CN106148316A - 细胞固定化载体表面亲水性的改善方法及应用 - Google Patents

Abstract

一种改善碳纤维表面亲水性的方法，具体涉及利用强氧化剂（如强酸，双氧水等）对碳纤维表面经氧化改性处理，以增强亲水性的方法，并作为细胞固定化载体应用于多批式发酵生产中。具体步骤如下：将200T、300T、700T级的布状或束状PAN基碳纤维中的一种进行表面清洗后，利用浓度为62%-78%的硝酸、硫酸等强酸浸泡0.5~6h，清洗干燥后确定碳纤维表面的性质变化并作为固定化载体应用于发酵生产中。氧化改性后的碳纤维极性明显增强，碳纤维表面接触角由接近0°变化为80-120°，表面氧官能团由6.32-9.21%增加至16.9-22.3%，比表面积增加至26.23-32.67㎡·g^-1。在细胞固定化发酵生产中可实现连续发酵5-10批。本发明采用的碳纤维改性方法可被认为一种在发酵生产中有前途的制备良好生物相容性载体的方法。

Description

细胞固定化载体表面亲水性的改善方法及应用

技术领域

一种改善碳纤维表面亲水性的方法，具体涉及碳纤维表面利用强氧化剂进行氧化改性增强亲水性的方法，并作为载体应用于细胞固定化的多批式发酵生产中。

背景技术

固定化细胞的使用能够缓解胞内酶的隔离和净化过程中多余的耗时和复杂的步骤，且能够防止微生物细胞被稀释于开放的水域系统中。载体材料为微生物提供外部保护和足够的孔隙空间，并为微生物细胞的生存和功能性输出创造了有利条件，因此受到越来越多的关注。目前，许多研究人员致力于在不同固定化载体上以维持高性能、高持久性的细胞活性为前提进行高效、连续发酵。因此，对于载体的选择至关重要，且载体表面的性质影响细胞的生长和新陈代谢。一个具有理想表面性质的固定化载体不仅具有适当的物理属性使细胞能够良好的粘附，而且所选择的的载体应该为降低生产成本的可生物降解材料。

碳具有良好的生物相容性并广泛的应用于医学、生物工程、材料等领域，以碳基材料作为固定化载体具有广阔的发展前景。碳纤维本身具备优良的生物相容性，已应用于骨替代品、固定骨碎片等医疗方面；并且其自身对细菌拥有较好的吸附性，已经应用于碳纤维生物膜进行细菌吸附高效率的治理废水的研究中。因此，将碳纤维作为载体应用于细胞固定化的发酵生产中是可以实现的。细胞固定化阶段中，润湿性、表面张力、极性、形态和粗糙度等材料表面性质影响细胞的粘附性能。若想取得最优的表面性质，通常会对载体材料进行改性操作。一些报道表明，微生物细胞的粘附能力随着材料表面的亲水性增加而得以改善。

碳纤维作为一种具有非极性表面的新型纤维材料，通过对表面含氧官能团的改性达到提高碳纤维亲水性和生物相容性的目的。本发明采用硝酸、硫酸或双氧水等强氧化剂对碳纤维表面的含氧官能团进行氧化处理，提高碳纤维表面亲水性及生物相容性。目前对于氧化改性后的碳纤维作为固定化载体应用于发酵生产的报道较少，本发明将采用改性碳纤维作为固定化载体，投入到细胞固定化的多批式发酵生产中。

发明内容

本发明所要解决的问题是，提供一种氧化改性后的碳纤维材料作为细胞的固定化载体，由此可显著增强固定化载体的亲水性及生物相容性，提高固定化细胞多批式发酵的产率。

一种碳纤维的改性方法及应用，具体步骤如下：

（1）碳纤维的表面清洗：将碳纤维利用3-5倍碳纤维体积的有机试剂，然后用4-6倍碳纤维体积的去离子水洗掉残留的有机试剂，烘干备用；

（2）碳纤维的表面改性：将表面清洗后的碳纤维浸泡在3-5倍碳纤维体积的强氧化剂中0.5-6 h，然后将强氧化剂倒入试剂回收桶内，并用4-6倍碳纤维体积的去离子水清洗掉碳纤维表面残留的试剂，烘干备用；

