允许包含除了在权利要求中叙述的组分之外的其他组分。术语“基本上由……构成”应该被解释为部分封闭性的，并允许包含仅仅不从根本上改变权利要求中限定的主题内容的本质的其他组分。
术语“对象”、“患者”或“宿主”在本文中可以互换使用，并且可以是指人类或非人类动物。非人类动物可以包括但不限于家禽(例如鸡和火鸡)、牛、猪、马、狗和猫。
术语“对象”、“患者”或“个体”可用于具有可以通过疫苗进行治疗或防护的病原体(例如细菌、病毒或真菌病原体)感染或疾病(例如癌症或自体免疫疾病)或具有获得所述病原体感染或疾病的风险的人类或非人类动物。例如，用本文公开的组合物治疗的个体可能具有被病原体感染的风险或可能已经被所述病原体感染。用本文公开的组合物治疗的个体可能具有癌症风险或可能已经获得癌症。用本文公开的组合物治疗的个体可能具有自体免疫疾病的风险或可能已经获得自体免疫疾病。
可生物降解的粒子。所公开的组合物包括包含可生物降解的粒子的组合物。所述可生物降解的粒子通常具有0.1-20μm、优选地0.5-10μm的平均有效直径。所述可生物降解的粒子在本文中可能被称为“微粒”和/或“纳米粒子”。所述粒子正如本领域中所理解的是可生物降解的。术语“可生物降解的”描述了能够在生理环境中被降解成较小基本组分的材料。优选地，所述较小基本组分是无害的。例如，可生物降解的聚合物可以被降解成基本组分，所述基本组分包括但不限于水、二氧化碳、糖、有机酸(例如三羧酸或氨基酸)和醇(例如甘油或聚乙二醇)。可用于制备本文中设想的粒子的可生物降解材料可以包括在下列文献中公开的材料：美国专利号7,470,283，7,390,333，7,128,755，7,094,260，6,830,747，6,709,452，6,699,272，6,527,801，5,980,551，5,788,979，5,766,710，5,670,161和5,443,458，以及美国公布的申请号20090319041，20090299465，20090232863，20090192588，20090182415，20090182404，20090171455，20090149568，20090117039，20090110713，20090105352，20090082853，20090081270，20090004243，20080249633，20080243240，20080233169，20080233168，20080220048，20080154351，20080152690，20080119927，20080103583，20080091262，20080071357，20080069858，20080051880，20080008735，20070298066，20070288088，20070287987，20070281117，20070275033，20070264307，20070237803，20070224247，20070224244，20070224234，20070219626，20070203564，20070196423，20070141100，20070129793，20070129790，20070123973，20070106371，20070050018，20070043434，20070043433，20070014831，20070005130，20060287710，20060286138，20060264531，20060198868，20060193892，20060147491，20060051394，20060018948，20060009839，20060002979，20050283224，20050278015，20050267565，20050232971，20050177246，20050169968，20050019404，20050010280，20040260386，20040230316，20030153972，20030153971，20030144730，20030118692，20030109647，20030105518，20030105245，20030097173，20030045924，20030027940，20020183830，20020143388，20020082610和0020019661；其内容整体通过参考并入本文。通常，本文中公开的可生物降解的粒子在体内被降解，其降解速率使得所述粒子在给药后约4、5、6、7或8周后失去超过其初始质量的约50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。所述粒子可以包含聚合或非聚合的可生物降解材料，或者可以由所述材料形成。如果粒子包含聚合材料，所述粒子通常被降解成可生物降解的单体。如果粒子包含非聚合材料，所述粒子通常被降解成可生物降解的组分。
用于制备所述可生物降解的粒子的适合的聚合物可以包括但不限于聚合物如聚丙交酯(PLA)，包括聚乳酸，例如聚乙交酯(PGA)，包括聚乙醇酸，以及PLA和PGA的共聚物(即PLGA)。其他适合的聚合物可以包括但不限于聚己内酯(PCL)、聚二氧环己酮(PDO)、胶原蛋白、复性胶原蛋白、明胶、复性明胶、交联明胶及其共聚物。所述可生物降解的粒子的聚合物被设计成作为聚合物链水解的结果而降解成生物学可接受的且逐渐变小的组分，例如聚丙交酯、聚乙交酯以及它们的共聚物。它们最终分解成乳酸和乙醇酸，进入Kreb循环，被分解成二氧化碳和水并排泄。
适合的非聚合物可以包括溶解性不良的化合物，例如被显示出起到免疫调节剂作用的化合物。一种适合的化合物是奈非那韦，其已被显示表现出免疫增强效果。因此，本文中设想的可生物降解的粒子可以包括由免疫调节性化合物形成的可生物降解的粒子。
所述公开的可生物降解的粒子可以通过本领域中已知的方法来制备，所述方法包括但不限于喷雾干燥、沉淀和研磨。在某些实施方式中，所述可生物降解的粒子可以从可生物降解材料的溶液或悬液，任选地在一种或多种其他药剂例如佐剂、凋亡抑制剂和/或抗原存在下形成(例如通过对所述溶液或悬液进行喷雾干燥)。因此，所述可生物降解的粒子可以包含可生物降解材料，并任选地可以包含一种或多种其他药剂例如佐剂、凋亡抑制剂和/或抗原。
所述公开的可生物降解的粒子可以被给药以便在对象中诱导应答。在某些实施方式中，所述公开的方法包括给药包含可生物降解的粒子的组合物，以在所述对象中诱导免疫应答。在其他实施方式中，所述公开的方法由组合物的给药构成，所述组合物由可生物降解的粒子构成，以在所述对象中诱导免疫应答。诱导的免疫应答可以包括Th1细胞应答。在给药所述组合物的对象中诱导的免疫应答可能使所述对象表现出与未给药所述组合物的对象相比更高的体重增加或更好的饲料转化率。在某些实施方式中，所述公开的方法包括给药包含可生物降解的粒子的组合物，以在对象中引起体重增加和/或在对象中提高饲料转化率。
在所述公开的方法中给药的可生物降解的粒子的剂量可以随着对象体重而变。例如，体重为约20g的小鼠可以给药等同于约1-100μg(或2-50μg或5-20μg)的粒子的剂量。该剂量可以在公式(BW/20)3/4＝异速生长缩放因子的基础上进行异速生长缩放，其中“BW”等于以克为单位的目标动物体重。假设目标动物是体重1600g的鸡，则异速生长缩放因子为(1,600/20)3/4＝26.7。将用于20g小鼠的10μg微粒量乘以1600g鸡的缩放因子26.7，得到～270μg的微粒剂量。同样地，对于体重为80,000g的人来说，异速生长缩放因子为(80000/20)3/4＝～503。将用于20g小鼠的10μg微粒量乘以80000g人的缩放因子503，得到～5030μg的微粒剂量。
