CN106198955B

CN106198955B - 一种可扩宽免疫检测范围的生物芯片

Info

Publication number: CN106198955B
Application number: CN201510220789.6A
Authority: CN
Inventors: 高云华; 霍卫松; 石西增
Original assignee: Dongguan Bozhi Biological Technology Co ltd; Technical Institute of Physics and Chemistry of CAS
Current assignee: Shenzhen Boshi Diagnostic Technology Co., Ltd; Technical Institute of Physics and Chemistry of CAS
Priority date: 2015-05-04
Filing date: 2015-05-04
Publication date: 2020-08-04
Anticipated expiration: 2035-05-04
Also published as: CN106198955A

Abstract

本发明公开一种可扩宽免疫检测范围的生物芯片，包括两个或两个以上可区分的检测区域，其中所述检测区域可以固定抗体I和抗体II，抗体I和抗体II结合同一抗原。本发明的芯片操作简便、灵敏性高且检测范围宽，可以有效扩宽样品的免疫检测范围，改进检测精密度。

Description

一种可扩宽免疫检测范围的生物芯片

技术领域

本发明涉及体外免疫分析技术领域，具体地涉及了一种可扩宽检测范围生物芯片。

背景技术

固相免疫是免疫分析过程中普遍采用的技术，是一种基于免疫反应为基础的检测技术，其具有高效灵敏的特点。在固相免疫分析中，固相材料既作为免疫试剂的载体，又作为免疫反应的场所。生物芯片是基于固相免疫技术的检测方法，免疫反应在固相表面上发生，往往受到表面空间位阻以及抗原抗体本身性质的限制，导致检测范围比较窄，检测精密度不高，难以满足实际应用的需要，因而需要扩宽固相免疫的检测范围以满足样品检测的需求。

根据目前专利资料，用于扩宽检测范围主要是两种方法：

其中之一为专利CN101201353B中的方法，在同一反应体系中的两种可相互区分的固相载体上，分别通过双抗夹心法和免疫竞争法测定样品浓度；双抗夹心法测定处于双抗夹心法线性范围内的样品浓度，免疫竞争法测定处于双抗夹心法的线性范围以外的样品浓度。但是这种方法操作步骤多，且由于有些抗原分子，肽链较短，易于降解，难以维持在固相载体上的长期稳定性，限制该方法的应用。

另外一篇为专利CN103293299A中的方法，当校准品或者样本中的待测抗原浓度过高，或者检测信号超过仪器的检测上限时，使用未标记的示踪抗体稀释已标记的示踪抗体来进行检测分析。但是该种方法的缺点是，需要先通过一步检测确定样本中的抗原浓度是否过高，然后才能采用该方法。如果不事先进行判断，那么采用该种方法会导致低抗原浓度检测的不准确性。事先判断会增加一次重复测定，操作复杂。

因此，需要提供一种操作简便、准确度高、灵敏性高且检测范围宽的免疫检测方法，用于生物芯片。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种操作简便、灵敏性高且检测范围宽的检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用下述技术方案：