（3）改性碳纤维的应用：将改性后的碳纤维按照5-25g/L的加入量加入到培养瓶内，加入培养液并接种后进行多批式发酵生产。

进一步，所述的碳纤维为布状或0.4cm以上的束状的200T、300T、700T级的PAN基碳纤维。

进一步，所述的碳纤维选用2k、3k、6k、12k、24k、补强布等纺织型碳纤维布或碳纤维束。

进一步，所述的碳纤维是利用3-4倍倍丙酮和石油醚等有机试剂浸泡5-10 h，对碳纤维丝束进行索氏提取以达到表面清洗的目的。

进一步，所述的碳纤维在清洗之后需放入100℃的烘箱中先进行烘干1-3 h；改性后的碳纤维需进行同样的烘干操作。

进一步，所述的碳纤维是利用3-5倍碳纤维体积的浓度为62%-78%浓硝酸、浓硫酸或25-40%的双氧水等进行0.5h、1h、2 h、3h、4 h、6 h的改性。

进一步，所述的碳纤维在进行表面改性之后将用过的强氧化剂倒入试剂回收桶内，并用4-6倍碳纤维体积的去离子水反复清洗4-6次，去掉表面残留的试剂。

进一步，所述的碳纤维改性方法为一种碳纤维表面的氧化改性方法。

进一步，所述的碳纤维改性方法主要是利用强氧化剂改性后引入含氧官能团。

进一步，所述的碳纤维在进行氧化改性之后由疏水性变为亲水性，改性后碳纤维表面接触角由无接触角变为80-120°，表面氧官能团由6.32-9.21%增加至16.9-22.32%。

进一步，所述的碳纤维在经过强氧化剂改性之后，碳纤维表面粗糙度增加，比表面积增加至26.23-32.67㎡·g^-1。

进一步，所述的改性碳纤维按照10-20 g/L的加入量投入到培养瓶内，在向其中加入培养基后放入反应器内，进行5-10次多批式连续发酵应用。

进一步，所述的改性碳纤维的应用是通过吸附作用对热带假丝酵母进行固定，且吸附作用由表面上亲水力-亲水力之间的控制和静电相互作用所影响。

进一步，所述的改性碳纤维固定化细胞参与的多批式发酵生产的产品得率比未改性的碳纤维参与的结果提高了5%-15%，固定化效率提高10%以上，至0.94-1.32g/g。原因与改性后的碳纤维的表面极性发生了改变，相对于未改性的碳纤维，表面积性更强，细胞固定化效率更高，细胞活性更强，在连续发酵过程中细胞对底物的消耗更少，发酵效率和产率得以提高。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制本发明。

实施例 1

65% 硝酸改性碳纤维固定化热带假丝酵母发酵木糖醇

将300T级PAN基补强布碳纤维短切为0.5cm，然后利用3倍碳纤维体积的丙酮对其进行索式提取10 h，取出用3倍碳纤维体积的去离子清洗碳纤维表面残留的丙酮，再放入100℃风箱中烘干2 h，一部分留做备用。

将另一部分烘干之后的碳纤维浸泡在2倍体积的65%浓硝酸中3h，然后将用过的浓硝酸倒入酸性试剂回收桶内，并用5倍体积的去离子水反复清洗直至洗涤掉碳纤维表面多余的浓硝酸，最后放入100℃的烘箱中烘干2h后，取出测定性质并备用。结果表明，碳纤维表面接触角为101.2°，表面含氧量为20.51%，比表面积为30.28㎡·g^-1。

改性碳纤维载体固定化细胞的种子培养基：木糖（20g/l），葡萄糖（20g/l），酵母浸粉（10g/l），KH2PO4(3g/L),(NH4)2HPO4(2 g /L)，pH为4.0-5.5。

改性碳纤维载体固定化细胞的发酵培养基：木糖（80g/l），葡萄糖（15g/l），酵母浸粉（8g/l）， MgSO4.7H2O(0.4g/L) , KH2PO4(3 g /L),pH为4.0-5.0。

将未经硝酸改性的碳纤维与硝酸改性后的碳纤维分别按照10g/L的加入量投入到250mL的培养瓶中，并加入50mL 发酵培养基，然后再121℃的高温下灭菌20min。

灭菌后于无菌环境下接种热带假丝酵母6%。最后放入180rpm、30℃的反应器中每48h为一批进行多批次发酵。其中每批次发酵结束时需进行换液：在第一批发酵结束时保留固定有细胞的改性碳纤维载体及约20%的发酵液，同时加入新配制的补液进行第二批的发酵。同样在第二批发酵结束时再次保留固定有细胞的改性碳纤维载体及约20%的发酵液，加入新配制的补液进行第三批的发酵。以此类推进行多批发酵，并对发酵产率和固定化效率进行检测。