佐剂。本文公开的组合物任选地包括佐剂。术语“佐剂”是指增强免疫应答的化合物或混合物。佐剂可以起到缓慢释放抗原的组织仓库的作用，并且也起到非特异性增强免疫应答的淋巴系统激活剂的作用。可用于所述公开的组合物的佐剂的实例包括但不限于共聚物佐剂(例如Pluronic
Figure GDA0001270167420000121
品牌的泊洛沙姆401，CRL1005，或低分子量共聚物佐剂例如
Figure GDA0001270167420000122
佐剂)、poly(I:C)、R-848(一种Th1样佐剂)、雷西莫特、咪喹莫特、PAM3CYS、铝磷酸盐(例如AlPO4)、洛索立宾、潜在有用的人类佐剂如BCG(卡介苗)和短棒杆菌(Corynebacterium parvum)、CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、霍乱毒素来源的抗原(例如CTA1-DD)、脂多糖佐剂、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、皂苷(例如Quil-A)、无机凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质例如溶血卵磷脂、pluronic多元醇、聚阴离子、肽、油或烃在水中的乳液(例如可以从Novartis Vaccines获得的MF59或Montanide ISA 720)、钥孔戚血蓝素和二硝基酚。
凋亡抑制剂。本文中公开的组合物可以任选地包括凋亡抑制剂。“凋亡抑制剂”是指抑制细胞的凋亡过程的启动或进程的小分子。凋亡抑制剂可以包括泛半胱天冬酶的小抑制剂(例如Q-VD-OPH和emriscan)或参与凋亡途径的其他酶的抑制剂，以及介导凋亡的c-Myc、Bax、p53、tBid和BCL的抑制剂。
抗原和剂量。本文公开的组合物可以任选地包括抗原、一组抗原或多种抗原。在包含可生物降解的粒子和抗原的所述公开的组合物的实施方式中，所述粒子和抗原可以以适合的比率存在于所述组合物中。例如，所述粒子和抗原可以以约0.2、0.5、1.0、2.0或5.0的摩尔比，优选地以接近1.0的比率存在。
所述公开的组合物可以包含“一组”或“多种抗原”。当在本文中使用时，“一组”或“多种”抗原意味着“超过一种”，并且可以指超过1、2、3、4、5、10、25、50或100种抗原。一组或多种抗原可以包括一组不同的交叠的多肽(例如约10-20个氨基酸的多肽，其交叠约5-10个氨基酸)，其中所述交叠的多肽对应于与疾病相关的全长多肽。一组多核苷酸可以编码所选多肽的不同或独特的氨基酸序列。编码的不同或独特的氨基酸序列可以交叠。例如，一组交叠的多肽可以对应于蛋白质的全长序列，其中该组的第一多肽包括所述蛋白质的1-20位氨基酸，该组的第二多肽包括所述蛋白质的11-30位氨基酸，该组的第三多肽包括所述蛋白质的21-40位氨基酸，该组的第四多肽包括所述蛋白质的31-50位氨基酸，使得该组的交叠的多肽涵盖所述蛋白质的所有氨基酸序列。
所述组合物、试剂盒和方法含有或利用蛋白质、多肽、肽或一组蛋白质、多肽、肽作为抗原。在某些实施方式中，在本文公开的组合物、试剂盒和方法中包含或利用的抗原的剂量显著低于在本领域中常规使用的剂量(例如低至少一个数量级(10×))。所述组合物、试剂盒和方法可用于诱导对抗疾病的细胞介导的应答(例如辅助性T细胞应答)和/或体液应答。在某些实施方式中，相对于其他类型的免疫应答(例如Th2应答)，所述组合物、试剂盒和方法可用于优先诱导Th1应答。
在某些实施方式中，所述公开的组合物、试剂盒和方法与本领域的疫苗和方法相比包含或利用相对少量的抗原。正如本文中设想的，给药到需要的对象的适合的剂量可以是不超过约2pg抗原/g体重(优选地不超过约1pg抗原/g体重，更优选地不超过约0.5pg抗原/g体重，更优选地不超过约0.2pg抗原/g体重，更优选地不超过约0.1pg抗原/g体重，更优选地不超过约0.05pg抗原/g体重，甚至更优选地不超过约0.01pg抗原/g体重)。在某些实施方式中，给药到需要的对象的适合的剂量可以为至少约0.01pg抗原/g体重、至少约0.05pg抗原/g体重或至少约0.1pg抗原/g体重。例如，适合的剂量范围可以包括0.01-0.05pg抗原/g体重、0.01-0.1pg抗原/g体重或0.01-0.2pg抗原/g体重、0.01-1pg抗原/g体重、0.01-2pg抗原/g体重、0.05-0.1pg抗原/g体重、0.05-0.2pg抗原/g体重、0.05-1pg抗原/g体重或0.05-2pg抗原/g体重、0.1-0.2pg抗原/g体重、0.1-1pg抗原/g体重或0.1-2pg抗原/g体重。
本文中公开的组合物、试剂盒和方法可以包括给药作为抗原的肽或一组肽，以便诱导对抗疾病的免疫应答。例如，本文中公开的组合物、试剂盒和方法可以包括给药包含5-100个氨基酸(优选地10-20个氨基酸)的肽或一组肽。通常，所述肽具有不超过约5kDa(优选地不超过约4kDa、更优选地不超过约3kDa)的分子量。给药到需要的对象的所述肽或一组肽的适合的剂量，当通过每克对象体重给药的摩尔数来描述时，可以为不超过约1飞摩尔每种肽/g体重(优选地不超过约0.5飞摩尔每种肽/g体重，更优选地不超过约0.1飞摩尔每种肽/g体重，更优选地不超过约0.05飞摩尔每种肽/g体重，甚至更优选地不超过约0.01飞摩尔每种肽/g体重)。在某些实施方式中，给药到需要的对象的适合剂量，当通过每克对象体重的每种肽的摩尔数来描述时，可以为至少约0.01飞摩尔每种肽/g体重或至少约0.05飞摩尔抗原/g体重。例如，适合的剂量范围可以包括0.01-0.05飞摩尔抗原/g体重、0.01-0.1飞摩尔抗原/g体重、0.01-0.5飞摩尔抗原/g体重，包括0.01-1飞摩尔抗原/g体重、0.05-0.1飞摩尔抗原/g体重、0.05-0.5飞摩尔抗原/g体重和0.05-1飞摩尔抗原/g体重。
与本领域的常规疫苗和方法相比，所述组合物、试剂盒和方法可以包含或利用相对少量的抗原来诱导免疫应答(例如Th-1应答)。(参见美国公布的申请号2012/0009220，其内容整体通过参考并入本文)。常规的疫苗和方法通常包括向对象给药每剂至少约3μg抗原。(参见例如Scheifele等，2005，Hum.Vaccin.1:180-186；Evans等，2001，Vaccine 19:2080-2091；和Kenney等，N.Engl.J.Med.351:2295-2301，其内容整体通过参考并入本文)。然而，也提出了向对象给药低至每剂1μg抗原的剂量。(参见美国专利号6,372,223，其内容整体通过参考并入本文)。假设所述对象是人类并且体重为约75kg，则1μg抗原的剂量相当于13.3pg抗原/g体重的剂量。在本公开的组合物、试剂盒和方法的某些实施方式中，可以给药低一个数量级的剂量率(例如不超过约2pg抗原/g体重)，以便诱导免疫应答(例如Th1应答)。对于本文中所设想的肽疫苗来说，可以给药1飞摩尔每种肽/g体重或更低的剂量率，以便诱导免疫应答(例如Th1应答)。包含抗原溶液的疫苗通常具有不超过约1.5x 10-6g抗原/ml(优选地不超过约1.5x 10-7g抗原/ml，更优选地不超过约1.5x 10-8g抗原/ml，更优选地不超过1.5x10-9g抗原/ml，甚至更优选地不超过约1.5x 10-10g抗原/ml)的抗原浓度。在某些实施方式中，所述疫苗包含抗原浓度为至少约1.5x 10-10g抗原/ml的抗原溶液。例如，适合的浓度范围可以包括1.5x 10-10-3x10-10g抗原/ml，1.5x 10-10-6x 10-10g抗原/ml，1.5x 10-10-1.5x 10-9g抗原/ml，1.5x 10-10-3x 10-9g抗原/ml或1.5x 10-10-6x 10-9g抗原/ml。
