CN106146862B - 一种抗菌性的超分子杂合水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种具有优良抗菌性的超分子杂合水凝胶及其制备方法和应用。这种超分子杂合水凝胶的制备方法包括:以Fmoc‑Glu‑OMe为凝胶因子,在超声的作用下,与硝酸银和壳聚糖发生共组装形成了澄清透明的超分子杂合水凝胶。该水凝胶中原位合成了尺寸均匀,成单分散性银纳米粒子。Fmoc‑Glu‑OMe、银纳米粒子与壳聚糖三种组分的协同作用大大提高了本发明的抗菌性。本发明具有自愈合、可注射、可涂抹等性能;制备方法简单,成本低廉,可商品化;制备过程中没有添加任何还原剂与分散剂,超声原位合成银纳米粒子,绿色环保。本发明的超分子杂合水凝胶各组分通过协同作用,使复合材料的抗菌性显著提高,在抗菌材料与促进伤口愈合领域有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及超分子水凝胶领域,尤其涉及以Fmoc-Glu-OMe为水凝胶因子,超声原位合成银纳米粒子,并加入壳聚糖,与氨基酸共组装形成一种抗菌的超分子杂合水凝胶的制备方法及应用。
背景技术
尽管医药技术发展迅猛,然而在世界范围内每年有数百万的人饱受由细菌引发的传染性疾病的折磨。此外,细菌对传统抗菌剂的耐药性日益增长,由细菌引发的传染性疾病问题仍然是亟待解决的重要健康问题。因此,设计与发展新型的抗菌剂就变得越来越重要了,尤其是在生物医药化学领域(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2006,103,15997-16002)。抗菌剂(Antimicrobial agent)是一种能够有效抑制某些微生物生长繁殖的材料。近年来,抗生素等抗菌剂的长期使用,使细菌对抗菌剂产生耐药性,因此一些细菌已经很难用抗生素杀死。研究持久而广谱,高效又安全的新型抗菌材料越来越受到研究者们的关注。
超分子水凝胶(Supramolecular hydrogels)即小分子水凝胶,是分散在水中的小分子通过非共价键的作用自组装形成的具有三维网状结构的凝胶。它具有良好的生物相容性与生物降解能力,常常用于组织工程的支架,创伤修复,药物输送,生物传感等。目前越来越多的研究者关注其作为抗菌剂的应用(Chem.Commun.,2005,35,4414-4416)。水凝胶作为抗菌剂具有吸收伤口渗出物、杀菌、保湿、促进伤口的愈合的作用。设计具有理想的抗菌性和生物相容性的超分子水凝胶复合材料对杀死细菌与促进伤口的愈合具有非常重要的意义。
银及其化合物是最常见的抗菌剂之一,具有广谱抗菌性,对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌等都有良好的抗菌作用。而银纳米粒子(Sliver nanoparticles)可控性好,能够长时间释放银离子,能很好地实现特殊的表面功能化。大量研究表明,银纳米粒子的抗菌性比银离子的抗菌性能好。又由于银纳米粒子的杀菌机理有所不同,并且与其他的普通的抗菌剂相比,到目前为止还没有任何报道有任何细菌对其有耐药性,因此银纳米粒子作为有效的抗菌剂的应用越来越受到人们的关注(Chem.Soc.Rev.,2014,43,1501-1518)。银纳米粒子的合成方法有很多种,包括化学还原法、光化学还原法、电化学还原法、超声还原法、微波法、紫外辐射法等等(Advances in Colloid and Interface Science,2009,145,83-96)。其中超声还原法非常便捷,成本低廉,适于大规模生产,无需添加任何的还原剂与稳定剂等有毒的化学试剂,绿色环保。