在进行了8批次连续发酵生产木糖醇的验证后得出，未改性碳纤维固定化细胞的木糖醇的发酵产率达65.7%，木糖醇平均生成速率为0.87 g/h L，固定化细胞效率为1.02g/g；而改性后的碳纤维发酵产率、木糖醇平均生成速率和固定化细胞效率分别提高了13%，18%和11%，分别达到了74.6%，为1.04 g/h L，为1.13 g/g。

实施例 2

30% 双氧水改性碳纤维固定化克雷伯氏菌发酵丁二酸

将300T级的PAN基6 k碳纤维短切为0.5cm，然后利用5倍碳纤维体积的丙酮对其进行索式提取10 h，用去离子水清洗之后烘干。

将烘干之后的碳纤维浸泡在2倍体积的30%的双氧水中6h，然后将用过的双氧水倒入试剂回收桶内，并用6倍体积的去离子水反复清洗直至洗涤掉碳纤维表面多余的双氧水，最后放入100℃的烘箱中烘干2h后，取出测定性质并备用。

种子培养基：葡萄糖10 g，酵母粉5 g， K2HPO4 3 g，NaCl 0.1 g，CaCl2 0.5 g，MgCl2 0.5g ，pH7.0，121℃，灭菌15 min。。

发酵培养基：葡萄糖100 g，酵母膏15 g，NaHCO3 15 g，Na2HPO4 0.5 g，NaH2PO4 9.6 g，K2HPO4 5 g，NaCl 0.5 g，pH 7.0，121℃，灭菌15 min。

将上述改性处理后的碳纤维按照10g/L的加入量投入到250mL的培养瓶中，并加入50mL 发酵培养基，接种量为10%，培养温度为37℃，pH 值自然，转速150rpm，发酵周期72 h。

发酵结果表明，改性后的碳纤维载体固定化克雷伯氏菌的固定化效率提高了15%，发酵产丁二酸产率提高了12%。在进行了7批次连续发酵生产丁二酸的验证，固定化效率不降低，且发酵结果无显著下降，平均发酵产率达53.2%，丁二酸平均生成速率为0.72 g/h L，固定化细胞效率为1.03 g/g。

Claims (7)

1.一种改善碳纤维表面亲水性的方法及应用，其特征在于，具体步骤如下：

（1）碳纤维的表面清洗：将碳纤维利用3-5倍碳纤维体积的有机试剂，然后用4-6倍碳纤维体积的去离子水洗掉残留的有机试剂，烘干备用；

（2）碳纤维表面改性：将表面清洗后的碳纤维浸泡在3-5倍碳纤维体积的强酸或高浓度的双氧水等强氧化剂中0.5-6 h，然后将强氧化剂倒入试剂回收桶内，并用4-6倍碳纤维体积的去离子水清洗掉碳纤维表面残留的试剂，烘干备用；

（3）改性碳纤维的应用：将改性后的碳纤维按照5-25g/L的加入量加入到培养瓶内，加入培养液并接种后进行多批式发酵生产。

2.根据权利要求1所述的碳纤维改性方法，其特征在于，所使用的碳纤维为布状或束状的200T、300T、700T级的PAN基碳纤维。

3.根据权利要求1-2所述的碳纤维改性方法，其特征在于，所使用的碳纤维是利用3-5倍碳纤维体积的浓度为62%-78%的浓硝酸、浓硫酸或25-40%的双氧水等进行0.5h、1h、2 h、3h、4 h、6 h的浸泡以达到改性的目的。

4.根据权利要求1-3所述的碳纤维改性方法，其特征在于，所使用的碳纤维在进行强氧化剂改性之后极性明显增强，碳纤维改性前后其表面接触角由接近0°变化为80-120°，表面氧官能团由6.32-9.21%增加至16.9-22.32%。

5.根据权利要求1-4所述的碳纤维改性方法，其特征在于，所使用的碳纤维在经过强氧化剂改性之后，碳纤维表面粗糙度增加，比表面积增加至26.23-32.67㎡·g^-1。

6.根据权利要求1-5所述的碳纤维改性方法及应用，其特征在于，所使用的改性碳纤维具体是按照10-20g/L的加入量投入到培养瓶中，在向其中加入发酵培养基后放入反应器内可实现5-10批次细胞固定化多批式发酵生产。

7.根据权利要求1和6所述的改性碳纤维的应用，其特征在于，细胞固定化多批式发酵生产中产率比未改性的碳纤维提高了5%-15%，固定化效率提高至0.94-1.32g/g。