CN106176695B - 白藜芦醇在糖尿病条件下医用钛合金内植物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了白藜芦醇在糖尿病条件下医用钛合金内植物中的应用。本发明通过建立医用钛合金表面成骨细胞培养体系，证明了白藜芦醇的以下关键治疗作用：提高了糖尿病中“钛‑骨”界面成骨细胞细胞活力；增强了成骨细胞的成骨分化效能；改善了成骨细胞在材料表面粘附状态；增强了成骨细胞抗糖尿病环境造成的氧化应激损伤的能力；减少了成骨细胞的病理性凋亡。另外，白藜芦醇提升了糖尿病动物体内钛合金内植物骨整合的效果。白藜芦醇可作为新药或钛合金内植物功能化改良的复合材料成分改善糖尿病患者中钛合金内植物的骨整合效果。

Description

白藜芦醇在糖尿病条件下医用钛合金内植物中的应用

技术领域

本发明属于医用生物材料领域，涉及医用钛合金内植物的骨整合效果，具体涉及白藜芦醇在糖尿病条件下医用钛合金内植物中的应用。

背景技术

糖尿病导致钛合金内植物松动是亟待解决的医学问题：钛合金是应用范围最广的骨植入性材料，然而在一些特定疾病人群如糖尿病患者中，钛合金内植物失稳率却显著升高，严重影响预后，对患者造成很大家庭和社会负担。因此，阐明钛合金內植物失稳的发生机制并据此采取有效手段降低钛內植物的失稳率是亟待解决的医学难题。

氧化应激导致的细胞功能障碍和凋亡是糖尿病致钛合金松动的关键机制：氧化应激(oxidative stress)是机体内高活性物质如活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)产生过多，超出了机体的清除能力，导致氧化和抗氧化失衡的一种状态。生理范围内的ROS在调节人体正常的功能如基因表达、信号转导等方面起着重要的作用。然而，过高浓度的ROS可以导致核酸、蛋白质、脂质产生氧化反应，损害细胞的结构和功能，引起疾病的发生。研究表明“材料-骨”界面氧化应激严重影响材料的骨整合，糖尿病环境引起“钛-骨”界面细胞内源性ROS过量产生导致成骨细胞功能障碍和凋亡增多是糖尿病致钛合金失稳的关键机制。

糖尿病患者钛合金内植物松动率居高不下，当前临床上缺乏有效的治疗措施。现有研究未探究可通过口服等用药途径解决此类患者痛苦的药物；个别基础医学研究通过钛合金材料表面羟基磷灰石等材料涂层在一定程度上提高了材料的骨整合效果，但其材料制备工艺复杂，成本较高，且可控治疗手段只在材料本身，材料改良对不同患者可能出现不同疗效，材料植入后如果不能解决骨整合效果不良的问题缺乏其他更好的治疗手段。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于，提供一种白藜芦醇在糖尿病条件下医用钛合金内植物中的应用，解决现有技术中糖尿病通过细胞氧化应激造成细胞功能障碍和凋亡，进而导致钛合金内植物骨整合不良和松动的技术问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案予以实现：

白藜芦醇在糖尿病条件下医用钛合金内植物中的应用。

白藜芦醇在制备促进糖尿病条件下医用钛合金内植物骨整合的药物中的应用。

白藜芦醇在制备糖尿病条件下医用钛合金内植物的功能化复合材料中的应用。

白藜芦醇在制备提高糖尿病条件下“钛-骨”界面成骨细胞细胞活力的药物中的应用。

白藜芦醇在制备增强糖尿病条件下“钛-骨”界面成骨细胞成骨分化的药物中的应用。

白藜芦醇在制备提高糖尿病条件下“钛-骨”界面成骨细胞在材料表面粘附状态的药物中的应用。

白藜芦醇在制备抑制糖尿病条件下“钛-骨”界面成骨细胞病理性凋亡的药物中的应用。

白藜芦醇在制备提高糖尿病条件下“钛-骨”界面成骨细胞抗氧化应激损伤能力的药物中的应用。

本发明与现有技术相比，具有如下技术效果：

(Ⅰ)白藜芦醇具有抗氧化等多种有益机体的药理作用：白藜芦醇是天然的多酚类化合物，主要来源于花生、葡萄(红葡萄酒)、虎杖、桑椹等植物，具有抗氧化、预防和治疗动脉粥样硬化、心血管保护、抗肿瘤等多种有益机体的药理作用，其最初作为红酒发挥保健作用的关键成分而被发现，已被作为保健药物用于食品添加剂等用途。