本文中公开的疫苗可以包含肽或一组肽作为抗原。例如，所述疫苗可以包括包含5-100个氨基酸(优选为10-20个氨基酸)的肽或一组肽。通常，所述肽具有不超过约5kDa(优选地不超过约4kDa，更优选地不超过约3kDa)的分子量。在溶液中包含肽或一组肽的疫苗通常具有的每种肽的溶液浓度不超过约7.5x 10-10摩尔每种肽/ml(优选地不超过约1.5x 10-11摩尔每种肽/ml，更优选地不超过约7.5x 10-12摩尔每种肽/ml，更优选地不超过约1.5x10-12摩尔每种肽/ml，更优选地不超过约7.5x 10-13摩尔每种肽/m，甚至更优选地不超过约1.5x 10-13摩尔每种肽/ml)。在某些实施方式中，所述疫苗包含的肽溶液具有至少约1.5x10-13摩尔每种肽/ml或至少约1.5x 10-13摩尔每种肽/ml的浓度。例如，适合的浓度范围可以包括1.5x 10-13-3x 10-13摩尔每种肽/ml，1.5x 10-13-6x 10-13摩尔每种肽/ml，1.5x 10-13-1.5x 10-12摩尔每种肽/ml，1.5x 10-13-3x 10-12摩尔每种肽/ml，3x 10-13-6x 10-13摩尔每种肽/ml，3x 10-13-1.5x 10-12摩尔每种肽/ml，3x 10-13-3x 10-12摩尔每种肽/ml。
适合的抗原可以包括多肽、肽或一组多肽、肽，其包含与疾病相关的蛋白质的一个或多个表位。例如，适合的多肽、肽或一组多肽、肽可以包含与病原体相关的蛋白质的一个或多个表位。适合的多肽可以包含病原体的相应蛋白质的全长氨基酸序列或其片段。例如，适合的片段可以包括5-200个氨基酸(或5-150、5-100、5-50、5-25、5-15、10-200、10-100、10-50、10-25、10-25或10-15个氨基酸)并包括所述片段所源自的蛋白质的至少一个表位。用于所述组合物、试剂盒和方法的适合的抗原可以包括源自于病原体的蛋白质的一组肽。例如，适合的抗原可以包含一组至少2、3、4、5、10、25、50、100种或更多种不同的肽，所述肽包含来自于病原体的蛋白质的至少约10-20个氨基酸的序列。所述不同的肽抗原可以在N-端、C-端或两端与所述组合物的至少一个其他肽抗原交叠，例如交叠至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。
蛋白质、多肽或肽抗原的本质。本公开的组合物、试剂盒和方法含有和/或利用蛋白质、多肽或肽来诱导免疫应答。然而，本公开的组合物、试剂盒和方法有别于活疫苗或失活疫苗，因为所述组合物、试剂盒和方法的蛋白质、多肽或肽在体外分离、纯化、重组或合成(例如化学合成)。例如，所述组合物、试剂盒和方法含有和/或利用在宿主细胞中重组表达并分离或纯化的蛋白质、多肽或肽。在另一个实例中，所述组合物、试剂盒和方法可以含有一组化学合成(例如使用液相合成或固相合成例如Fmoc固相合成或t-boc固相合成)的多肽或肽。
当在本文中使用时，蛋白质、多肽和肽是指包含通过酰胺键连接的氨基酸残基的链的分子。术语“氨基酸残基”包括但不限于下述氨基酸残基：丙氨酸(Ala或A)，半胱氨酸(Cys或C)，天冬氨酸(Asp或D)，谷氨酸(Glu或E)，苯丙氨酸(Phe或F)，甘氨酸(Gly或G)，组氨酸(His或H)，异亮氨酸(Ile或I)，赖氨酸(Lys或K)，亮氨酸(Leu或L)，甲硫氨酸(Met或M)，天冬酰胺(Asn或N)，脯氨酸(Pro或P)，谷氨酰胺(Gln或Q)，精氨酸(Arg或R)，丝氨酸(Ser或S)，苏氨酸(Thr或T)，缬氨酸(Val或V)，色氨酸(Trp或W)和酪氨酸(Tyr或Y)残基。术语“氨基酸残基”还可以包括下列氨基酸残基：高半胱氨酸，2-氨基己二酸，N-乙基天冬酰胺，3-氨基己二酸，羟基赖氨酸，β-丙氨酸，β-氨基丙酸，别羟基赖氨酸，2-氨基丁酸，3-羟基脯氨酸，4-氨基丁酸，4-羟基脯氨酸，哌啶酸，6-氨基己酸，异锁链素，2-氨基庚酸，别异亮氨酸，2-氨基异丁酸，N-甲基甘氨酸，肌氨酸，3-氨基异丁酸，N-甲基异亮氨酸，2-氨基庚二酸，6-N-甲基赖氨酸，2,4-二氨基丁酸，N-甲基缬氨酸，锁链素，正缬氨酸，2,2-二氨基庚二酸，正亮氨酸，2,3-二氨基丙酸，鸟氨酸和N-乙基甘氨酸。
术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换指称。然而，所述术语可以如下区分。“蛋白质”通常是指细胞中转录、翻译和翻译后修饰的最终产物。因此，蛋白质通常表现出生物学功能。多肽通常是长度≥100个氨基酸的氨基酸链(Garrett&Grisham，《生物化学》(Biochemistry)，第二版，1999，Brooks/Cole，110，其整体通过参考并入本文)。本文中所设想的多肽可以包含但不限于100、101、102、103、104、105、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约210、约220、约230、约240、约250、约275、约300、约325、约350、约375、约400、约425、约450、约475、约500、约525、约550、约575、约600、约625、约650、约675、约700、约725、约750、约775、约800、约825、约850、约875、约900、约925、约950、约975、约1000、约1100、约1200、约1300、约1400、约1500、约1750、约2000、约2250、约2500个或更多的氨基酸残基。与多肽相反，肽通常是氨基酸的短聚合物，其长度通常为20个或更少的氨基酸(Garrett&Grisham，《生物化学》(Biochemistry)，第二版，1999，Brooks/Cole，110，其整体通过参考并入本文)。在某些实施方式中，本文中所设想的肽可以包含不少于约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。
本文中所设想的多肽和肽可以被进一步修饰以包含非氨基酸组成部分。修饰可以包括但不限于酰基化(例如O-酰基化(酯)、N-酰基化(酰胺)、S-酰基化(硫酯))、乙酰化(例如在蛋白质的N-端处或在赖氨酸残基处添加乙酰基)、甲酰化、脂化(例如连接硫辛酸这种C8官能团)、肉豆蔻酰基化(例如连接肉豆蔻酸这种C14饱和酸)、棕榈酰基化(例如连接棕榈酸这种C16饱和酸)、烷基化(例如在赖氨酸或精氨酸残基处添加烷基例如甲基)、异戊二烯化或异戊烯化(例如添加异戊二烯类基团例如法尼醇或香叶基香叶醇)、在C-末端处的酰胺化、糖基化(例如向天冬酰胺、羟基赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸添加糖基，产生糖蛋白)、聚唾液酸化(例如添加聚唾液酸)、糖基磷脂酰肌醇化(例如糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚形成)、羟基化、碘化(例如甲状腺激素的碘化)和磷酸化(例如添加磷酸基团，通常添加到丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸或组氨酸)。
