CN106220796B - 一种用于生物蛋白分离的磁性微球的辐射法制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种用于生物蛋白分离的磁性微球的辐射法制备方法。该方法包括以下步骤：a、将磁性微球置于gamma射线辐射场中辐照；b、将辐照后的磁性微球加入到质量浓度为5～50%羟基丙烯酸酯水溶液或质量浓度为5～50%N‑取代丙烯酰胺基磺酸的水溶液中进行接枝反应；c、收集表面改性磁性微球；d、将表面改性磁性微球分散到乳液中，得到分散体系；乳液是由基于乳液总质量计为1～31%的丙烯酸酯、0.01～5%的丙烯酸二醇酯类化合物、0.05～1%的表面活性剂和63～99%的水组成；e、将分散体系置于gamma射线辐射场中辐照。本发明制备的磁性微球能用于生物蛋白的分离，能减少或避免蛋白质的非特异性吸附。

Description

一种用于生物蛋白分离的磁性微球的辐射法制备方法
技术领域
本发明属于生物蛋白分离的技术领域，具体涉及一种用于生物蛋白分离的磁性微球的gamma辐射法制备方法。
背景技术
磁性纳米粒子不仅具有磁性材料的特性，还具有纳米材料特有的尺寸效应、表面效应、体积效应及一些生物学特性。磁性纳米粒子具有磁响应性及超顺磁性，可以在恒定磁场下聚集和定位、在交变磁场下吸收电磁波产生热，还可以通过表面改性而带有多种活性官能团 ( 如 -OH、-COOH、-NH3 等 )，在生物医药领域、水处理领域、功能材料领域等都有广阔的应用前景。
在生物医药领域，磁性微球（例如Fe3O4)可以用于生物蛋白分离、药物运载、细胞分离等。在生物蛋白的结构和性能研究以及开发、制备方面，生物蛋白的结构分析是基础。目前，生物蛋白的分析方法有很多，但与数据库联用的基质辅助的激光解吸/离子化质谱（MALDI-TOF MS）用以标记多肽图谱是近年来最常用一种方法，也是最有效的一种方法。但这种方法还有不足之处。尽管时间质谱对于微量的蛋白质或者多肽具有很灵敏的响应，但是这并不能满足实际分析测试的要求，因为这些蛋白质/多肽浓度很低，相对来说背景噪音很强，其质谱信号容易受到外界干扰，样品中痕量的污染也会造成很大的误差。造成背景噪音过强的原因是磁性微球被用来与标靶蛋白质结合并实现其与主体溶液的分离时，磁性微球对蛋白质的非特异性吸附。目前通用的阻止蛋白对磁性微球的非特异性吸附的方法，是对磁性微球进行改性，来提高磁性微球对标靶蛋白质结合的选择性，从而提高被分离的标靶蛋白质的纯度。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于生物蛋白分离的磁性微球的gamma射线辐射法制备方法，通过该技术制备的磁性微球能够用于生物蛋白的分离，并能够显著减少或者避免蛋白质的非特异性吸附。
本发明的目的可通过下述技术措施来实现：
本发明的用于生物蛋白分离的磁性微球的辐射法制备方法包括以下步骤：
a、将磁性微球置于gamma射线辐射场中辐照；
b、将辐照后的磁性微球加入到质量浓度为5～50%羟基丙烯酸酯水溶液或质量浓度为5～50%N-取代丙烯酰胺基磺酸的水溶液中进行接枝反应；
c、收集表面改性磁性微球；
d、将表面改性磁性微球分散到乳液中，得到分散体系；所述乳液是由基于乳液总质量计为1～31%的丙烯酸酯、0.01～5%的丙烯酸二醇酯类化合物、0.05～1%的表面活性剂和63～98.9%的水组成；
e、将分散体系置于gamma射线辐射场中进行辐照，得到表面活化磁性微球。
本发明的步骤a中所述磁性微球的粒径为0.1～10μm；步骤a中所述gamma射线辐射场辐照的吸收剂量是10～1000kGy；在gamma射线作用下，磁性微球表面形成的电子、空穴和缺陷具有较高的活性和稳定性，能够引发不饱和单体在其表面进行接枝聚合。
本发明的步骤b中所述羟基丙烯酸酯取自丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丁酯或甲基丙烯酸羟丁酯中的任意一种或两种以上；步骤b中所述N-取代丙烯酰胺基磺酸取自2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸及其钠盐、丙烯酰胺基十四烷基磺酸及其钠盐中的一种或两种以上。
本发明的步骤b中所述接枝反应的温度控制在30～90℃之间；通过辐射后的接枝反应，可以使磁性微球表面带上活性基团。接枝单体种类不同，被接枝上的活性基团也就不同。通过接枝羟基丙烯酸酯可以使磁性微球表面带上羟基，通过接枝N-取代丙烯酰胺基磺酸及其钠盐可以使磁性微球表面带上磺酸基。如果同时接枝两种或多种不同类型的单体，就可以使磁性微球表面同时带有不同类型的活性基团。
本发明的步骤c中所述收集表面改性磁性微球的步骤是先固液分离，后洗涤；其中，所述固液分离采用磁分离或离心分离，所述洗涤是用水洗涤数次。