(Ⅱ)医用材料植入人体后，“材料-骨”界面的组织修复主要是骨组织的新生及其与材料的整合，此过程中最关键的因素就是成骨细胞，其功能活性决定了材料骨整合的效果。本发明通过建立医用钛合金表面成骨细胞培养体系，证明了白藜芦醇对糖尿病环境中“钛-骨”界面成骨细胞功能状态的改善作用：提高了糖尿病中“钛-骨”界面成骨细胞的细胞活力；增强了成骨细胞的成骨分化效能；改善了成骨细胞在材料表面粘附状态；增强了成骨细胞抗糖尿病环境造成的氧化应激损伤的能力；减少了成骨细胞的病理性凋亡。这些直接证明了白藜芦醇在“钛-骨”界面局部组织中有效的治疗作用。

(Ⅲ)通过建立骨内植入钛合金材料的动物模型，对动物通过灌胃的方式口服用药，进一步证明了白藜芦醇提升糖尿病条件下钛合金内植物骨整合效果的功效。

(Ⅳ)白藜芦醇既可作为口服等全身用药的药物，又可作为钛合金材料功能化改良的复合材料成为钛合金表面药物涂层或复合材料成分，缓释进入材料周围的局部组织，从而发挥治疗作用，提升糖尿病条件下钛合金内植物的骨整合效果，减轻患者痛苦。

(Ⅴ)当前通过化学合成获得白藜芦醇的途径已十分成熟，不受植物来源的限制，能保证充足的药物供应，生产成本较低。

附图说明

图1为白藜芦醇对糖尿病血清培养条件下钛合金表面成骨细胞细胞活力的影响。

图2为白藜芦醇增强糖尿病环境中钛合金表面成骨细胞的成骨分化的效果。

图3-1为白藜芦醇对糖尿病环境中成骨细胞在钛合金表面粘附状态的影响。

图3-2为白藜芦醇影响糖尿病条件下钛合金表面成骨细胞的细胞面积的数据分析。

图3-3为白藜芦醇影响糖尿病条件下钛合金表面成骨细胞的细胞密度的数据分析。

图4为白藜芦醇降低糖尿病环境中钛合金表面成骨细胞的凋亡比例。

图5-1为白藜芦醇对糖尿病环境中钛合金表面成骨细胞的氧化应激水平的影响。

图5-2为白藜芦醇影响糖尿病条件下钛合金表面成骨细胞内过氧化氢酶表达水平的蛋白印记检测和数据分析。

图6-1为白藜芦醇影响糖尿病动物体内植入的钛合金材料骨整合效果的显微CT分析的图像结果。

图6-2为白藜芦醇影响糖尿病动物体内植入的钛合金材料周围新生骨形成情况的量化分析结果。

图6-3为白藜芦醇影响糖尿病动物体内植入的钛合金材料骨结合情况的生物力学拔出试验结果。

图7-1到7-3分别为白藜芦醇对糖尿病条件下没有钛合金的环境中成骨细胞的细胞活力、成骨分化和细胞凋亡比例的影响。

附图中数据都是平均数±标准差；*代表和正常组相比有统计学差异(P<0.05)，#代表和糖尿病组相比有统计学差异(P<0.05)。

以下结合实施例对本发明的具体内容作进一步详细解释说明。

具体实施方式

研究表明，糖尿病条件引起“钛-骨”界面细胞内源性ROS过量产生导致成骨细胞功能障碍和凋亡是糖尿病致钛合金失稳的关键机制。

白藜芦醇具有抗氧化等多种有益机体的药理作用：白藜芦醇是天然的多酚类化合物，主要来源于花生、葡萄(红葡萄酒)、虎杖、桑椹等植物，具有抗氧化、预防和治疗动脉粥样硬化、心血管保护、抗肿瘤等多种有益机体的药理作用，其最初作为红酒发挥保健作用的关键成分而被发现，已被作为保健药物用于食品添加剂等用途。

本发明的目的在于提供白藜芦醇改善糖尿病患者中钛合金内植物骨整合效果的应用，白藜芦醇可作为新药或医用材料功能化改良的复合材料提升糖尿病条件下钛合金内植物的骨整合效果。有效成分含有白藜芦醇的药物可采用片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、注射剂或乳剂，用于全身性用药。上述制剂中可含有辅助物质、稳定剂、润湿剂和其它常用的添加剂，如乳糖、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸镁、石膏粉、蔗糖、玉米淀粉、明胶、琼脂、果胶、花生油、橄榄油、可可脂、乙二醇、抗坏血酸、甘露醇等。

也可将白藜芦醇作为钛合金的表面药物涂层或复合材料进行医用钛合金内植物的生物性能改良，在组织局部发挥治疗作用，提升糖尿病条件下钛合金内植物的骨整合效果。

以下给出本发明的具体实施例，需要说明的是本发明并不局限于以下具体实施例，凡在本申请技术方案基础上做的等同变换均落入本发明的保护范围。

需要说明的是：本发明中所述的“糖尿病条件”在实施例1～5中指用从糖尿病动物体内提取的糖尿病血清用于细胞培养，在实施例6中指在糖尿病动物体内。糖尿病血清提取过程：将四氧嘧啶(STZ)40mg/kg尾静脉注射于体重约250～300g的SD雄性大鼠，每天1次，连续5天。最后一次注射后14天，测空腹血糖，空腹血糖>300mg/dl为糖尿病动物。采集糖尿病动物的血液，血液通过标准的血清分离方法分离出糖尿病血清，血清过滤除菌备用。

本发明中所述的“糖尿病条件”跟一般意义上的“高糖条件”完全不同：前者指糖尿病动物体内细胞生存的环境，主要是糖尿病血清；糖尿病是机制复杂的代谢性疾病，糖尿病患者的血清中存在多种成分的异常，比如血糖增高、胰岛素等多种内分泌激素含量异常、多种血脂成分含量异常(存在不同程度的对细胞有害的脂类代谢产物)，很多对细胞代谢具有重要保护作用的激素水平下降；在本发明的体外实验中我们用直接从糖尿病动物体内提取的血清来培养细胞，能直接模拟糖尿病体内环境中细胞的生存环境；而“高糖条件”指在用正常血清进行细胞培养的液体中直接加入高剂量的葡萄糖，这和糖尿病血清内环境完全是两个概念。在这两种不同条件下得到的研究结果不能等同。

实施例1：

本实施例给出白藜芦醇在制备提高糖尿病条件下“钛-骨”界面成骨细胞细胞活力的药物中的应用，即给出白藜芦醇对糖尿病环境中钛合金表面成骨细胞的细胞活力的改善作用。

实验方法：将医用钛合金切割加工成钛片，表面打磨抛光，清洗消毒后备用。利用分离培养SD大鼠乳鼠颅骨的成骨细胞，并将其按1×10⁴个/毫升的细胞密度接种在钛合金表面，建立体外“钛-骨”界面模型。

分为5组：

1)正常血清组(正常组)；

2)糖尿病血清组(糖尿病组)；

3)糖尿病+白藜芦醇10μM；

4)糖尿病+白藜芦醇50μM；

5)糖尿病+白藜芦醇250μM。

各组细胞接种量相同，培养的第3和第7天，用MTT法检测钛表面成骨细胞的细胞活力，评价不同剂量白藜芦醇在“钛-骨”界面对糖尿病环境中成骨细胞细胞活力的提升作用。

结果：如图1所示，与正常对照组相比，糖尿病组成骨细胞细胞活力明显受抑制，而糖尿病血清中加入白藜芦醇后，成骨细胞在不同培养时间点细胞活力都有明显提高，且该改善作用与白藜芦醇的剂量在低于250μM的范围内正相关。

结果分析：上述结果表明，白藜芦醇对糖尿病环境中“钛-骨”界面成骨细胞的细胞活力有明显改善作用。

实施例2：

本实施例给出白藜芦醇在制备增强糖尿病条件下“钛-骨”界面成骨细胞成骨分化的药物中的应用，即给出白藜芦醇对糖尿病环境中钛合金表面成骨细胞的成骨分化的增强作用。

实验方法：将成骨细胞按1×10⁴个/毫升的细胞密度接种在钛合金表面进行培养，分为5组：

1)正常组；

2)糖尿病组；

3)糖尿病+白藜芦醇10μM；

4)糖尿病+白藜芦醇50μM；

5)糖尿病+白藜芦醇250μM。

在培养7天后利用ALP酶活力检测试剂盒(Sigma公司)检测钛表面成骨细胞分化程度(ALP活性反应成骨分化)，按照试剂盒的专业说明书操作。

结果：如图2所示，与正常对照组相比，糖尿病组成骨细胞ALP活性明显下降。糖尿病环境中加入白藜芦醇后，成骨细胞的ALP活性(成骨分化程度)明显提高，且该改善作用与白藜芦醇的剂量正相关。

结果分析：上述结果表明，白藜芦醇对糖尿病环境造成的“钛-骨”界面成骨细胞成骨分化的抑制有明显改善作用。

实施例3：

本实施例给出白藜芦醇在制备提高糖尿病条件下“钛-骨”界面成骨细胞在材料表面粘附状态的药物中的应用，即给出白藜芦醇对糖尿病环境中成骨细胞在钛合金表面粘附状态和细胞增殖的改善作用。

实验方法：将成骨细胞接种在钛合金表面进行培养，分为5组：

1)正常组；

2)糖尿病组；

3)糖尿病+白藜芦醇10μM；

4)糖尿病+白藜芦醇50μM；

5)糖尿病+白藜芦醇250μM。

在培养3天后对成骨细胞进行细胞骨架和细胞核的荧光染色，后用激光共聚焦显微镜观察并拍照。每组采集三个钛片上的图片(实验重复3次)，每个钛片上随机选取的6个视野进行拍照，对各组的细胞密度和细胞面积两项指标利用Image J软件进行统计分析。对比组间差异，评价白藜芦醇对糖尿病环境中成骨细胞在钛合金表面粘附状态和细胞增殖的影响。

结果：与正常对照组相比，糖尿病血清中培养的成骨细胞细胞骨架排列紊乱，细胞边缘大多卷曲，与钛合金的粘附不佳(附图3-1)，细胞密度(附图3-2)和面积(附图3-3)都明显下降。糖尿病环境中加入白藜芦醇后，成骨细胞细胞骨架排列、钛表面粘附、细胞密度和面积都明显改善，且对细胞密度和面积的改善作用与白藜芦醇的计量正相关。

结果分析：上述结果表明，糖尿病内环境造成“钛-骨”界面成骨细胞在钛合金表面粘附不佳，因而细胞密度和细胞伸展的面积下降；而白藜芦醇能有效改善糖尿病条件下成骨细胞在钛合金表面的粘附，细胞增殖得到恢复。

实施例4：

本实施例给出白藜芦醇在制备抑制糖尿病条件下“钛-骨”界面成骨细胞病理性凋亡的药物中的应用，即给出白藜芦醇减少糖尿病环境中钛合金表面成骨细胞凋亡的保护作用。

实验方法：将成骨细胞接种在钛合金表面进行培养，分组与实施例3相同。

培养第7天，用胰酶将细胞从材料上消化下来形成细胞悬液，利用Annexin V-FITC/propidium iodide(PI)双标法进行细胞染色并用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，评价白藜芦醇对糖尿病条件下成骨细胞凋亡的影响。

结果：与正常对照组相比，糖尿病组成骨细胞凋亡比例升高了约6倍(附图4)，而糖尿病环境中白藜芦醇的存在明显降低了成骨细胞凋亡的比例，增强了细胞的存活能力。这种抗凋亡作用与白藜芦醇的计量在低于250μM的范围内正相关。

结果分析：上述结果表明，白藜芦醇能明显提高糖尿病条件下“钛-骨”界面成骨细胞的生存能力，降低其凋亡率。

实施例5：

本实施例给出白藜芦醇在制备提高糖尿病条件下“钛-骨”界面成骨细胞抗氧化应激损伤能力的药物中的应用，即给出白藜芦醇对糖尿病环境中钛表面成骨细胞抗氧化应激损伤的能力的改善作用。

实验方法：将成骨细胞接种在钛合金表面进行培养，分组与实施例3相同。

培养第7天，用DCFH-DA染色(Sigma)结合流式细胞仪检测细胞内的活性氧簇含量，评估细胞氧化应激水平。用Western bolt蛋白印记检测细胞内过氧化氢酶的表达水平，评估细胞的抗氧化损伤能力，组间比较。

结果：与正常对照组相比，糖尿病组成骨细胞内活性氧簇含量明显增加(附图5-1)，过氧化氢酶表达则明显下降(附图5-2)，说明糖尿病环境造成“钛-骨”界面成骨细胞的氧化应激损伤。而加入白藜芦醇后，过氧化氢酶表达上升，细胞内活性氧簇水平显著下调，说明白藜芦醇明显增强了糖尿病环境中成骨细胞的抗氧化应激能力，改善了细胞的氧化应激损伤。

结果分析：以上结果表明，在糖尿病条件下，白藜芦醇能有效增强“钛-骨”界面成骨细胞的抗氧化能力，减轻细胞的氧化应激损伤，由此能解释实施例1～4中白藜芦醇对糖尿病条件下成骨细胞的活力、分化、粘附和凋亡的改善作用。

实施例6：

本实施例给出白藜芦醇在制备促进糖尿病条件下医用钛合金内植物骨整合的药物中的应用，即给出白藜芦醇提高糖尿病动物体内植入的钛合金材料的骨整合效果。

实验方法：将四氧嘧啶(STZ)40mg/kg尾静脉注射于体重约200g的SD雄性大鼠，每天1次，连续5天。最后一次注射后7天，测空腹血糖，空腹血糖>300mg/dl为糖尿病成模动物，用于后续试验。在外科手术条件下，SD大鼠双侧股骨远端沿股骨长轴方向向髓内植入直径1.5mm、长10mm的圆柱形钛合金内植物，建立钛内植物体内植入模型。将白藜芦醇溶解于生理盐水中准备给动物用药。动物随机分为4组，每组12只：

1)正常对照组；

2)糖尿病组：2天一次，生理盐水2ml灌胃(阴性对照)；

3)糖尿病+白藜芦醇5mg/kg：2天一次，白藜芦醇5mg/kg(药量/体重比)灌胃；

4)糖尿病+白藜芦醇15mg/kg：2天一次，白藜芦醇15mg/kg灌胃。

材料植入后6周取材，取植入了材料的股骨，每只老鼠左侧股骨用于显微CT扫描(GE公司)检测，右侧股骨用于材料骨结合生物力学检测。利用显微CT扫描数据计算“钛-骨”界面骨植入物结合分数(Bone-implant contact)，利用生物力学拔出试验测得材料拔出的最大力(Maximal push-out force)，综合评价各组钛合金材料的骨整合效果。

结果：与正常动物相比，糖尿病动物体内的钛合金材料骨结合不佳(附图6-1)，骨植入物结合分数明显下降(附图6-2)，生物力学检测中最大拔出力明显降低(附图6-3)，说明材料骨结合效果不佳。糖尿病动物白藜芦醇给药后骨植入物结合分数明显升高，最大拔出力显著提高，有统计学差异。且高计量(15mg/kg)的改善作用比低剂量(5mg/kg)更明显。

结果分析：上述结果说明，白藜芦醇能有效提高糖尿病条件下体内钛合金植入物的骨整合效果，增强钛内植物的稳定性。

实施例7：

本实施例给出白藜芦醇在制备糖尿病条件下医用钛合金内植物的功能化复合材料中的应用，即给出白藜芦醇作为医用钛合金材料的复合药物涂层用于组织局部药物缓释，从而促进糖尿病患者钛合金内植物骨整合的应用。

钛合金材料植入人体骨组织的过程造成局部骨组织的损伤，植入完成后材料周围骨组织需要再生修复，生成新的骨组织并与内植物整合，从而保证内植物的稳定。机体局部骨组织中多种细胞参与此骨新生过程，其中起关键作用即成骨细胞，它的功能状态直接决定“钛-骨”界面骨再生和钛合金骨整合的效果。

医用材料表面复合涂层用于组织局部的药物缓释，使药物集中作用于目标范围的组织，被公认为有效提升材料生物学性能的方法。本发明实施例1～5采用钛合金表面培养成骨细胞的方法，模拟体内“钛-骨”结合部(“钛-骨”界面)的生物学环境，直观地检测糖尿病血清(代表糖尿病内环境)对成骨细胞的不良影响以及白藜芦醇对糖尿病环境中“钛-骨”界面成骨细胞的直接改善作用和机制，证明了白藜芦醇在组织局部有效的治疗效果。由此，可以得出以下科学推论：相对口服用药等全身性用药方式，钛合金材料表面复合白藜芦醇涂层后植入需要使用钛合金内植物的糖尿病患者的骨组织，能使白藜芦醇在“钛-骨”界面局部集中发挥作用，改善糖尿病内环境对成骨细胞生物学行为的负面影响，提高成骨细胞参与骨组织新生的功能，从而促进钛合金内植物的骨整合，改善糖尿病患者钛内植物的稳定性，减轻患者痛苦。

对比例1：

本实施给出白藜芦醇对糖尿病条件下没有钛合金的环境中成骨细胞的影响，说明白藜芦醇对糖尿病条件下不在钛合金表面的成骨细胞无明显生长促进作用。

实验方法：利用分离培养SD大鼠乳鼠颅骨的成骨细胞，将其按1×10⁴个/毫升的细胞密度接种在12孔细胞培养板的孔内，在没有钛合金的环境中进行细胞培养，分为四组，各组细胞接种量相同：

1)正常血清组；

2)糖尿病血清组；

3)糖尿病+白藜芦醇50μM；

4)糖尿病+白藜芦醇250μM。

分别在培养3天和7天后，用MTT法检测钛表面成骨细胞的细胞活力；培养7天后利用ALP酶活力检测试剂盒检测钛表面成骨细胞分化程度，并利用Annexin V-FITC/propidium iodide(PI)双标法染色法结合流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

结果：与正常组相比，糖尿病条件在没有钛合金存在的环境中也导致了成骨细胞的增殖力降低(附图7-1)，分化程度减弱(附图7-2)和凋亡比例增加(附图7-3)。糖尿病条件下加入两个不同剂量的白藜芦醇后成骨细胞的上述生物学性能抑制都未得到有效改善。

结果分析：钛合金与骨的接触面(“钛-骨”界面)是一种特殊的生物环境，细胞在钛表面的生物学行为与在没有钛合金的普通人体环境中不同，这也是当前科研领域热衷于研究“材料-人体组织”界面的特殊生物学现象和机制的原因。本实施例结果表明，在没有钛合金存在的糖尿病环境中白藜芦醇对糖尿病条件造成的成骨细胞损伤没有明显改善作用，白藜芦醇的良好治疗作用只在“钛-骨”界面这个特殊环境中发挥作用。

Claims (7)

1.白藜芦醇在制备促进糖尿病条件下医用钛合金内植物骨整合的药物中的应用。

2.白藜芦醇在制备糖尿病条件下医用钛合金内植物的功能化复合材料中的应用。

3.白藜芦醇在制备提高糖尿病条件下“钛-骨”界面成骨细胞细胞活力的药物中的应用。

4.白藜芦醇在制备增强糖尿病条件下“钛-骨”界面成骨细胞成骨分化的药物中的应用。

5.白藜芦醇在制备提高糖尿病条件下“钛-骨”界面成骨细胞在材料表面粘附状态的药物中的应用。

6.白藜芦醇在制备抑制糖尿病条件下“钛-骨”界面成骨细胞病理性凋亡的药物中的应用。

7.白藜芦醇在制备提高糖尿病条件下“钛-骨”界面成骨细胞抗氧化应激损伤能力的药物中的应用。