本文中所设想的蛋白质或多肽的“片段”是指所述蛋白质或多肽的氨基酸序列的连续部分。蛋白质或多肽的片段是指所述蛋白质或多肽的小于全长的氨基酸序列(例如其中所述全长氨基酸序列在N-端、C-端或两端处被截短)。例如，蛋白质或多肽的片段可以包含所述全长蛋白质或多肽的5-200、5-150、5-100、5-50、5-25、5-15、10-200、10-150、10-100、10-50、10-25或10-15个连续氨基酸的序列，或由所述序列构成。蛋白质或多肽的“免疫原性片段”是蛋白质或多肽的通常长度为至少5或10个氨基酸的片段，其包括所述全长蛋白质或多肽的一个或多个表位(例如存在于所述全长蛋白质或多肽中的肽)。
免疫刺激剂和疫苗。本文公开的组合物可以包括作为免疫刺激剂或疫苗给药的药物组合物。通常，所述药物组合物包含有效量或浓度的免疫刺激剂和任选的抗原，用于诱导对抗疾病的保护性或治疗性免疫应答，所述疾病可以包括但不限于病原体感染、癌症或自体免疫疾病。诱导保护性或治疗性免疫应答可以包括诱导针对与所述疾病相关的蛋白质(例如与病原体、癌症或自体免疫疾病相关的蛋白质)的一个或多个表位的Th1应答。
当所述疾病涉及病原体感染时，诱导保护性应答可以包括诱导对抗所述病原体的除菌免疫力。诱导治疗性应答可以包括降低对象的病原体载量，例如通过在给药所述组合物之前和之后测量循环病原体的量所确定的。诱导治疗性应答可以包括降低所述病原体感染的至少一种症状的程度或严重性。
本公开的方法可用于通过向需要的对象给药本文中公开的药物组合物(例如作为免疫原性组合物或疫苗)来诱导对抗疾病的保护性或治疗性免疫应答，所述对象可以包括患有所述疾病或具有获得所述疾病的风险的人类或非人类。所述方法可以包括给药第一药物组合物，并且可以任选地包括给药第二药物组合物以增强或加强由所述第一药物组合物诱导的免疫原性应答。所述第一和第二药物组合物可以相同或不同。任选给药的第二药物组合物可以在给药所述第一药物组合物之前、同时或之后给药。在某些实施方式中，首先给药所述第一组合物，然后在等待至少约4、5或6周后给药所述第二组合物。所述第一组合物(和所述第二组合物)可以给药一次或多次。
本公开的组合物、试剂盒和方法可用于预防或治疗病原体感染。当在本文中使用时，“病原体”包括但不限于在宿主中引起疾病的活的微生物例如细菌、病毒和真菌。通过本文中公开的组合物、试剂盒和方法治疗或预防的适合的病原体可以包括对所述宿主中细胞介导的免疫应答(例如Th1介导的免疫应答)敏感的病原体，例如衣原体(Chlamydia)和传染性法氏囊病病毒(IBDV)。
本公开的组合物、试剂盒和方法也可用于预防或治疗对所述宿主中细胞介导的免疫应答(例如Th1介导的免疫应答)敏感的癌症或过度增殖性障碍，其可以包括但不限于腺癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤和畸胎癌，特别是肾上腺、膀胱、骨骼、骨髓、脑、乳腺、宫颈、胆囊、神经节、胃肠道、心、肾、肝、肺、肌肉、卵巢、胰腺、甲状旁腺、前列腺、皮肤、睾丸、胸腺和子宫的癌症。
本公开的组合物、试剂盒和方法也可用于预防或治疗对所述宿主中细胞介导的免疫应答(例如Th1介导的免疫应答)敏感的自体免疫疾病，其可以包括但不限于自体免疫性血液障碍(包括例如溶血性贫血、再生障碍性贫血、纯红细胞贫血和特发性血小板减少)、系统性红斑狼疮、多软骨炎、硬皮病、韦格纳肉芽肿、慢性活动性肝炎、重症肌无力、银屑病、Steven-Johnson综合征、特发性口炎性腹泻、自体免疫性炎性肠病(包括例如溃疡性结肠炎、克罗恩病和肠易激综合征)、内分泌格雷夫斯病、结节病、多发性硬化症、原发性胆汁性肝硬化、青少年糖尿病(I型糖尿病)、葡萄膜炎(前部和后部)、干燥性角膜结膜炎和春季角膜结膜炎、肺间质纤维化、银屑病性关节炎或肾小球性肾炎(伴有和不伴有肾病综合征，例如包括特发性肾病综合征或微小病变性肾病)。
本公开的组合物可以被给药以加强或增强免疫应答。当在本文中使用时，“加强”或“增强”免疫应答意味着提高所述免疫应答的量级和/或广度。例如，可以增加识别特定表位的细胞的数目(“量级”)和/或可以增加被识别的表位的数目(“广度”)。优选地，通过给药本文公开的药物组合物，可以获得T-细胞应答的5倍或更优选地10倍或更大的增强。
本公开的组合物、试剂盒和方法可用于诱导免疫应答，包括但不限于细胞免疫应答例如“Th1应答”。当在本文中使用时，Th1应答可以通过细胞因子产生例如干扰素(如IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF-β)和白介素(例如IL-2)来表征。Th1应答也可以通过巨噬细胞针对病原体的杀灭效率的提高和针对所述病原体的细胞毒性CD8+细胞的增殖来表征。Th1应答还可以通过针对所述抗原的调理性抗体的存在来表征。Th1应答可以如以前所描述的进行评估(参见Li等，Vaccine 28(2010)1598-1605，其内容整体通过参考并入本文)。
在某些实施方式中，相对于其他应答例如Th2应答，本公开的组合物、试剂盒和方法可用于优先诱导Th1应答。当在本文中使用时，Th2应答可以通过细胞因子产生例如白介素(如IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13)来表征。Th2应答也可通过B-细胞刺激和增殖以诱导B-细胞抗体类别转换和提高中和抗体产生来表征。计算机模型表明与Th2应答相比，Th1应答可能依赖于抗原剂量。(参见Bergmann等，Bulletin of Math.Biol.(2002)64,425-446；以及Bergmann等，Bulletin of Math.Biol.(2001)63,405-439，其内容整体通过参考并入本文)。
本公开的组合物、试剂盒和方法可用于预防或治疗对T-细胞介导的免疫应答(例如Th1免疫应答)敏感的病原体感染。在某些实施方式中，本公开的组合物、试剂盒和方法可用于预防或治疗衣原体物种的感染。正如在许多其他细胞内病原体的情况下那样，T-淋巴细胞在针对衣原体感染的保护性宿主应答中发挥关键作用(Morrison等，1995，Infect.Immun.63:4661-4668；Rank,2006，在《衣原体基因组学和发病机理》(ChlamydiaGenomics and Pathogenesis)中，P.M.Bavoil和B.Wyrick主编，Horizon BiosciencePress,Norfolk,U.K.)。产生IFN-γ的辅助性Th1淋巴细胞对于衣原体感染的高效和完全消除来说是不可缺少的(Perry等，1997,J.Immunol.158:3344-3352；Rottenberg等，2000,J.Immunol.164:4812-4818；Vuola等，2000,Infect.Immun.68:960-964.)，并且Th1细胞或效应物功能的消除引起衣原体疾病增加和消除衣原体的失败(Cotter等，1997，Infect.Immun.65:2145-2152；Lu等，2000,Mol.Med.6:604-612；Morrison等，1995，Infect.Immun.63:4661-4668；Wang等，1999，Eur.J.Immunol.29:3782-3792)。它们通过Th1类型的效应物细胞因子、最主要是IFN-γ来限制衣原体复制，促成DTH应答(Perry等，1997；Rottenberg等，2000)。这些保护性DTH应答通过CD4+T细胞和巨噬细胞的组织浸润和促炎性Th1细胞因子例如IL-1、IL-2、IL-12、IFN-γ或TNF-α的释放来表征。
药物组合物的配制
本文公开的药物组合物可以被配制成疫苗，用于给药到需要的对象。在考虑了诸如特定患者的年龄、性别、体重和状况以及给药途径的因素后，医学领域的技术人员可以以公知的剂量并通过公知的技术配制和/或给药这些组合物。
所述组合物可以包括药物溶液，其包含本领域中已知的载体、稀释剂、赋形剂(例如粉末赋形剂例如乳糖、蔗糖和甘露糖醇)和表面活性剂(例如非离子型表面活性剂如Kolliphor HS 15、Kollidon 12PF和Tween-20)。此外，所述组合物可以包含防腐剂(例如抗微生物剂或抗细菌剂例如苯扎氯铵)。所述组合物还可以包括缓冲剂(例如以便将所述组合物的pH维持在6.5至7.5之间)。
所述药物组合物可以预防性或治疗性给药。在预防性给药中，所述疫苗可以以足以诱导细胞免疫应答以针对感染提供保护或治疗感染的量给药。在治疗性应用中，所述疫苗以足以引发治疗效应的量(例如针对被给药的抗原的免疫应答，其治愈或至少部分阻滞或减缓疾病的症状和/或并发症(即“治疗有效量”))给药到患者。
本文公开的组合物可以通过各种不同的途径递送。典型的递送途径包括肠胃外给药(例如真皮内、肌内、腹膜内或皮下递送)。其他途径包括鼻内和肺内途径。其他途径包括口服给药、阴道内和直肠内途径。所述药物组合物的制剂可以包括液体(例如溶液和乳液)、喷雾剂和气溶胶。具体来说，所述组合物可以被配制成气溶胶或喷雾剂，用于鼻内或肺内递送。用于给药气溶胶或喷雾剂以进行鼻内或肺内递送的适合的装置可以包括吸入器和喷雾器。
本文中公开的组合物可以与包括佐剂的其他免疫、抗原性或疫苗或治疗性组合物，或与抗原相组合给药的化学或生物药剂共同给药或顺序给药，以提高所述抗原的免疫原性。其他治疗剂可以包括但不限于细胞因子例如干扰素(例如IFN-γ)和白介素(例如IL-2)。
引发-加强疫苗接种方案
当在本文中使用时，“引发-加强疫苗接种方案”是指其中向对象给药第一组合物，然后在预定时间段后(例如约2、3、4、5或6周后)向所述对象给药可能相同或不同于所述第一组合物的第二组合物的方案。所述第一组合物(和所述第二组合物)可以被给药一次或多次。所述公开的方法可以包括通过给药第一组合物至少一次而用所述第一组合物引发对象，允许经过预定时间长度(例如至少约2、3、4、5或6周)，然后通过给药相同的组合物或第二种不同的组合物进行加强。
疫苗接种的个体中免疫应答的表征
本文公开的药物组合物可以被递送到具有疾病(例如病原体感染)风险的对象或已获得所述疾病的对象(例如被病原体感染的对象)。为了评估给药的免疫原性组合物或疫苗的功效，所述免疫应答可以通过测量针对特定表位的细胞介导的应答和/或抗体的诱导来评估。T-细胞应答可以例如通过使用新鲜或培养的PBMC的四聚体染色、ELISPOT测定法或通过使用功能性细胞毒性测定法来测量，这些方法对于本领域技术人员来说是公知的。抗体应答可以通过本领域中已知的测定法例如ELISA来测量。病原体的滴度或载量可以使用本领域中的方法(包括检测病原体的核酸的方法)来测量(参见例如美国专利号7,252,937，其内容整体通过参考并入本文)。免疫应答也可以通过生理学应答来表征。(参见Li等，Vaccine 28(2010)1598-1605；和Stemke-Hale等，Vaccine 2005Apr 27；23(23):3016-25，其内容整体通过参考并入本文)。免疫应答还可以通过所述动物的病理学应答例如总重量减轻或增加(例如与病原体感染相关的重量减轻)来测量。免疫应答还可以通过病理学应答例如所述动物的器官的重量减轻或增加(例如在被羊流产衣原体(C.abortus)感染的小鼠中的肺重量增加，或被传染性法氏囊病病毒感染的鸡中法氏囊的重量减轻或增加)来测量。
实施例
下面的实施例是说明性的并且不打算限制所公开的主题内容。
术语和首字母缩略词表和实验描述
PLGA RG502H：可生物降解的聚(丙交酯-共-乙交酯)(50％:50％)共聚物。
PLGA-PEG：可生物降解的聚(丙交酯-共-乙交酯)(50％:50％)共聚物，其通过掺入5％聚乙二醇进行化学修饰(PEG化)，所述聚乙二醇具有5,000的分子量。
PLA L206S：可生物降解的聚(L-丙交酯)聚合物。
奈非那韦：奈非那韦甲磺酸盐，其是人免疫缺陷病毒的蛋白酶的抑制剂并被用作抗反转录病毒药物。奈非那韦也具有免疫刺激性和/或免疫增强活性，并且水溶性不良。
Pluronic L121：聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，其是表面活性剂和佐剂。
雷西莫特或R-848：小鼠中Toll样受体7(TLR7)的选择性配体，其是佐剂。
海藻糖二山嵛酸酯：来自于结核杆菌的索状因子的海藻糖二霉菌酸酯的合成类似物，其是佐剂。
Poly(I:C)：双链多核糖核苷酸poly(I)poly(C)，其是佐剂并诱导干扰素。
Q-VD-OPH：泛半胱天冬酶抑制剂，其不可逆地结合于活化的半胱天冬酶以阻断凋亡。Q-VD-OPH由具有N-端喹啉基和C-端二氟苯氧基甲基酮基的氨基酸缬氨酸和天冬氨酸构成。Q-VD-OPH是高度细胞可渗透的，并且在高浓度下在体外和体内无毒性。
恩利卡生(Emricasan)或IDN-6556：广谱不可逆半胱天冬酶抑制剂，其阻断凋亡。
Kolliphor HS 15：聚乙二醇-15-羟基硬脂酸酯，USP：聚乙二醇-15-羟基硬脂酸酯，Ph.Eur.：Macrogol 15羟基硬脂酸酯，其是非离子型增溶剂和乳化剂。
Kollidon 12PF：可溶性聚乙烯吡咯烷酮，具有2,000-3,000的分子量，其是增溶剂、分散剂和结晶抑制剂。
Tween-20：非离子型聚氧乙烯表面活性剂。
苯扎氯铵：在低于0.02％的浓度下在广pH范围内具有抗微生物功效的季铵化合物。
PBS：磷酸盐缓冲盐水。
IBDV：传染性法氏囊病病毒，其是双RNA病毒科的双链DNA病毒，在小鸡中引起法氏囊感染，破坏该器官中的B淋巴细胞。不存在B淋巴细胞使这些鸡不能产生抗体，并因此使它们对许多传染病具有高易感性。
C3H/HeJ：在Toll样受体4(TLR4)基因中具有产生截短(缩短)的TLR4蛋白的突变的近交小鼠株系。TLR-4结合细菌脂多糖(LPS)并在LPS暴露后触发炎性应答。由于事实上不存在LPS应答，因此C3H/HeJ小鼠产生非常低的先天性炎性应答，并且还表现出异常的适应性免疫应答。这些小鼠对包括衣原体的革兰氏阴性细菌极其敏感。在衣原体鼻内激惹感染后，它们保持约一周而没有可察觉的临床症状，但随后在接下来的两周内，由于衣原体的不受抑制的压倒性生长，大部分被激惹的小鼠死亡。用免疫刺激剂治疗可以部分替代缺少的TLR4信号转导并使这些小鼠对衣原体感染更有抗性。因此，小鼠中的免疫刺激剂实验使用这种小鼠株系来进行。
A/J：产生微弱先天性免疫应答并具有低炎性的近交小鼠株系。在用衣原体鼻内激惹后，由于衣原体生长的控制不良，该株系的天然小鼠发生严重疾病并具有高的肺部衣原体载量。相反，用衣原体免疫过的小鼠由于以前暴露到低水平感染或由于成功的疫苗接种而受到完全保护并且不发生疾病。因此，部分疫苗实验使用这种小鼠株系进行。
129S6：在先天性免疫系统的效应物臂中具有缺陷并且自然杀伤(NK)T细胞中的DAP12信号转导异常的近交小鼠株系。由于这种缺陷，天然的129S6对衣原体产生微弱的先天性免疫应答并且对羊流产衣原体(C.abortus)具有高度易感性。相反，129S6小鼠在暴露于低水平感染后或由于成功的疫苗接种而产生完全保护性的适应性免疫应答，并且在疫苗接种后受到完全保护且不发生疾病。因此，部分疫苗实验使用这种小鼠株系进行。
小鼠实验：在用于羊流产衣原体(Chlamydia abortus)感染实验的小鼠激惹中，只使用雌性小鼠，因为它们可以被维持在笼子中而没有雄性小鼠常见的严重争斗。通常，对于没有先期疫苗接种的免疫刺激剂实验来说，使用10周龄的小鼠。对于疫苗实验来说，首先对约6周龄的更年轻的小鼠进行疫苗接种或使所述小鼠接受免疫接种用低剂量鼻内羊流产衣原体(C.abortus)感染，并在4-6周后，在10-12周龄时用高剂量感染进行激惹。对于鼻内激惹来说，小鼠接受异氟烷轻度麻醉，并将20μl的108至3x108个羊流产衣原体(C.abortus)活细菌在蔗糖-磷酸盐-谷氨酸盐缓冲液中的悬液沉积在鼻孔上，小鼠从那里吸入细菌。对于免疫刺激剂实验来说，观察小鼠直至3周之后，然后将存活的小鼠安乐死。在疫苗实验中，将小鼠在激惹后10-12天之间安乐死。
在疫苗实验中，将小鼠肺称重并匀浆，提取DNA，并通过靶向衣原体物种23S rRNA基因的实时PCR确定羊流产衣原体(C.abortus)基因组的肺载量。所有小鼠实验得到Auburn大学学术动物护理和使用委员会(Auburn University Institutional Animal Care andUse Committee)(IACUC)批准。
在所有疫苗实验中，所使用的抗原是羊流产衣原体(C.abortus)疫苗候选蛋白Dnax2、GatA、GatC、Omp90A、Pbp3的20聚体肽(20-mer peptides)。这些肽具有10个氨基酸交叠并因此包含这些蛋白质的所有可能的10聚体肽。
鸡实验：在用于评估免疫刺激剂处理对天然循环感染的抗性和/或无实验性激惹感染时的身体生长的影响的鸡实验中，体重为45-50g的新鲜孵化的标准杂交肉用鸡在孵化的当天使用，并用微粒免疫刺激剂皮下注射。在3周后确定这些鸡的体重。
对于IBDV疫苗实验来说，将新鲜孵化的标准杂交肉用鸡用含有IBDV病毒的所有蛋白质的20聚体交叠肽的微粒进行免疫接种。在3周后，所述鸡接受悬浮在PBS中的病毒的鼻内激惹。在7天后将所述鸡称重并安乐死，并确定性别以及法氏囊的重量和外观。
实施例1.小鼠中的免疫刺激剂实验
在表1的参数下，测试包含可生物降解的粒子的悬液的组合物作为“免疫刺激剂”在小鼠中诱导先天性免疫应答的能力。
表1
Figure GDA0001270167420000281
正如在表1中指明的，通过将PLGA-PEG和Pluronic L121(3:2)的溶液喷雾干燥来制备平均有效直径为1-10μm的微粒。(参见图1A)。为了制备所述免疫刺激剂，将10μg所述微粒与30μg乳糖超细粉混合，并添加到20μl PBS/0.1％Kolliphor HS 15以形成悬液。将所述免疫刺激剂(20μl)鼻内给药到10周龄小鼠(C3H/HeJ株系)。作为对照，给药1xPBS。将小鼠在给药后第1、11或21天，通过鼻内给药108个羊流产衣原体(C.abortus)原质小体进行激惹。图1B、C和D中呈现的结果说明给药所述免疫刺激剂的小鼠与给药对照的小鼠相比表现出更高的存活率。这些结果证实，为了诱导先天性免疫力，可以给药含有针对羊流产衣原体(C.abortus)的抗原的免疫刺激剂。
实施例2.小鼠中的免疫刺激剂实验
在表2的参数下，测试包含可生物降解的粒子和佐剂的悬液的组合物作为“免疫刺激剂”在小鼠中诱导先天性免疫应答的能力。
表2
Figure GDA0001270167420000291
正如在表2中指明的，通过对PLGA RG502H(聚(丙交酯-共-乙交酯)(50％:50％)共聚物)和佐剂的溶液进行喷雾干燥来制备平均有效直径为0.5-10μm的微粒。微粒制剂1)包括6.5μg PLGA RG502H和3.5μg Pluronic LI21；微粒制剂2)包括9.8μg PLGA RG502H和0.2μg雷西莫特；并且微粒制剂3)包括10μg PLGA RG502H(即没有佐剂)。将微粒制剂与3倍量的乳糖超细粉混合并添加到20μl悬浮缓冲液(0.1％Kolliphor HS 15、0.001％苯扎氯铵在PBS中)，以制备免疫刺激剂。将所述免疫刺激剂(20μl)鼻内给药到10周龄小鼠(C3H/HeJ株系)。将小鼠在给药后第1天，通过鼻内给药108个羊流产衣原体(C.abortus)原质小体进行激惹。图2A和B中呈现的结果说明给药所述包含佐剂的免疫刺激剂的小鼠与给药不含佐剂的免疫刺激剂的小鼠相比，表现出更高的存活率和更低的体重减轻。这些结果证实，可以使用佐剂来增强包含所述微粒的免疫刺激剂诱导先天性免疫力的效果。
实施例3.鸡中的免疫刺激剂试验
在表3的参数下，测试包含可生物降解的粒子的悬液的组合物作为“免疫刺激剂”在鸡中诱导先天性免疫应答的能力。
表3
Figure GDA0001270167420000301
Figure GDA0001270167420000311
正如在表3中指明的，通过对PLGA-PEG和Pluronic L121(6.5:3.5)的溶液进行喷雾干燥来制备平均有效直径为1-10μm的微粒。为了制备所述免疫刺激剂组合物，将270μg所述微粒与810μg乳糖超细粉合并，并添加到200μl悬浮缓冲液(0.1％Kolliphor HS 15、0.001％苯扎氯铵在PBS中)。根据公式(BW/20)3/4＝异速生长缩放因子，通过对用于20g小鼠的10μg微粒量进行异速生长缩放，得到270μg的所述微粒，其中“BW”是以克为单位的目标动物体重。假设鸡的目标体重为1600g，则异速生长缩放因子为(1,600/20)3/4＝26.7。将用于20g小鼠的10μg微粒量乘以26.7的缩放因子，得到～270μg。
将由此配制的免疫刺激剂(200μl)在孵化当天皮下给药到标准肉用鸡。作为对照给药不含微粒的悬浮缓冲液。所述鸡未进行激惹，对给药免疫刺激剂的鸡的累计存活率进行测定并与对照进行比较。图3中呈现的结果说明给药免疫刺激剂的鸡与给药对照的鸡相比表现出更高的累计存活率。这些结果证实，为了在鸡中提高存活率，可以给药含有抗原的免疫刺激剂。
实施例4.鸡中的免疫刺激剂和生长增强试验
在表4的参数下，测试包含可生物降解的粒子的悬液的组合物在鸡中作为“免疫刺激剂”诱导先天性免疫应答和增强生长的能力。
表4
Figure GDA0001270167420000321
正如在表4中指明的，通过对PLGA-PEG和Pluronic L121(6.5:3.5)的溶液进行喷雾干燥来制备平均有效直径为1-10μm的微粒。为了制备所述免疫刺激剂组合物，将270μg所述微粒与810μg乳糖超细粉合并，并添加到200μl悬浮缓冲液(0.1％Kolliphor HS 15、0.001％苯扎氯铵在PBS中)。