目前有很多文献和专利都报道了以银纳米粒子凝胶作为抗菌剂,但大都是分散不均匀,团聚现象较严重,抗菌性能受到严重影响(中国发明专利公开说明书CN102218155A);或者在制备银纳米粒子时,使用了毒性较大的化学试剂,细胞毒性较大,生物相容性相对较差(中国发明专利公开说明书CN101664563A);或者制备工艺比较复杂,生产成本较高,难以规模化应用(中国发明专利公开说明书CN102698313A)。
壳聚糖(Chitosan)是一种亲水性的高分子聚合物,由甲壳素脱N-乙酰基得到,是具有生物相容性且能被生物降解的聚电解质,具有广泛的生物医药和工业用途(Biomacromolecules,2003,4,1457-1465)。壳聚糖有良好的广谱抗菌活性,能抑制一些真菌、细菌和病毒的生长繁殖。同时,壳聚糖具有促进血液凝固的作用,可用作止血剂。它还可用于伤口填料物质,具有灭菌、吸收伤口渗出物、不易脱水收缩等作用,能够有效促进伤口的愈合。壳聚糖也具有良好的吸湿、保湿、调理、抑菌等功能,还常用于化妆品。此外,壳聚糖具有增稠剂的作用,可以增强复合材料的机械强度。
利用上述原理,我们成功制备出以Fmoc-Glu-OMe为水凝胶因子,通过超声作用形成超分子水凝胶,并在水凝胶中原位合成了银纳米粒子,壳聚糖的加入与氨基酸共组装,将氨基酸凝胶的纳米纤维变成其它纳米结构,增强了水凝胶的机械强度,又能达到增强杀菌性能与促进伤口愈合的目的。本发明制备过程操作简便,成本低,适于大规模生产。实验结果表明,该超分子杂合水凝胶有望在抗菌剂与伤口愈合方面的应用等领域有很好的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有优良抗菌性的杂合超分子水凝胶的制备方法及其应用,该超分子水凝胶是澄清透明的水凝胶,具有自愈合性、可注射、可涂抹的性能,在抗菌剂与伤口愈合方面的有良好的应用前景。
本发明中的抗菌性的超分子杂合水凝胶的制备,包括以下步骤:
(1)配制一定浓度的Fmoc-Glu-OMe储备溶液;
(2)配制一定浓度的硝酸银储备溶液;
(3)配制一定浓度的壳聚糖储备溶液;
(4)将一定量的各组分储备溶液混合摇匀,超声即得所述的超分子杂合水凝胶。
上述的制备方法步骤(1)中,所述的Fmoc-Glu-OMe储备溶液的溶剂为二甲基亚砜,并超声分散0.5~1min,使Fmoc-Glu-OMe固体粉末完全溶解,Fmoc-Glu-OMe储备溶液的浓度为100mg/mL。
上述的制备方法步骤(2)中,所述的硝酸银储备溶液的溶剂为超纯水,硝酸银储备溶液的浓度为1~4mmol/L,配制硝酸银储备溶液的过程中避光处理。
上述的制备方法步骤(3)中,所述的壳聚糖储备溶液的溶剂为超纯水,壳聚糖储备溶液的浓度为10~20mg/mL,并加入体积比为1%冰乙酸促进壳聚糖的溶解。
上述的制备方法步骤(4)中,取20~40μL的Fmoc-Glu-OMe储备溶液加入至洗净吹干的5.0mL避光处理的螺口瓶中,快速加入480~490μL的硝酸银储备溶液,迅速摇匀,再加入480~490μL的壳聚糖储备溶液,配成1.0mL的混合溶液,迅速振荡摇匀。然后将混合液超声30~60min,即可形成超分子杂合水凝胶,超声过程中注意控制水温不宜过热。
本发明使用的水凝胶因子为Fmoc-Glu-OMe,是通过非共价键自组装得到的,Fmoc-Glu-OMe水凝胶呈纳米纤维网络结构。该水凝胶在超声的作用下,原位合成尺寸均匀,成单分散性银纳米粒子。另外,壳聚糖与氨基酸共组装,增强了水凝胶的机械强度与抗菌性。
有益效果
(1)本发明制备的超分子杂合水凝胶,生物相容性好,易降解,无细胞毒性。
(2)本发明制备的超分子杂合凝胶是澄清透明的水凝胶,具有适合的硬度,弹性和粘性,非常适合皮肤涂抹,易于注射,且注射后迅速转变为凝胶态,为自愈合凝胶。
(3)本发明制备过程中没有添加任何还原剂与分散剂,通过超声原位合成银纳米粒子,绿色环保,并且合成的银纳米粒子尺寸均匀,成单分散性。