一种可扩宽检测范围的生物芯片，包括两个或两个以上可区分的检测区域，其中所述检测区域可以固定抗体I和抗体II，抗体Ⅰ和抗体Ⅱ结合同一抗原。

所述两个或以上检测区域面积可以相同或不同，优选地，所述两个或以上检测区域面积相同。

优选地，抗体Ⅰ和抗体Ⅱ可结合所述抗原的不同表位或相同表位；优选地，所述抗体Ⅰ和抗体Ⅱ对抗原的亲和力的比为1000:1～1:1000。

所述检测区域载体的材料为单晶硅、玻璃、聚苯乙烯、金膜、硝化纤维、氟化聚乙烯、聚阳离子树脂、亲水性聚合物薄膜、多孔材料、树脂或硝化纤维树脂。

本发明所述的抗原是指具有免疫原性的物质，如蛋白质和多肽，代表性的抗原包括(但不限于)：细胞因子、肿瘤标志物、金属蛋白、非肿瘤疾病标志物或微生物表达的蛋白等。

所述生物芯片的基体具有上样孔、微通道、废液区和排气孔，所述检测区域位于微通道内(图3)。

所述微孔通道的高度为20-200μm，长度为3～5cm。

上述生物芯片的基体仅是众多设计中的一种，基于本发明的原理，生物芯片基体可以做成不同的形状和构造。

每个抗原具有一个或多个表位，其可被抗体结合，由于抗体上与抗原表位结合位点序列的差异，导致不同的抗体对于相同抗原表位的亲和力不同，即对相同抗原的亲和力不同。同理针对不同抗原表位的抗体与抗原的亲和力可以相同也可以不同。当抗原表位与抗体结合的亲和力大时，即亲和速率常数大时，抗原与抗体结合快速，短时间内可达到饱和，相反当抗原表位与抗体结合的亲和力小时，即亲和速率常数小，抗原与抗体结合慢，到达结合饱和的程度需要更多的时间。因此相同反应时间内，两种抗体可检测的抗原浓度范围就有所差异。根据抗原抗体结合亲和力(或亲和速率常数)差异的特点，可以在生物芯片固定载体的不同区域上分别固定亲和力强(亲和速率常数大)的抗体和亲和力弱(亲和速率常数小)的抗体。当用所述芯片进行待测样本检测时，可用带有标记的抗体Ⅲ进行检测，反应原理如图1所示。

优选地所述抗体Ⅲ的标记物为磁珠、化学发光、电化学发光、酶、荧光、胶体金或胶体银，更优选地，抗体Ⅲ的标记物为磁珠。

优选地，所述抗体Ⅲ为冻干形式，储存于上样孔中。

本发明的要解决的第二个技术问题是提供一种利用所述扩宽免疫检测范围的生物芯片检测待测样本。

为解决第二个技术问题，本发明采用下述技术方案：

利用可扩宽检测范围的芯片检测待测样本的方法，包括如下步骤：

1)将待测样本加入到芯片基体的进样孔，溶解标记抗体III干粉；

2)待测样本与标记抗体III，流入到反应区，进行反应；

3)加入清洗液，去除未反应的待测样本与标记抗体III；

4)检测固定在芯片表面的标记抗体上的标记信号并计算抗原的浓度。

优选地，步骤2)反应的时间为10～20min；步骤3)中清洗液冲洗时间为1min。

在相同免疫测试过程中，相等反应时间内，与抗原亲和力不同的两种抗体结合抗原的程度是不同的，抗体Ⅰ和抗体Ⅱ结合抗原后，通过抗体Ⅲ检测抗体Ⅰ和抗体Ⅱ结合的抗原数量，根据检测信号得到两条检测浓度范围不同的标准曲线。把两个标准曲线通过双标准曲线算法“拼接”在一起进行综合分析，那么就可以有效地扩宽了抗原的检测范围，该计算方法为双标准曲线算法。对于“拼接”的相交区域内浓度，检测的精密度相比单一范围精密度也会有很大程度的提高，如图2所示。

抗原浓度的具体计算方法如下：

亲和速率常数大的抗体I的标准曲线为A，检测抗原浓度范围是从a(x1)到a(x2)，对应的信号强度是从a(y1)到a(y2)。抗原浓度与信号强度的拟合公式为Y＝M×X+N，Y为信号强度，X为抗原浓度，M和N为系数，其由抗体与抗原的亲和力决定。该拟合公式也可以为其他单调函数。

亲和速率常数小的抗体II的标准曲线为B，检测抗原浓度范围是从b(x1)到b(x2)，对应的信号强度是从b(y1)到b(y2)。抗原浓度与信号强度的拟合公式为Y＝P×X+Q，Y为信号强度，X为抗原浓度，P和Q为系数，其由抗体与抗原的亲和力决定。该拟合公式也可以为其他单调函数。

对于标准曲线A，当抗原浓度为b(x1)的时候，对应的信号强度为a(y3)；而对于标准曲线B，当抗原浓度为a(x2)的时候，对应的信号强度为b(y3)。

对于某一样本检测，抗体I检测数值为a，而抗体II检测数值为b。

如果b小于b(y1)，a小于a(y1)，那么样本浓度小于a(x1)；

如果b小于b(y1)，a大于等于a(y1)，而小于等于a(y2)，那么样本浓度通过抗体I的标准曲线(Y＝M×X+N)反向推到计算；

如果a大于a(y2)，b大于b(y2)，那么样本浓度大于b(x2)；

如果a大于a(y2)，b大于等于b(y1)，而小于等于b(y2)，那么样本浓度通过抗体II的标准曲线(Y＝P×X+Q)反向推到计算。

如果a大于等于a(y3)，而小于等于a(y2)，b大于等于b(y1)，而小于等于b(y3)，那么样本浓度为一个平均值，即对于a采用抗体I的标准曲线(Y＝M×X+N)反向推到计算浓度结果和对于b采用抗体II的标准曲线(Y＝P×X+Q)反向推到计算浓度结果的平均结果。

其他的结果如未包含在上述算法当中都为异常测试，为测试范围之外。

本发明的有益效果如下：

本发明的芯片操作简便、灵敏性高且检测范围宽，可以有效扩宽样品的检测范围，改进检测范围和精密度。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出生物芯片上双标准曲线夹心免疫原理图；

图2示出双标准曲线算法示意图；

图3示出生物芯片的构造示意图；

图4示出抗体I的标准曲线(A)，抗体II的标准曲线(B)，双标准曲线(C)；

图5示出磁敏免疫生物芯片与Roche Cobas e411检测人血浆中N端脑钠肽前体(NT-proBNP)浓度的对比。采用单一抗体I标准曲线检测对比结果(A)，采用单一抗体II标准曲线检测对比结果(B)和采用双标准曲线法检测对比结果(C)。

300生物芯片基体；310生物芯片；320亲和力强的抗体I固定区；330亲和力弱的抗体II固定区；340上样孔；350废液区；360排气孔。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1：磁敏NT-proBNP生物芯片的制备

实验材料

NT-proBNP捕获抗体I(亲和速率约为5×10⁹M^-1)

NT-proBNP捕获抗体II(亲和速率约为5×10⁸M^-1)

磁颗粒标记抗体NT-proBNP抗体III(可以同时与捕获抗体I和捕获抗体II配对)

常规试剂为市售品

(1)生物芯片表功能化

利用氧等离子体处理单晶硅芯片表面10分钟，之后将其浸入到含2-10％乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中并置于37℃震荡器中反应0.5-2h，然后用无水乙醇洗涤5次，最后用氮气吹干，此时芯片的表面已经被氨基化，即制得氨基生物芯片。

(2)固定载体的连接

将氨基硅片浸泡在含有5％戊二醛的磷酸盐缓冲液中，室温反应1h，然后用磷酸盐缓冲液清洗干净后，然后将NT-proBNP两种捕获抗体I和II(50μg/mL)采用微量点样仪，点滴到-氨基芯片表面的不同传感器区域，置于4℃过夜，然后利用5％的牛血清白蛋白溶液封闭氨基芯片，制成完全封闭的氨基生物芯片。

(3)生物芯片组装

将生物芯片组装于带有微流体的基体中，磁颗粒标记的NT-proBNP抗体冻干与基体中，如图3所示。

实施例2：NT-proBNP检测范围的确定

将NT-proBNP抗原配制成0pg/mL、15pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、5000pg/mL、10000pg/mL以及40000ng/mL的抗原标准品系列，分别测量不同的标准品，得到相应的磁信号强度(即磁致电阻率变化值)，并根据抗原浓度和磁信号强度分别拟合出抗体I和抗体II的标准曲线A和B，如图4A和4B所示。NT-proBNP抗原浓度-磁致电阻变化率的公式分别为：标准曲线A，y＝0.0263(x^0.595)；标准曲线B，y＝0.0103(x^0.590)。并且把两种标准曲线绘制在一起，如图4C所示。

单独抗体I检测NT-proBNP，检测范围是15pg/ml到5000pg/ml(磁阻信号范围是0.14-4.10)。而单独抗体II检测NT-proBNP，检测范围是100pg/ml到40000pg/ml(磁阻信号范围是0.16-5.00)。

采用双标准曲线的方法，可以让检测范围达到15pg/ml到40000pg/ml，相比单一标准曲线的方法，检测范围提升了一个数量级。

实施例3：实际NT-proBNP样本的测定

将Roche Cobas e411已经确定浓度的53例实际人NT-proBNP血浆样本作为检测样本，采用磁敏NT-proBNP生物芯片进行检测，并且通过实施例4中的两条标准曲线分别计算出检测浓度。选取浓度范围为100pg/ml到5000pg/ml，双曲线相交区域内的34例样本进行分析。对比磁敏免疫芯片Roche Cobas e411检测人血浆中NT-proBNP浓度的一致性，如图5所示。

方法学对比结果显示，采用单一标准A和B，相关系数r分别为0.980和0.982。但是采用双标准曲线法，相关系数r为0.991.NT-proBNP检测的精密度有很大的提高。磁敏生物芯片的检测性能有很大的提升。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims

1.一种非诊断目的的利用可扩宽免疫检测范围的生物芯片检测待检样本的方法，其特征在于：所述生物芯片包括两个可区分的检测区域，其中所述检测区域可以固定抗体I和抗体II，抗体Ⅰ和抗体Ⅱ结合同一抗原；

具体检测方法包括：

2)待测样本与标记抗体III，流入到检测区域，进行反应；

3)加入清洗液，去除未反应的待测样本与标记抗体III；

4)检测固定在芯片表面的标记抗体III上的标记信号并计算抗原的浓度；

抗原浓度的具体计算方法如下：

亲和速率常数大的抗体I的标准曲线为A，检测抗原浓度范围是从a(x1)到a(x2)，对应的信号强度是从a(y1)到a(y2)；抗原浓度与信号强度的拟合公式为Y＝M×X+N，Y为信号强度，X为抗原浓度，M和N为系数，其由抗体与抗原的亲和力决定；

亲和速率常数小的抗体II的标准曲线为B，检测抗原浓度范围是从b(x1)到b(x2)，对应的信号强度是从b(y1)到b(y2)；抗原浓度与信号强度的拟合公式为Y＝P×X+Q，Y为信号强度，X为抗原浓度，P和Q为系数，其由抗体与抗原的亲和力决定；

对于标准曲线A，当抗原浓度为b(x1)的时候，对应的信号强度为a(y3)；而对于标准曲线B，当抗原浓度为a(x2)的时候，对应的信号强度为b(y3)；

对于某一样本检测，抗体I检测数值为a，而抗体II检测数值为b：

如果b小于b(y1)，a小于a(y1)，那么样本浓度小于a(x1)；

如果b小于b(y1)，a大于等于a(y1)，而小于等于a(y2)，那么样本浓度通过抗体I的标准曲线Y＝M×X+N反向推到计算；

如果a大于a(y2)，b大于b(y2)，那么样本浓度大于b(x2)；

如果a大于a(y2)，b大于等于b(y1)，而小于等于b(y2)，那么样本浓度通过抗体II的标准曲线Y＝P×X+Q反向推到计算；

如果a大于等于a(y3)，而小于等于a(y2)，b大于等于b(y1)，而小于等于b(y3)，那么样本浓度为一个平均值，即对于a采用抗体I的标准曲线Y＝M×X+N反向推到计算浓度结果和对于b采用抗体II的标准曲线Y＝P×X+Q反向推到计算浓度结果的平均结果。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：抗体Ⅰ和抗体Ⅱ可结合所述抗原的不同表位。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：抗体Ⅰ和抗体Ⅱ可结合所述抗原的相同表位。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述抗体Ⅰ和抗体Ⅱ对抗原的亲和力的比从1000：1到1：1000。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：生物芯片的检测方法为光学检测方法、电学检测方法、磁电学检测方法或力学检测方法。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述检测区域的材料为单晶硅、玻璃、金膜、硝化纤维、亲水性聚合物薄膜、多孔材料或树脂。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述树脂为聚苯乙烯、氟化聚乙烯、聚阳离子树脂或硝化纤维树脂。