本发明的步骤d中所述丙烯酸酯取自丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸乙酯、丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸丙酯、甲基丙烯酸丙酯、丙烯酸羟丙酯、甲基丙烯酸羟丙酯、丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸正丁酯或甲基丙烯酸羟丁酯中的任意一种或多种；所述丙烯酸二醇酯取自乙二醇二丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、1,3-丙二醇丙烯酸酯、1,3-丙二醇甲基丙烯酸酯、1,3-丁二醇丙烯酸酯、1,3-丁二醇甲基丙烯酸酯中的一种或两种以上；所述表面活性剂取自脂肪醇醚硫酸钠-AES、十二烷基磺酸钠、十六烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠或十二烷基苯磺酸钠中的一种或两种以上；步骤d中所述分散体系中表面活化磁性微球的浓度为5～200g/L。
本发明的步骤e所述辐照的吸收剂量是10～200kGy；通过辐射接枝，磁性微球表面形成聚丙烯酸酯层，所述聚丙烯酸酯类壳层厚度为5～200nm。
本发明的所述表面活化磁性微球的评价按免疫球蛋白(IgG)在磁性微球上的吸附容量大小来表征；利用免疫球蛋白(IgG)作为模型，表面活化磁性微球的静态吸附容量达到300mg/g以上。
本发明的有益效果如下：
本发明所提供的用于生物蛋白分离的磁性微球的gamma射线辐射法制备方法，不管是预辐射改性或是辐射接枝，都不使用化学引发剂，因而没有化学引发剂的残基，相应地提高了对生物蛋白结合的选择性，有利于得到高纯度的生物蛋白。用所述的方法制备的磁性微球，特征在于，利用免疫球蛋白(IgG)作为模型，微球的静态吸附容量可以达到300mg/g以上。
具体实施方式
本发明以下将结合实施例作进一步描述：
实施例1
1）预辐射法制备磁性微球基体
选取平均粒径为0.2μm的Fe3O4磁性微球，装入玻璃瓶中，密封后放入gamma射线辐射场中进行辐照，吸收剂量200kGy。然后，将20g磁性微球加入到1000mL质量浓度为15%的2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸水溶液中，在机械搅拌下45℃保温反应4小时。离心分离，取下层磁性微球进行减压过滤，用纯化水冲洗，直至无磺酸基团检出。得到表面带有磺酸基活性基团的磁性微球。
2）乳液配制
乳液配方见表1中实施例1配方。
按配方加入组分，搅拌均匀，并借助于超声处理，形成乳液。
3）配制分散体系
将步骤1）所制备的磁性微球基体加入到步骤2）所配制的乳液中，其中磁性微球基体的浓度达到25mg/mL。为便于分散，借助于超声处理。最终得到磁性微球基体均匀分散的体系。
4）辐射乳液聚合
将步骤3）所配制的分散体系置于gamma射线辐射场中辐照，吸收剂量50kGy。用磁铁分离，除去上层清夜，固体用乙醇清洗3次，用水清洗6次，得到表面活化磁性微球。
5）免疫球蛋白(IgG)作为模型，检测磁性微球对蛋白的静态吸附容量
称取0.05g磁性微球，加入到10mL的浓度为2.0mg/mL的IgG溶液（用0.1mol/L醋酸缓冲液配制）中，密封，25℃恒温水浴摇床200r/min吸附120min。用磁铁收集磁性微球，进行固液分离。取上层清液，用紫外分光光度计分析清液中IgG浓度。
对IgG的吸附容量按式（1）计算：
式（1）
式中q是蛋白质吸附密度（mg/g)，c 0是初始蛋白液浓度（mg/mL)，c平衡后蛋白液浓度（mg/mL)，V是蛋白液体积（mL），W是微球的质量（g）。
根据测定值计算磁性微球对IgG的吸附容量为427mg/g。
表1 乳液配方
实施例2
1）预辐射法制备磁性微球基体
选取平均粒径为3.2μm的Fe3O4磁性微球，装入玻璃瓶中，密封后放入gamma射线辐射场中进行辐照，吸收剂量500kGy。然后，将20g磁性微球加入到200mL含9%的2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸和5%的甲基丙烯酸羟乙酯的水溶液中，在机械搅拌下60℃保温反应2.5小时。离心分离，取下层磁性微球进行减压过滤，用纯化水冲洗，直至无磺酸基团检出。得到表面带有磺酸基和羟基活性基团的磁性微球。
2）乳液配制
乳液配方见表1中实施例2配方。
按配方加入组分，搅拌均匀，并借助于超声处理，形成乳液。
3）配制分散体系
将步骤1）所制备的磁性微球基体加入到步骤2）所配制的乳液中，其中磁性微球基体的浓度达到25mg/mL。为便于分散，借助于超声处理。最终得到磁性微球基体均匀分散的体系。
4）辐射乳液聚合
将步骤3）所配制的分散体系置于gamma射线辐射场中辐照，吸收剂量150kGy。用磁铁分离，除去上层清夜，固体用乙醇清洗3次，用水清洗6次，得到表面活化磁性微球。
5）免疫球蛋白(IgG)作为模型，检测磁性微球对蛋白的静态吸附容量
称取0.05g磁性微球，加入到10mL的浓度为3.0mg/mL的IgG溶液（用0.1mol/L醋酸缓冲液配制）中，密封，25℃恒温水浴摇床200r/min吸附120min。用磁铁收集磁性微球，进行固液分离。取上层清液，用紫外分光光度计分析清液中IgG浓度。
根据测定值，按式（1）计算对IgG的吸附容量为331mg/g。
实施例3
1）预辐射法制备磁性微球基体
选取平均粒径为8.5μm的Fe3O4磁性微球，装入玻璃瓶中，密封后放入gamma射线辐射场中进行辐照，吸收剂量700kGy。然后，将20g磁性微球加入到500mL含11%甲基丙烯酸羟乙酯和4%丙烯酰胺基十四烷基磺酸的水溶液中，在机械搅拌下70℃保温反应1.5小时。磁铁分离，取下层磁性微球进行减压过滤，用500mL纯化水分多次冲洗。得到表面带有羟基活性基团的磁性微球。
