CN106153601B - 一种基于表面增强拉曼光谱检测油脂痕量氧化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于表面增强拉曼光谱检测油脂痕量氧化的方法，采用纳米银粒子表面增强拉曼光谱信号值的方法来灵敏快捷的检测食用油脂痕量氧化稳定性。本发明检测速度快，检测结果准确可靠，测试过程不使用任何化学试剂是一种新型的无损检测方法，同时又能对油脂进行痕量氧化检测，痕量检测时信号可以比普通拉曼光谱增强上万倍，灵敏度高，在油脂氧化初期进行快速准确的检测具有相当优势。
Description
技术领域
本发明属于食品分析领域，具体涉及一种基于表面增强拉曼光谱检测油脂痕量氧化的方法。
背景技术
油脂是人类三大营养素之一，是很好的热能营养素，在人体内具有重要的生理功能。油脂氧化是影响油脂品质的一个重要因素，它所产生的产物对食用油脂的风味、色泽以及组织都会产生不良的影响，还会使食品发生褪色、褐变、维生素破坏，降低食品品质和营养价值，甚至产生有害物质引起食物中毒，严重危害人体健康。因此，有效的检测油脂氧化的情况，防止油脂氧化对食品体系及人类健康带来破坏是十分重要的。
传统的油脂氧化分析方法多为化学法，即通过化学手段测定过氧化值、茴香胺值、共轭二烯烃等，作为常规方法，它们只能提供唯一的指标，但是却不能从中得到样品的实际化学成分的信息。另外，在油脂氧化初期往往很难用化学分析的方法准确测定。另一种色谱法，如气相色谱法、高效液相色谱法这类技术，可以更细致地研究氧化进程，对油脂轻度氧化也非常敏感，然而却需要大量的抽样处理，设备操作复杂又消耗大量预处理时间，不能实现实时快速分析的目的。因此制定一种油脂氧化便捷快速且对于轻度痕量氧化又十分灵敏的分析方法是十分必要的。
拉曼光谱作为一种快速分析手段，可以通过不同的振动快速、准确地识别分子物种，而且不会破坏物质原来具有的结构，可以用来快速检测油脂氧化程度，但是由于样品氧化初期，氧化程度过低，粒子的振动不明显，传统拉曼光谱可能捕捉不到这些变化，使这项技术的潜力受到了限制，因此，在检测样品浓度较低时，提高传统拉曼光谱的检测敏感度和精确度成为一个亟待解决的问题。
近年来，表面增强拉曼光谱(SERS)技术逐渐成为了一种非常重要的生物分子超敏感探测技术。这种技术结合了拉曼效应的优点，如识别给定物质和对相似物质进行区分的高度特异性，而且将样品附着在纳米级的粗糙金属表面上，还能有效地大幅度增强拉曼信号。在增强基底的作用下，拉曼信号的强度可能会增大104～106倍。这种增大效应称为表面增强拉曼散射，不过只有在直接吸附于金属表面的物质中才能观察到这种现象。银和金是最常使用的增强基底。为了得到好的增强效果，金属表面必须具有合适的粗糙度，而银基在SERS效应中是较为有效，且成本较低的。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有检测食用油脂氧化进程的方法中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是提供一种基于表面增强拉曼光谱检测油脂痕量氧化的方法。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种基于表面增强拉曼光谱检测油脂痕量氧化的方法，包括，油脂加速氧化试验，将食用油脂密封，置于温度为50～60℃的环境下，定时取样测定；制备拉曼光谱表面增强基底，在金属锌过量的条件下，加入硝酸银溶液，制得纳米银；拉曼光谱扫描，在纳米银表面滴加经正己烷或无水乙醇稀释的油样，然后烘干，采用785nm波长的入射激光光源对待测油样进行扫描，获得含拉曼特征峰的拉曼光谱图，选择其中最显著的974cm-1和1304cm-1的特征峰特异表示油脂放大痕量氧化程度，以特征峰1442cm-1作为内标，其比值为油脂的相对氧化强度，用拉曼光谱的相对氧化强度来分析表面增强拉曼光谱测得的油脂氧化强度；所述对待测油样进行扫描，其中，选用光栅为500～700mm-1，积分时间为25～35s，扫描次数为3～5次，扫描范围设为200-2000cm-1。
作为本发明所述基于表面增强拉曼光谱检测油脂痕量氧化的方法的一种优选方案，其中：所述光栅为600mm-1锯齿形光栅。
作为本发明所述基于表面增强拉曼光谱检测油脂痕量氧化的方法的一种优选方案，其中：所述积分时间为25～35s。