将由此配制的免疫刺激剂(200μl)在孵化当天皮下给药到标准肉用鸡。作为对照给药不含微粒的悬浮缓冲液。所述鸡未进行激惹，并在给药后21天评估体重增加。图4中呈现的结果说明给药免疫刺激剂的鸡与给药对照的鸡相比表现出更高的平均体重。这些结果证实，为了在鸡中增强生长，可以给药含有抗原的免疫刺激剂。
实施例5
在表5的参数下，测试包含可生物降解的粒子的悬液的组合物在鸡中作为“免疫刺激剂”诱导先天性免疫应答和提高饲料转化率的能力。
表5
Figure GDA0001270167420000331
正如在表5中指明的，通过对PLGA-PEG和Pluronic L121(6.5:3.5)的溶液进行喷雾干燥来制备平均有效直径为1-10μm的微粒。为了制备所述免疫刺激剂组合物，将270μg所述微粒与810μg乳糖超细粉合并，并添加到200μl悬浮缓冲液(0.1％Kolliphor HS 15、0.001％苯扎氯铵在PBS中)。
将由此配制的免疫刺激剂(200μl)在孵化当天皮下给药到标准肉用鸡。作为对照给药不含微粒的悬浮缓冲液。样本量为96只雌性肉用鸡，其各自在12个8栏位鸡舍中饲养3周。所述鸡未进行激惹，并通过计算每单位体重的饲料消耗量(即每单位体重增加所需的饲料克数)来评估饲料转化率。图5中呈现的结果说明给药免疫刺激剂的鸡与给药对照的鸡相比表现出更好的饲料转化率。这些结果证实,为了提高饲料转化率，可以给药含有抗原的免疫刺激剂。
实施例6.在小鼠中使用凋亡抑制剂的免疫刺激剂试验
在表6的参数下，测试包含可生物降解的粒子和凋亡抑制剂的悬液的组合物在小鼠中作为“免疫刺激剂”诱导先天性免疫应答和提高存活率的能力。
表6
Figure GDA0001270167420000341
正如在表6中指明的，微粒从奈非那韦(8μg)与Pluronic
Figure GDA0001270167420000342
(3.6μg)的组合来制备，并添加到HBSS(200μl)以制备免疫刺激剂。添加凋亡抑制剂Q-VD-OPH(0.16μg)以测试它对免疫刺激的影响。将所述免疫刺激剂腹膜内(200μl)和鼻内(20μl)给药到在实验开始时10周龄的C3H/HeJ。然后在给药后3天时通过鼻内给药108个羊流产衣原体(C.abortus)原质小体对小鼠进行激惹。图6中呈现的结果说明给药包含凋亡抑制剂的免疫刺激剂的小鼠与给药不含凋亡抑制剂的免疫刺激剂的小鼠相比表现出更高的累计存活率。这些结果证实，可以使用凋亡抑制剂来增强包含所述微粒的免疫刺激剂诱导先天性免疫力的效果。
实施例7.小鼠中使用凋亡抑制剂和抗原的疫苗试验
在表7的参数下，测试包含可生物降解的粒子、凋亡抑制剂(Q-VD-OPH或恩利卡生)和抗原的悬液的组合物在小鼠中诱导保护性T细胞应答相比于非保护性/病原性应答的能力。
表7
Figure GDA0001270167420000351
如表7中所指明的，微粒从PLGA-PEG(6.5μg)制备并添加到Pluronic L121(3.6μg)，以形成用作载体和对照的微粒组合物(参见表7中的疫苗载体4)。通过向所述载体添加羊流产衣原体(C.abortus)肽来制备疫苗，所述肽采取在总共10μg疫苗中来自于5种保护性羊流产衣原体(C.abortus)蛋白的每种交叠的20聚体肽各0.2飞摩尔的形式(参见美国公布的申请号2012/0009220，其内容整体通过参考并入本文)(参见表7中的疫苗1)。包含凋亡抑制剂的疫苗组合物也通过添加0.2μg Q-VD-OPH(参见表7中的疫苗+凋亡抑制剂2)或0.2μg恩利卡生(参见表7中的疫苗+凋亡抑制剂3)来制备。利用活疫苗作为对照(参见表7中的活疫苗5)。将疫苗组合物和对照鼻内给药(20μl)到6周龄小鼠(株系129S6)。将所述小鼠在给药后6周时通过鼻内给药108个羊流产衣原体(C.abortus)原质小体进行激惹。图7A、B、C和D中呈现的结果说明给药含有凋亡抑制剂的疫苗的小鼠表现出与活疫苗类似的最低体重减轻和最低肺重量增加，表明所述凋亡抑制剂将T细胞应答从非保护性/病原性调节成保护性。
实施例8.鸡中使用凋亡抑制剂和抗原的疫苗试验
在表8的参数下，测试包含可生物降解的粒子、凋亡抑制剂和抗原的悬液的组合物在鸡中诱导保护性T细胞应答相比于非保护性/病原性应答的能力。
表8
Figure GDA0001270167420000361
Figure GDA0001270167420000371
正如在表8中所指明的，微粒从PLGA-PEG和Pluronic LI21(175.5μg：94.5μg)和IBDV肽的溶液制备，所述肽由来自于所有IBDV病毒蛋白的交叠的20聚体肽各0.54飞摩尔构成。以2.7、5.4或10.8μg的量包含凋亡抑制剂Q-VD-OPH。为了制备所述疫苗组合物，将所述微粒添加到200μl悬浮缓冲液。
将所述疫苗组合物和对照在孵化的当天皮下给药到标准肉用鸡。给药单独的悬浮缓冲液作为对照。在给药后3周，通过给药IBDV对所述鸡进行激惹。
在激惹后第7天分析法氏囊的重量和炎症，其中IBDV选择性靶向鸡的法氏囊中的B细胞，引起炎症和随后的萎缩。这在炎症消退后降低法氏囊的重量。炎症在1-4的量表上进行评分，并且将由炎症造成的法氏囊重量的增加通过法氏囊重量除以炎症评分进行校正。图8A、B、C、D、E、F、G和H中呈现的结果表明，在用IBDV激惹的免疫接种的鸡中，所述凋亡抑制剂将T细胞应答从非保护性/病原性调节成保护性。
实施例9.小鼠中的疫苗实验
在表9的参数下，测试包含含有奈非那韦和抗原的可生物降解的粒子的悬液的组合物在小鼠中诱导保护性T细胞应答的能力。
表9.小鼠中的疫苗实验
Figure GDA0001270167420000381
正如在表9中指明的，通过研磨奈非那韦来制备有效直径为1-20μm的微粒，所述奈非那韦是水溶性非常不良的HIV蛋白酶抑制剂并具有免疫增强效果。将磨碎的奈非那韦粒子与50μg Poly(I:C)和肽抗原共沉淀，所述肽抗原采取来自于显示出对抗感染的保护性的5种羊流产衣原体(C.abortus)蛋白的每种交叠的20聚体肽各0.1飞摩尔的形式(参见美国公布的申请号2012/0009220，其内容整体通过参考并入本文)。将共沉淀的粒子添加到200μl HBSS，以形成疫苗组合物。以疫苗接种后4周的时间间隔将所述疫苗组合物和对照(200μlHBSS)三次皮下给药在6周龄小鼠(C3H/HeJ株系)的肩膀之间。在第三次疫苗接种后4周，通过鼻内给药108个羊流产衣原体(C.abortus)原质小体对小鼠进行激惹，并评估存活小鼠的累计比例。正如在图9中指明的，疫苗接种的小鼠表现出～70％的累计存活率，而对照小鼠表现出～10％的累计存活率。
实施例10.小鼠中的疫苗实验
在表10的参数下，测试包含含有奈非那韦和抗原的可生物降解的粒子的悬液的组合物在小鼠中诱导保护性T细胞应答的能力。
Figure GDA0001270167420000391
正如在表10中指明的，通过将奈非那韦(5mg)和Pluronic
Figure GDA0001270167420000392
(0.25mg)喷雾干燥来制备有效直径为1-10μm的微粒。将所述微粒与肽抗原一起给药，所述肽抗原采取来自于显示出对抗感染的保护性的5种羊流产衣原体(C.abortus)蛋白的每种交叠的20聚体肽各1.0飞摩尔在200μl HBSS中的形式(参见美国公布的申请号2012/0009220，其内容整体通过参考并入本文)。将所述疫苗组合物和对照(200μl HBSS)皮下给药在6周龄小鼠(C3H/HeJ株系)的肩膀之间。在疫苗接种后6周，通过鼻内给药108个羊流产衣原体(C.abortus)原质小体对小鼠进行激惹，并评估存活小鼠的累计比例。正如在图10中指明的，疫苗接种的小鼠表现出～60％的累计存活率，而未处理小鼠表现出～20％的累计存活率。