2）乳液配制
乳液配方见表1中实施例3配方。
按配方加入组分，搅拌均匀，并借助于超声处理，形成乳液。
3）配制分散体系
将步骤1）所制备的磁性微球基体加入到步骤2）所配制的乳液中，其中磁性微球基体的浓度达到25mg/mL。为便于分散，借助于超声处理。最终得到磁性微球基体均匀分散的体系。
4）辐射乳液聚合
将步骤3）所配制的分散体系置于gamma射线辐射场中辐照，吸收剂量75kGy。用磁铁分离，除去上层清夜，固体用乙醇清洗3次，用水清洗6次，得到表面活化磁性微球。
5）免疫球蛋白(IgG)作为模型，检测磁性微球对蛋白的静态吸附容量
称取0.05g磁性微球，加入到10mL的浓度为3.0mg/mL的IgG溶液（用0.1mol/L醋酸缓冲液配制）中，密封，25℃恒温水浴摇床200r/min吸附60min。用磁铁收集磁性微球，进行固液分离。取上层清液，用紫外分光光度计分析清液中IgG浓度。
根据测定值，按式（1）计算对IgG的吸附容量为308mg/g。

Claims (10)

1.一种用于生物蛋白分离的磁性微球的辐射法制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
a、将磁性微球置于gamma射线辐射场中辐照；
b、将辐照后的磁性微球加入到质量浓度为5～50%羟基丙烯酸酯水溶液或质量浓度为5～50%N-取代丙烯酰胺基磺酸的水溶液中进行接枝反应；
c、收集表面改性磁性微球；
d、将表面改性磁性微球分散到乳液中，得到分散体系；所述乳液是由基于乳液总质量计为1～31%的丙烯酸酯、0.01～5%的丙烯酸二醇酯、0.05～1%的表面活性剂和63～98.9%的水组成；
e、将分散体系置于gamma射线辐射场中进行辐照，得到表面活化磁性微球。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤a中所述磁性微球的粒径为0.1～10μm；步骤a中所述gamma射线辐射场辐照的吸收剂量是10～1000kGy。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤b中所述羟基丙烯酸酯取自丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丁酯或甲基丙烯酸羟丁酯中的任意一种或两种以上；步骤b中所述N-取代丙烯酰胺基磺酸取自2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸及其钠盐、丙烯酰胺基十四烷基磺酸及其钠盐中的一种或两种以上。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤b中所述接枝反应的温度控制在30～90℃之间。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤c中所述收集表面改性磁性微球的步骤是先固液分离，后洗涤；其中，所述固液分离采用磁分离或离心分离，所述洗涤是用水洗涤数次。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤d中所述丙烯酸酯取自丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸乙酯、丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸丙酯、甲基丙烯酸丙酯、丙烯酸羟丙酯、甲基丙烯酸羟丙酯、丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸正丁酯或甲基丙烯酸羟丁酯中的任意一种或多种；所述丙烯酸二醇酯取自乙二醇二丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、1,3-丙二醇丙烯酸酯、1,3-丙二醇甲基丙烯酸酯、1,3-丁二醇丙烯酸酯、1,3-丁二醇甲基丙烯酸酯中的一种或两种以上；所述表面活性剂取自脂肪醇醚硫酸钠-AES、十二烷基磺酸钠、十六烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠或十二烷基苯磺酸钠中的一种或两种以上；步骤d中所述分散体系中表面活化磁性微球的浓度为5～200g/L。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤e所述辐照的吸收剂量是10～200kGy。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：通过辐射接枝后，磁性微球表面形成聚丙烯酸酯层，所述聚丙烯酸酯类壳层厚度为5～200nm。
9.根据权利要求1所述的制备方法，特征在于：所述表面活化磁性微球的评价按免疫球蛋白在磁性微球上的吸附容量大小来表征。
10.根据权利要求1所述的制备方法，特征在于：所述表面活化磁性微球的静态吸附容量达到300mg/g以上。
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