作为本发明所述基于表面增强拉曼光谱检测油脂痕量氧化的方法的一种优选方案，其中：所述经正己烷或无水乙醇稀释的油样，其稀释倍数为5～50倍。
作为本发明所述基于表面增强拉曼光谱检测油脂痕量氧化的方法的一种优选方案，其中：所述食用油脂包括大豆原油及其成品油、菜籽原油、茶籽油、食用调和油、橄榄成品油、花生油、芝麻油、芥花籽成品油、棕榈原油、精炼棕榈油、葵花籽原油及其成品油、玉米原油及其成品油、精炼椰子油、米糠原油、棉籽原油、稻米成品油、精炼红花油、亚麻籽成品油、花椒成品油或鱼油中的一种或几种。
作为本发明所述基于表面增强拉曼光谱检测油脂痕量氧化的方法的一种优选方案，其中：所述食用油脂为山茶籽油。
作为本发明所述基于表面增强拉曼光谱检测油脂痕量氧化的方法的一种优选方案，其中：所述对待测油样进行扫描，其是对待测油样进行多次取样扫描，并将各扫描曲线置于同一拉曼光谱图中，制得各样品曲线叠加后形成的所述待测油样的拉曼光谱图。
作为本发明所述基于表面增强拉曼光谱检测油脂痕量氧化的方法的一种优选方案，其中：所述对待测油样进行扫描，其扫描次数为3次。
作为本发明所述基于表面增强拉曼光谱检测油脂痕量氧化的方法的一种优选方案，其中：所述入射激光光源，其激光能量为5.0mW，此时特征拉曼峰的强度不低于1000，分辨率高于2cm-1。
本发明具有的有益效果：
(1)特异性强、拉曼特征信号强信噪比高，荧光背景小且鉴定结果准确可靠。
(2)无损检测并且测试过程不使用任何化学试剂。
(3)鉴定迅速，积分时间短效率高，适合大批量快速检验。
(4)痕量检测，能使拉曼信号增强上万倍，对微量氧化敏感度更高，在油脂氧化的初期，传统化学方法很难监测到油脂的微量氧化，但本发明在油脂发生微量氧化时仍可以快速准确灵敏的完成检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为实施例1过氧化值标准曲线。
图2为实施例1山茶籽油储存不同天数的过氧化值变化。
图3为实施例2中纳米银基底的扫描电子显微镜图。
图4为实施例2中纳米银溶液的拉曼光谱图。
图5为实施例4中己烷稀释50倍的山茶籽油SERS图。
图6为实施例5中50倍稀释倍数的山茶籽油在储存过程中油脂氧化强度(I965/I1442)的变化。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1(对比实施例)：过氧化值检测法检测山茶籽油的氧化情况
于一系列干燥的50mL比色管中，加入2.5mL的氯仿-冰乙酸(40:60)混合溶液，再分别加入0，0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.4，0.5，0.6mL碘标准溶液，摇匀。
各加入0.50mL的淀粉指示剂，加水稀释至刻度，轻轻摇匀并静置5min。
待分层后吸取上层清液，以空白作参比，于535nm处测其吸光度。根据得到的吸光度各自对应的浓度，绘制工作曲线并且计算其直线回归方程如图1所示。
油样过氧化值的测定步骤：准确称取0.01～0.025g(准确至0.0002g)样品于干燥的50mL比色管中，加入2.50mL的氯仿-冰乙酸(40:60)混合溶液，加入0.25mL饱和碘化钾溶液，轻轻摇匀，置于暗处，反应3min；取出后立即加入0.5mL淀粉指示剂，加水稀释到刻度，摇匀，静置5min；待分层后吸取上层清液，以空白作参比，于535nm处测其吸光度，并在标曲上读出样品的过氧化值如图2所示，图中可以看出在第1天至第4天，油脂氧化初期，用该方法进行测定结果并不十分灵敏。
实施例2：纳米银的制备
准确称取0.425g硝酸银晶体并溶于50mL蒸馏水中，配制成50mmol/L的硝酸银溶液。
取过量锌片在0.02mol/L的稀盐酸中浸泡一段时间，清洗掉表面杂质，取出后用蒸馏水洗净、晾干。
将锌片置于烧杯中，缓缓加入配制好的硝酸银溶液，反应3min。
将硝酸银溶液慢慢倒掉，将锌片上的银晶体轻轻刮下，并用煮沸过的蒸馏水反复洗涤。
将洗净的银晶体置于装有煮沸过的去离子水的小玻璃容器中，避光储存，备用。纳米银基底形态用扫描电子显微镜观察呈树枝状，结果如图3所示。纳米银溶液单独的拉曼光谱图如图4所示。
实施例3：准备油脂痕量氧化样品
将山茶籽油分别用用正己烷和无水乙醇稀释，得到5倍、10倍、20倍、50倍的混合溶液。