实施例11.小鼠中的疫苗试验
在表11的参数下，测试包含可生物降解的粒子、共聚物佐剂和抗原的悬液的组合物在小鼠中诱导保护性T细胞应答的能力。
表11
Figure GDA0001270167420000401
通过将PLGA-PEG(6.5μg)微粒、作为共聚物佐剂的Pluronic
Figure GDA0001270167420000412
(3.5μg)、来自于对感染表现出保护性的5种羊流产衣原体(C.abortus)蛋白(参见美国公布的申请号2012/0009220，其内容整体通过参考并入本文)的每种交叠的20聚体肽各0.0、0.02、0.2或2.0飞摩尔合并在200μl悬浮缓冲液中，来制备疫苗组合物。
将所述疫苗组合物和对照(0.0飞摩尔肽和活疫苗)皮下给药在6周龄小鼠(129S6株系)的肩膀之间。在疫苗接种后6周，通过鼻内给药108个羊流产衣原体(C.abortus)原质小体对小鼠进行激惹，并评估体重减轻和肺重量增加。图11A、B、C、D、E、F和G中呈现的结果说明给药含有2.0飞摩尔肽的疫苗的小鼠表现出与活疫苗类似的最低体重增加、最低衣原体载量和最低肺重量增加，表明2.0飞摩尔肽的剂量将T细胞应答从非保护性/病原性调节成保护性。
实施例12.鸡中的疫苗试验
在表12的参数下，测试包含可生物降解的粒子、共聚物佐剂和抗原的悬液的组合物在鸡中诱导保护性T细胞应答的能力。
表12
Figure GDA0001270167420000411
Figure GDA0001270167420000421
正如表12中所指明的，微粒从PLGA-PEG和Pluronic
Figure GDA0001270167420000422
(175.5μg：94.5μg)和IBDV肽的溶液制备，所述肽由0.54、3.82、27.0或191.2飞摩尔的来自于所有IBDV病毒蛋白的交叠的20聚体肽构成。为了制备所述疫苗组合物，将所述微粒添加到200μl悬浮缓冲液。
将所述疫苗组合物和对照在孵化当天皮下给药到标准肉用鸡。在给药后3周通过给药IBDV对鸡进行激惹。在激惹后第7天分析法氏囊的重量和炎症。炎症在1-4的量表上进行评分，将由炎症引起的法氏囊重量的增加通过法氏囊重量除以炎症评分来校正。图12A、B、C和D中呈现的结果表明，在用IBDV激惹的免疫接种的鸡中，3.82-191.2飞摩尔的剂量(相比于0.54飞摩尔的剂量)将所述T细胞应答从非保护性/病原性调节成保护性。
实施例13.小鼠中的疫苗试验
在表13的参数下，测试包含可生物降解的粒子、共聚物佐剂和抗原的悬液的组合物在小鼠中诱导保护性T细胞应答的能力。
表13
Figure GDA0001270167420000431
正如在表13中所指明的，微粒从PLGA L206S(6.5μg)制备，并与来自于5种保护性羊流产衣原体(C.abortus)蛋白(参见美国公布的申请号2012/0009220，其内容整体通过参考并入本文)的每种交叠的20聚体肽各2.0飞摩尔一起添加到Pluronic L121(3.6μg)，总共10μg，以形成疫苗(参见表13中的疫苗1)。微粒也可以从PLGA-PEG(6.5μg)制备并添加到Pluronic L121(3.6μg)，以形成作为对照的载体(参见表13中的疫苗载体2)。使用活疫苗作为对照(参见表13中的活疫苗3)。将所述疫苗组合物和对照鼻内给药(20μl)到6周龄小鼠(129S6株系)。在给药后6周，通过鼻内给药108个羊流产衣原体(C.abortus)原质小体对小鼠进行激惹。图13A、B、C和D中呈现的结果说明给药含有2.0飞摩尔肽的疫苗的小鼠与激惹后当天相比表现出低的体重减轻、低的肺重量增加、低的羊流产衣原体(C.abortus)载量和低的体重减轻百分数，与活疫苗类似。
对于本领域技术人员来说，显然可以对本文中公开的发明做出各种替换和修改而不背离本发明的范围和精神。本文中说明性描述的发明在适合情况下，可以在不存在本文中没有具体公开的任一种或多种要素、一种或多种限制的情况下实践。已被使用的术语和表述被用作说明而非限制性的术语，并且不打算在这些术语和表述的使用中排除所示出和描述的特征的任何等同物或其部分，但是应该认识到在本发明的范围内的各种不同修改都是可能的。因此，应该理解，尽管本发明已通过特定实施方式和任选的特征进行说明，但本领域技术人员可以对本文中公开的概念做出修改和/或改变，并且这些修改和改变被认为是在本发明的范围之内。
在本文中对大量专利和非专利参考文献进行了引用。被引用的参考文献整体通过参考并入本文。在本说明书中术语的定义与引用的参考文献中所述术语的定义存在不一致性的情况下，所述术语应该根据本说明书中的定义来解释。

Claims (15)

1.包含可生物降解的粒子的组合物在制备用于在需要的动物中提高饲料转化率或生长增强的药物中的应用，所述可生物降解的粒子包含包括聚丙交酯(PLA)的聚合物或共聚物并且具有0.5-5μm的平均有效直径。
2.权利要求1的应用，其中所述可生物降解的粒子具有0.5-3μm的平均有效直径。
3.权利要求1的应用，其中所述动物是家禽。
4.权利要求3的应用，其中所述家禽是鸡。
5.权利要求1的应用，其中所述聚合物或共聚物还包括聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)。
6.权利要求1的应用，其中通过对由(i)所述聚合物或共聚物和(ii)表面活性剂构成的混合物进行喷雾干燥来制备可所述生物降解的粒子。
7.权利要求6的应用，其中所述表面活性剂是共聚物佐剂。
8.包含可生物降解的粒子的组合物在制备用于在需要的鸡孵化中提高饲料转化率或生长增强的药物中的应用，所述可生物降解的粒子包含包括聚丙交酯(PLA)的聚合物或共聚物并且具有0.5-5μm的平均有效直径。
9.权利要求8的应用，其中所述聚合物或共聚物还包括聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)。
10.权利要求8的应用，其中通过对由(i)所述聚合物或共聚物和(ii)表面活性剂构成的混合物进行喷雾干燥来制备可所述生物降解的粒子。
11.权利要求10的应用，其中所述表面活性剂是共聚物佐剂。
12.包含可生物降解的粒子的组合物在制备用于在需要的猪中提高饲料转化率或生长增强的药物中的应用，所述可生物降解的粒子包含包括聚丙交酯(PLA)的聚合物或共聚物并且具有0.5-5μm的平均有效直径。
13.权利要求12的应用，其中通过对由(i)所述聚合物或共聚物和(ii)表面活性剂构成的混合物进行喷雾干燥来制备可所述生物降解的粒子。
14.权利要求12的应用，其中所述表面活性剂是共聚物佐剂。
15.前述权利要求任一项的应用，其中所述聚合物或共聚物是PLGA-PEG，所述PLGA-PEG是可生物降解的聚(丙交酯-共-乙交酯)(50％:50％)共聚物，其通过掺入5％聚乙二醇进行化学修饰，所述聚乙二醇具有5,000的分子量。
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