(4)本发明加入的壳聚糖可以和氨基酸发生共组装,增强了水凝胶的机械强度与抗菌性,更易于涂抹,便于皮肤的吸收,使其更适于作伤口敷料。
(5)本发明制备方法简单,成本低廉,可商品化,适于大规模生产。
(6)本发明制备的超分子杂合水凝胶有良好的抗菌性,能有效促进伤口愈合,将会在抗菌剂与伤口敷料方面(如创可贴、绷带等有很好的应用前景。
附图说明
图1为Fmoc-Glu-OMe超分子水凝胶(左)、Fmoc-Glu-OMe@AgNPs超分子水凝胶(中)、本发明实施例1中超分子杂合水凝胶(右)的扫描电子显微镜(SEM)图;
图2为Fmoc-Glu-OMe@AgNPs超分子水凝胶的透射电子显微镜(TEM)图;
图3为本发明实施例1中超分子杂合水凝胶的扫描透射电子显微镜(STEM)图;
图4为Fmoc-Glu-OMe超分子水凝胶(左)、本发明实施例1中超分子杂合水凝胶(右)的原子力显微镜(AFM)图;
图5分别为本发明实施例1中超分子杂合水凝胶的数码照片图(左)、震荡摇散后的数码照片图(中)和静置10分钟后自愈合的数码照片图(右);
图6为本发明实施例1中超分子杂合水凝胶的X射线光电子能谱分析(XPS)图;
图7分别为1-5号液体培养基中的菌液接种固体培养基上12h后细菌生长状况的数码照片图;
图8为用光学显微镜将图7放大50倍后的数码照片图;
图9分别为体重大小相似的老鼠在涂抹本发明实施例2中超分子杂合水凝胶(左列)、涂抹商用的抗菌剂(中列)和对伤口不做任何处理(右列),四天后伤口愈合情况对比的数码照片图。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下文将结合说明书附图和具体的实施例对本发明作更全面细致地描述,但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。
实施例1
称取10.0mg的Fmoc-Glu-OMe固体粉末,溶于100μL二甲基亚砜,超声分散1min,使其完全溶解,制得浓度为100mg/mL的Fmoc-Glu-OMe储备溶液;称取20.0mg的硝酸银于棕色避光的离心管中,加入1.0mL的超纯水将其溶解,取少许硝酸银溶液于用锡箔纸避光处理的15mL试管中,加一定量超纯水稀释,配成2mmol/L的硝酸银水溶液作为硝酸银储备溶液;称取80mg的壳聚糖,加入8.0mL的超纯水将其溶解,再加入体积比为1%的冰乙酸以促进壳聚糖的溶解,配成10mg/mL的壳聚糖储备溶液。
取20μL的Fmoc-Glu-OMe储备溶液加入至洗净吹干避光处理的5.0mL螺口瓶中,快速加入490μL的硝酸银储备溶液,迅速摇匀,再加入490μL的壳聚糖储备溶液,迅速振荡摇匀。将该螺口瓶放入超声清洗器中超声一小时后即可形成澄清透明的超分子杂合水凝胶。
抗菌实验步骤:称取10.0g胰蛋白胨、5.0g酵母提取物和10.0g氯化钠于烧杯中,向烧杯中加入超纯水溶解,用玻璃棒搅拌促进溶解,用氢氧化钠调节混合液pH至7.4,然后用超纯水定容至1L的锥形瓶中制备液体培养基。
称取10.0g胰蛋白胨、5.0g酵母提取物、10.0g氯化钠和15.0g琼脂,向烧杯中加入超纯水溶解,用玻璃棒搅拌促进溶解,用氢氧化钠调节混合液pH至7.4,然后用超纯水定容至1L的锥形瓶中制备液体培养基。
将配制好的培养基,用棉花塞紧瓶口,用纱布包紧,再用锡箔纸包住,棉线系紧。密封好后经110℃高压灭菌30分钟。将5支15mL的离心管分别编号1-5,将4℃冰箱中冻存的大肠杆菌(革兰氏阴性细菌)菌液取出,于无菌操作台,分别吸取100μL菌液,加入5支离心管。1号离心管中加入1.0mL的实例1中的超分子杂合凝胶,再加入8.9mL的液体培养基;2号离心管中加入1.0mL Fmoc-Glu-OMe@AgNPs水凝胶,再加入8.9mL的液体培养基;3号离心管中加入1.0mL Fmoc-Glu-OMe@壳聚糖水凝胶,再加入8.9mL的液体培养基;4号离心管中加入1.0mL Fmoc-Glu-OMe水凝胶,再加入8.9mL的液体培养基;5号离心管中加入1.0mL超纯水,再加入8.9mL的液体培养基;摇匀后置于37℃恒温空气震荡培养箱培养2小时。取5个灭菌过的玻璃培养皿,分别编号1-5,将固体培养基加热融化,摇匀,在冷却未凝固前,分别倒入5个培养皿,每个倒20mL。从离心管中取10μL菌液,将其接种至固体培养基,待基底凝固后翻转过来,置于37℃恒温空气震荡培养箱培养12小时以形成菌落,取出拍照,并在显微镜下观察。
实施例2
取上述实施例1中的Fmoc-Glu-OMe储备溶液20μL,加入至洗净吹干避光处理的5.0mL螺口瓶中,快速加入490μL与实施例1配制方法相同的4mmol/L硝酸银储备溶液,迅速摇匀,再加入490μL与实施例1配制方法相同的20mg/mL的壳聚糖储备溶液,迅速振荡摇匀。将该螺口瓶放入超声清洗器中超声一小时后即可形成澄清透明的超分子杂合水凝胶。
老鼠实验步骤:选用老鼠模型以研究本发明的超分子杂合水凝胶对伤口治愈的作用。整个实验于湘雅医学院完成,实验所用的6只老鼠是雄性,SD大鼠,质量大约为260g,用以评价本发明对伤口的治疗效果。先将老鼠称重,用10%的水合氯醛麻醉(按每百克体重0.3mL,腹腔注射)将老鼠麻醉,刀片将鼠背部的毛刮去,再用刀片分别割一个长2cm的十字形伤口。将大鼠分成三组:实验组(用制得的新型银纳米粒子-壳聚糖-谷氨酸水凝胶复合物抗菌材料处理伤口、对照组(用商用的银纳米粒子抗菌剂处理伤口)和空白组(对伤口不进行任何处理),处理后分别单独关入笼子,提供等量的食物与水,拍照记录,连续观察饲养七天,每天更换垫料、水和食物并对老鼠的伤口愈合情况进行拍照记录。
以上显示和描述了本发明的制备过程、主要特征和本发明的应用。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制。本发明要求保护范围由所附的权利要求书界定。
Claims (4)
1.一种抗菌性的超分子杂合水凝胶的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:用二甲基亚砜溶解Fmoc-Glu-OMe固体粉末,超声分散得到Fmoc-Glu-OMe储备溶液;用超纯水避光溶解硝酸银晶体,配成硝酸银储备溶液;用超纯水溶解壳聚糖粉末,加入冰乙酸以促进壳聚糖的溶解,配成壳聚糖储备溶液;取20~40μL的Fmoc-Glu-OMe储备溶液加入至洗净吹干的5.0mL避光处理的螺口瓶中,快速加入480~490μL的硝酸银储备溶液,迅速摇匀,再加入480~490μL的壳聚糖储备溶液,配成1.0mL的混合溶液,迅速振荡摇匀,将螺口瓶放入超声清洗仪中超声30~60min后取出,超分子杂合水凝胶即可形成。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述的用二甲基亚砜溶解Fmoc-Glu-OMe固体粉末,超声分散的时间为0.5~1min,所得Fmoc-Glu-OMe储备溶液浓度为100~120mg/mL;所述硝酸银储备溶液的浓度为1~4mmol/L,壳聚糖储备溶液的浓度为10~20mg/mL,加入体积比为1%冰乙酸。
3.一种如权利要求1所述的制备方法制备得到的超分子杂合水凝胶,该超分子杂合水凝胶是由Fmoc-Glu-OMe凝胶因子通过非共价键自组装得到的澄清透明的水凝胶,具有自愈合性、可注射、可涂抹的性能。
4.一种由权利要求1所述制备方法合成的超分子杂合水凝胶在抗菌剂和伤口敷料中的应用。
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