在包有锡箔纸的载玻片上滴加5μL纳米银，烘干后在纳米银表面滴加2.5μL经稀释的油样，再次烘干，将其置于显微共聚焦拉曼光谱仪载物台的物镜视野下，找到合适的位置，并调整焦距至清晰可见。
实施例4：表面增强拉曼光谱监测油脂痕量氧化
设置扫描参数为光栅600mm-1，积分时间为25s，扫描次数为3次，扫描范围则设定为200～2000cm-1，在视野中取合适的点，调整焦距至清晰可见并检测，己烷稀释20倍的山茶籽油SERS图如图5所示。与普通拉曼光谱的测定结果相比较，SERS图中967cm-1处的特征峰对应普通拉曼图的974cm-1处；SERS图中1304cm-1处的特征峰对应普通拉曼图的1303cm-1处，表面增强拉曼光谱的特征峰较普通拉曼光谱有一定的位移。
实施例5：油脂痕量氧化表面增强拉曼光谱图谱分析
以波数为967cm-1和1303cm-1的特征峰表示油脂放大痕量氧化程度，以波数为1442cm-1的特征峰为内标，用相对强度分析表面增强拉曼光谱测得的油脂氧化强度。这些不同的样品在967cm-1和1303cm-1处的SERS特征峰强度对比如表1和表2所示。由表可见，信号强度增加了几十倍到上百倍。
表1山茶籽油在967cm-1处的SERS特征峰
| 稀释倍数 | 拉曼强度 | 增强因子 |
| - | 307 | - |
| 5 | 30144 | 497.15 |
| 10 | 32667 | 1059.36 |
| 20 | 42367 | 2767.09 |
| 50 | 59725 | 9734.58 |
| 100 | - | - |
| 200 | - | - |
表2山茶籽油在1303cm-1处的SERS特征峰
| 稀释倍数 | 拉曼强度 | 增强因子 |
| - | 775 | - |
| 5 | 35419 | 225.16 |
| 10 | 36933 | 478.87 |
| 20 | 43916 | 2839.31 |
| 50 | 65000 | 4196.62 |
| 100 | - | - |
| 200 | - | - |
通过下列公式(1)计算相关的增强因子，以此来说明与普通拉曼光谱相比，表面增强拉曼光谱的相应特征峰强度增强的情况。其中，ISERS表示处于某位置的特征峰的SERS强度，IRS表示相应特征峰的普通拉曼强度；CRS表示在普通拉曼光谱的测定方法中该样品的浓度，CSERS表示SERS所用样品的浓度。
根据公式(1)计算的967cm-1和1304cm-1处特征峰的增强因子也如表1和表2所示，效果最好的50倍稀释倍数条件下，967cm-1处的SERS的特征峰强度比普通拉曼光谱的增强了约9727倍；1303cm-1处的SERS的特征峰强度比普通拉曼光谱的增强了约4194倍。当稀释到100倍和200倍时检测不到拉曼光谱信号。稀释倍数为50时，山茶籽油在储存过程中I965/I1442值即，油脂的相对氧化强度的直观变化折线图如图6所示，其变化趋势与过氧化值方法测定结果一致。但是在氧化前4天，采用过氧化值测定油脂的氧化程度，数据显示仅为0.001左右，氧化数值改变不明显，到第6天时过氧化值为0.52，明显高于前3天。而采用表面增强拉曼光谱进行检测，前4天相对氧化强度变化明显由0.97上升至1.25，氧化强度改变明显，而第6天时相对氧化强度为1.51，数据在氧化初期和中后期都显示出良好线性，对痕量油脂氧化有准确的检测效果。另外，稀释50倍后的山茶籽油增强效果要好于低稀释倍数的油样。当稀释倍数较低时，有多层油脂分子吸附在纳米银表面，会降低拉曼信号；当到达某一倍数时，只有一层分子吸附在纳米银表面，这时信号最强；而当稀释倍数过高时，分子达不到发生聚合的临界浓度，使得没有足够的油脂分子吸附在基底表面，因此信号很弱。
通过研究发现，扫描积分时间决定了CCD的曝光时间，为避免CCD在强度为50000个计数的时候饱和，需要校准这个积分时间，最大设定为120s。相同条件下，积分时间越长，拉曼峰强度越大。在基于拉曼光谱对食用油进行检测时，操作者为获得一较强的信号强度，积分时间通常会选用其最大值，即120s。但如果大批量检测时，120s的积分时间叠加起来就会使整体效率急剧下降，也就失去了利用拉曼光谱技术本身迅速高效的特点；但积分时间过短，信号强度不足，并且信噪比低，对检测十分不利。发明人在对山茶籽油进行拉曼光谱检测的实验过程中尝试引入锯齿形光栅，发现锯齿形光栅在尖角处不论是钝角或锐角，都有增强拉曼信号强度的作用，并且尖角角度越尖其增强效果越好。这样一来，即使积分时间较短，也能够保证一定的拉曼信号强度，在这个基础上，经过大量实验优选，最终选用锯齿形光栅600mm-1，积分时间选为25～30s，当稀释倍数适当时，分子达到发生聚合的临界浓度，拥有足够的油脂分子吸附在基底表面，扫描次数为三次即可。在此积分时间下，拉曼信号强度大，并且噪声小、基线平滑，信噪比较高。由此可见，本发明提供的一种快速快速检测食用油脂氧化进程的方法，所检测出的拉曼特征信号强、信噪比高，积分时间短效率高，适合大批量快速检验。
通过研究发现，在对食用油进行拉曼光谱检测时，会出现一个典型的倾斜宽背景，使基线偏离，信噪比下降，影响数据进一步分析处理，有时荧光物质会使拉曼光谱的特征峰淹没在较强的荧光背景里，致使定性分析失败。发明人在对食用油进行拉曼光谱检测的实验过程中尝试采用波长有785nm的入射光源，并调整激光能量为5.0mW，发现调整一定强度的激光能量大小，能够大大减小其荧光背景，提高信噪比；但激光光源功率过大，聚焦点微小，易造成样品局部升温，而样品的颜色会影响物质的吸光度。通过反复试验推究发现，这样的波长下可以避免背景太大，易于观察出峰情况以及有效确定成分结构；提高一定的激光能量能有效缩小积分时间同时不降低信号信噪比，提高检测效率及其准确性，实现对食用油氧化检测的快速、特异、高效。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (6)
1.一种基于表面增强拉曼光谱检测油脂痕量氧化的方法，其特征在于：包括，
油脂加速氧化试验：将食用油脂密封，置于温度为50～60℃的环境下，定时取样测定；
制备拉曼光谱表面增强基底：在金属锌过量的条件下，加入硝酸银溶液，制得纳米银；
拉曼光谱扫描：在纳米银表面滴加经正己烷或无水乙醇稀释的油样，然后烘干，采用785nm波长的入射激光光源对待测油样进行扫描，获得含拉曼特征峰的拉曼光谱图，选择其中最显著的974cm-1和1304cm-1的特征峰特异表示油脂放大痕量氧化程度，以特征峰1442cm-1作为内标，其比值为油脂的相对氧化强度，用拉曼光谱的相对氧化强度来分析表面增强拉曼光谱测得的油脂氧化强度；
所述对待测油样进行扫描，其中，选用光栅为600mm-1锯齿形光栅，积分时间为25～35s，扫描次数为3～5次，扫描范围设为200-2000cm-1。
2.根据权利要求1所述基于表面增强拉曼光谱检测油脂痕量氧化的方法，其特征在于：所述经正己烷或无水乙醇稀释的油样，其稀释倍数为5～50倍。
3.根据权利要求1所述基于表面增强拉曼光谱检测油脂痕量氧化的方法，其特征在于：所述食用油脂包括大豆原油及其成品油、菜籽原油、茶籽油、食用调和油、橄榄成品油、花生油、芝麻油、芥花籽成品油、棕榈原油、精炼棕榈油、葵花籽原油及其成品油、玉米原油及其成品油、精炼椰子油、米糠原油、棉籽原油、稻米成品油、精炼红花油、亚麻籽成品油、花椒成品油或鱼油中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述基于表面增强拉曼光谱检测油脂痕量氧化的方法，其特征在于：所述对待测油样进行扫描，其是对待测油样进行多次取样扫描，并将各扫描曲线置于同一拉曼光谱图中，制得各样品曲线叠加后形成的所述待测油样的拉曼光谱图。
5.根据权利要求4所述基于表面增强拉曼光谱检测油脂痕量氧化的方法，其特征在于：所述对待测油样进行扫描，其扫描次数为3次。
6.根据权利要求1、3、4或5中任一项所述基于表面增强拉曼光谱检测油脂痕量氧化的方法，其特征在于：所述入射激光光源，其激光能量为5.0mW，此时特征拉曼峰的强度不低于1000，分辨率高于2cm-1。
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| Publication number | Publication date |
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| CN106153601A (zh) | 2016-11-23 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |