CN114381015A - 一种可注射和自修复的水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种可注射和自修复的水凝胶及其制备方法和应用，由改性壳聚糖和连接有Fmoc的功能性短肽复合而成，所述改性壳聚糖为Fmoc‑甘氨酸接枝官能化的壳聚糖；所述连接有Fmoc的功能性短肽为Fmoc与功能性氨基酸序列连接形成的短肽。本发明利用多巴上儿茶酚基团的自聚合及其与功能性短肽可逆的非共价键作用获得一种可注射和自修复水凝胶，该水凝胶可作为载药材料、细胞培养材料或组织工程支架，通过微创手术注射至脊髓损伤部位，可促进脊髓损伤的修复，具有十分广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种可注射和自修复的水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
水凝胶是一种由亲水性聚合物链组成并通过物理交联或化学交联而形成的材料。水凝胶具有优越的生物相容性以及和生物组织的相似性，在生物医用材料中如药物控制释放、组织工程修复、生物仿生等领域发挥着越来越大的作用。基于动态化学的自愈性水凝胶是近来备受关注的一种自愈性材料，由具有动态特性的交联网络构建形成交联作用为动态化学键，即非共价键，如弱相互作用的氢键、分子间作用力(范德华力)、配位作用、亲疏水作用等，或可逆共价键，如温和条件下可逆的亚胺键、双硫键、酰腙键等。这种材料具有本征性的自愈性，一方面可应对外界破坏造成的损伤，进行自我修复；另一方面动态化学键对多种环境刺激具有响应性，能自我调节以适应环境变化。
中国发明专利公开了一种可自修复壳聚糖水凝胶及其制备方法，在壳聚糖水凝胶高分子链段中引入硫脲基团和脲基团等氢键基团，依靠分子内或分子间氢键的断裂和重组实现材料的自我修复，虽然该壳聚糖水凝胶材料具有较好的自修复功能，但是该水凝胶在引入基团的过程中也导致有毒物质的引入，使该壳聚糖水凝胶具有低毒性，其安全性存在问题。
可注射水凝胶具有无创或微创植入的优点，可作为不规则形状损伤的修复材料，避免大型手术带来的风险。中国发明专利公开了一种可注射多肽水凝胶，但是该水凝胶仅仅由多肽自组装形成，其力学性能和机械稳定性较低，且不具有自我修复的能力。植入体内的水凝胶如果受到外在的机械作用产生裂纹，那么材料内部结构的规整性和功能的完整性极容易遭到破坏，破损的凝胶基质若进入体液则很容易引起排异反应，引发炎症风险。若水凝胶具有自修复性能，在被外力损坏之后能够自发的重新结合为一个整体，那将会有更大的应用价值。现有研究中，未见利用多肽制备可注射和自修复水凝胶的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有多肽水凝胶的缺陷和不足，提供一种可注射和自修复的水凝胶及其制备方法和应用，本发明通过化学合成方法将Fmoc-甘氨酸接枝在壳聚糖分子上制备改性壳聚糖，再将改性壳聚糖与Fmoc功能性短肽复合制备水凝胶，利用改性壳聚糖分子上的Fmoc的苯环与短肽苯环间动态可逆的π-π共轭作用，形成获得一种可注射和自修复的水凝胶，该水凝胶能够改善局部微环境，为神经再生提供细胞外基质支撑，可有效提高脊髓损伤后的修复能力。
本发明的目的是提供一种可注射和自修复的水凝胶。
本发明另一目的是提供一种可注射和自修复的水凝胶的制备方法。
本发明另一目的是提供可注射和自修复的水凝胶在细胞3D培养和修复脊髓损伤中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种可注射和自修复的水凝胶，由改性壳聚糖和连接有Fmoc的功能性短肽复合而成，所述改性壳聚糖为Fmoc-甘氨酸接枝官能化的壳聚糖；所述连接有Fmoc的功能性短肽为Fmoc与功能性氨基酸序列连接形成的短肽。
本发明的水凝胶通过Fmoc-甘氨酸接枝反应对壳聚糖进行官能化改性，并设计一类连接有Fmoc的功能性短肽，通过连接有Fmoc的功能性短肽与Fmoc改性壳聚糖形成动态可逆的π-π共轭非共价键，这种非共价键，使得水凝胶的交联点处于动态的“结合-解离”状态，从而使水凝胶同时具备可注射性和自修复性。
优选地，所述连接有Fmoc的功能性短肽的Fmoc与功能氨基酸序列之间含有1～3个带正电荷的氨基酸。
优选地，所述带正电荷的氨基酸为赖氨酸和/或精氨酸。
进一步优选地，所述功能性氨基酸序列包括：可促进神经细胞黏附的氨基酸：精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(RGD)、酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸(YIGSR)；可促轴突生长的功能性氨基酸序列异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸(IKVAV)。
优选地，所述水凝胶pH为6～8。
进一步优选地，所述水凝胶pH为6～7。
最优选地，所述水凝胶pH为7。
一种可注射和自修复的水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.改性壳聚糖的制备
在惰性气体氛围中，将N-羟基琥珀酰亚胺钠(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的二甲基亚砜(DMSO)混合溶液与Fmoc-甘氨酸(Fmoc-G)的二甲基亚砜(DMSO)溶液充分混合，然后再与壳聚糖的酸溶液充分混合，调整混合溶液的pH值至5.5～6，充分反应；透析、干燥即得改性壳聚糖；也即Fmoc-甘氨酸接枝官能化的壳聚糖。
S2.功能性短肽的制备
将Fmoc与功能性氨基酸序列连接制备连接有Fmoc的功能性短肽。
S3.可注射和自修复的水凝胶的制备
将步骤S1制备的改性壳聚糖和步骤S2制备的连接有Fmoc的功能性短肽溶解、混合，然后将混合溶液注射至缓冲溶液或细胞培养基即得。
优选地，步骤S1所述壳聚糖、NHS、EDC与Fmoc-甘氨酸的摩尔比为1：4～8：4～8：1～4。
进一步优选地，步骤S1所述壳聚糖、NHS、EDC与Fmoc-甘氨酸的摩尔比为1：6～8：6～8：1～2。
最优选地，步骤S1所述壳聚糖、NHS、EDC与Fmoc-甘氨酸的摩尔比为1：6：6：2。
优选地，步骤S1所述壳聚糖的酸溶液是将壳聚糖溶于0.1MHCl中得到。
优选地，步骤S1所述充分反应是在20～30℃反应24h；所述透析的时间是1～3天；所述透析是利用去离子水在截留分子量为3000～4000的透析袋中进行。
优选地，步骤S1所述干燥的条件为压强45～55Pa，温度-45～-65℃，时间为48～72h。
进一步优选，步骤S1所述冷冻干燥条件的为压强50Pa，温度-50℃，时间为72h。
优选地，步骤S1所述惰性气体为氮气或氦气。
优选地，步骤S2所述连接有Fmoc的功能性短肽的Fmoc与功能氨基酸序列之间含有1～3个天冬氨酸和/或谷氨酸。
优选地，步骤S3所述溶解是将改性壳聚糖与功能性短肽分别溶解于去离子水中。
优选地，步骤S3所述混合溶液的改性壳聚糖溶液与功能性短肽溶液的体积比为1：0.5～2。
进一步优选地，步骤S3所述混合溶液的改性壳聚糖溶液与功能性短肽溶液的体积比为1：1～2。
最优选地，步骤S3所述混合溶液的改性壳聚糖溶液与功能性短肽溶液的体积比为1：1。
优选地，步骤S3所述混合溶液pH为6～8。
进一步优选地，步骤S3所述混合溶液pH为7～8。
最优选地，步骤S3所述混合溶液pH为7。
优选地，步骤S3所述改性壳聚糖溶液与功能性短肽溶液浓度分别为5～100mg/mL。
进一步优选地，步骤S3所述改性壳聚糖溶液的浓度为90～100mg/mL；所述功能性短肽溶液浓度为5～20mg/mL。
最优选地，步骤S3所述改性壳聚糖溶液的浓度为100mg/mL；所述功能性短肽溶液浓度为10mg/mL。
所述可注射和自修复水凝胶在作为载药材料中的应用也在本发明的保护范围之内。
优选地，所述应用是将药物与所述改性壳聚糖和功能性短肽复合的溶液混合，静置20～60min，形成水凝胶，实现药物装载。
所述可注射和自修复水凝胶在作为细胞培养材料中的应用也在本发明的保护范围之内。
优选地，所述应用是将所述改性壳聚糖和功能性短肽复合形成的水凝胶作为基底，将细胞悬液种植在水凝胶基底上，待培养2～6h细胞贴壁后加入大量细胞培养基进行培养。
所述可注射和自修复水凝胶在制备脊髓损伤修复材料中的应用。
优选地，所述应用是将所述改性壳聚糖溶液和功能性短肽溶液复合的溶液注射至脊髓损伤后的缺损部位，原位形成水凝胶，作为人工细胞外基质支持神经再生。
本申请Fmoc接枝官能化的壳聚糖即为改性壳聚糖。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明利用Fmoc-甘氨酸接枝反应进行壳聚糖官能化改性，通过Fmoc基团的苯环与连接有Fmoc的功能性短肽的苯环形成动态可逆的π-π共轭非共价键，获得力学性能和机械稳定性更强的可注射、同时自修复的水凝胶，该水凝胶可作为载药材料；也可与培养基混合，作为细胞3D培养的基质；同时，可作为组织工程材料通过微创手术注射于损伤部位，改善脊髓损伤后的局部微环境，为神经再生提供细胞外基质支撑，提高脊髓损伤后的修复能力，具有广阔的应用前景和应用价值；同时，该水凝胶制备条件简单、成本低，避免了有毒添加剂使用残留导致的有害影响，生物安全性更高。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的水凝胶观察结果图；其中A为水凝胶可注射图，B为水凝胶扫描电镜图。
图2为本发明实施例1制备的水凝胶自修复效果图；其中的1为两块完整的水凝胶，2为分别被切成三块的水凝胶块，3和4为被切开的水凝胶块挤压后重新形成整体的水凝胶。
图3为本发明实施例8背根节神经在水凝胶上培养7天后的形貌图；红色：S100(雪旺细胞)，绿色：NF200(神经纤维)，蓝色：DAPI(细胞核)。
图4为本发明实施例9脊髓横断处矢状切片免疫荧光染色结果；NF200为神经纤维，GFAP为星型胶质细胞。
图5为本发明对比例改性壳聚糖溶液注射至PBS后的效果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
抗体NF200 Sigma(美国)；抗体GFAP Sigma(美国)。
实施例1 水凝胶的制备
1.改性壳聚糖的制备
在N2氛围中，将壳聚糖溶于100毫升0.1M的HCl中，制成终浓度4mM的溶液；将N-羟基琥珀酰亚胺钠(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶于10毫升二甲基亚砜(DMSO)，浓度分别为24mM，Fmoc-甘氨酸(Fmoc-G)溶于40毫升DMSO中，浓度为8mM。按照壳聚糖、NHS、EDC与Fmoc-甘氨酸的摩尔比为1：6：6：2，将NHS和EDC的混合溶液加入Fmoc-G溶液中搅拌30分钟，然后将所得混合溶液逐滴加入壳聚糖溶液，调整所得混合溶液的pH至6，25℃反应24h，整个过程维持在N2氛围中。将反应物装入截留分子量为3000的透析袋中，以去离子水为透析液透析3天，取截留液冷冻干燥，即得改性壳聚糖，也即Fmoc-甘氨酸接枝官能化壳聚糖。所述冷冻干燥条件为压强50Pa，温度-50℃，时间为72h。
2.功能性短肽Fmoc-RIKVAV的制备
利用短肽合成仪将Fmoc与功能性氨基酸序列IKVAV连接制得Fmoc-RIKVAV。
3.改性壳聚糖/功能性短肽Fmoc-RIKVAV复合的水凝胶的制备
将步骤1制备的改性壳聚糖和步骤2制备的功能短肽Fmoc-RIKVAV分别溶于去离子水中，制备得到浓度为100mg/mL的改性壳聚糖溶液，浓度为10mg/mL的功能短肽Fmoc-RIKVAV溶液混合，将两溶液以体积比为1:1混合，调节混合溶液的pH至7，然后注射至PBS后形成水凝胶。
实施例2 水凝胶的制备
1.改性壳聚糖的制备
在N2氛围中，将壳聚糖溶于100毫升0.1M的HCl中，制成终浓度4mM的溶液；将N-羟基琥珀酰亚胺钠(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶于10毫升二甲基亚砜(DMSO)，浓度分别为24mM，Fmoc-甘氨酸(Fmoc-G)溶于40毫升DMSO中，浓度为8mM。按照壳聚糖、NHS、EDC与Fmoc-甘氨酸的摩尔比为1：4：4：1，将NHS和EDC的混合溶液加入Fmoc-G溶液中搅拌30分钟，然后将所得混合溶液逐滴加入壳聚糖溶液，调整所得混合溶液的pH至6，25℃反应24h，整个过程维持在N2氛围中。将反应物装入截留分子量为3000的透析袋中，以去离子水为透析液透析3天，取截留液冷冻干燥，即得改性壳聚糖，也即Fmoc-甘氨酸接枝官能化壳聚糖。所述冷冻干燥条件为压强50Pa，温度-50℃，时间为72h。
2.功能性短肽Fmoc-RIKVAV的制备
利用短肽合成仪将Fmoc与功能性氨基酸序列IKVAV连接制得Fmoc-RIKVAV。
3.改性壳聚糖/功能性短肽Fmoc-RIKVAV复合的水凝胶的制备
将步骤1制备的改性壳聚糖和步骤2制备的功能短肽Fmoc-RIKVAV分别溶于去离子水中，制备得到浓度为100mg/mL的改性壳聚糖溶液，浓度为10mg/mL的功能短肽Fmoc-RIKVAV溶液混合，将两溶液以体积比为1:1混合，调节混合溶液的pH至6，然后注射至PBS后形成水凝胶。
实施例3 水凝胶的制备
1.改性壳聚糖的制备
在N2氛围中，将壳聚糖溶于100毫升0.1M的HCl中，制成终浓度4mM的溶液；将N-羟基琥珀酰亚胺钠(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶于10毫升二甲基亚砜(DMSO)，浓度分别为24mM，Fmoc-甘氨酸(Fmoc-G)溶于40毫升DMSO中，浓度为8mM。按照壳聚糖、NHS、EDC与Fmoc-甘氨酸的摩尔比为1：8：8：4，将NHS和EDC的混合溶液加入Fmoc-G溶液中搅拌30分钟，然后将所得混合溶液逐滴加入壳聚糖溶液，调整所得混合溶液的pH至6，25℃反应24h，整个过程维持在N2氛围中。将反应物装入截留分子量为3000的透析袋中，以去离子水为透析液透析3天，取截留液冷冻干燥，即得改性壳聚糖，也即Fmoc-甘氨酸接枝官能化壳聚糖。所述冷冻干燥条件为压强50Pa，温度-50℃，时间为72h。
2.功能性短肽Fmoc-RIKVAV的制备
利用短肽合成仪将Fmoc与功能性氨基酸序列IKVAV连接制得Fmoc-RIKVAV。
3.改性壳聚糖/功能性短肽Fmoc-RIKVAV复合的水凝胶的制备
将步骤1制备的改性壳聚糖和步骤2制备的功能短肽Fmoc-RIKVAV分别溶于去离子水中，制备得到浓度为100mg/mL的改性壳聚糖溶液，浓度为10mg/mL的功能短肽Fmoc-RIKVAV溶液混合，将两溶液以体积比为1:2混合，调节混合溶液的pH至8，然后注射至PBS后形成水凝胶。
实施例4 水凝胶的制备
1.改性壳聚糖的制备
在N2氛围中，将壳聚糖溶于100毫升0.1M的HCl中，制成终浓度4mM的溶液；将N-羟基琥珀酰亚胺钠(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶于10毫升二甲基亚砜(DMSO)，浓度分别为24mM，Fmoc-甘氨酸(Fmoc-G)溶于40毫升DMSO中，浓度为8mM。按照壳聚糖、NHS、EDC与Fmoc-甘氨酸的摩尔比为1：6：6：2，将NHS和EDC的混合溶液加入Fmoc-G溶液中搅拌30分钟，然后将所得混合溶液逐滴加入壳聚糖溶液，调整所得混合溶液的pH至6，25℃反应24h，整个过程维持在N2氛围中。将反应物装入截留分子量为3000的透析袋中，以去离子水为透析液透析3天，取截留液冷冻干燥，即得改性壳聚糖，也即Fmoc-甘氨酸接枝官能化壳聚糖。所述冷冻干燥条件为压强50Pa，温度-50℃，时间为72h。
2.功能性短肽Fmoc-RIKVAV的制备
利用短肽合成仪将Fmoc与功能性氨基酸序列IKVAV连接制得Fmoc-RIKVAV。
3.改性壳聚糖/功能性短肽Fmoc-RIKVAV复合的水凝胶的制备
将步骤1制备的改性壳聚糖和步骤2制备的功能短肽Fmoc-RIKVAV分别溶于去离子水中，制备得到浓度为90mg/mL的改性壳聚糖溶液，浓度为20mg/mL的功能短肽Fmoc-RIKVAV溶液混合，将两溶液以体积比为1:1混合，调节混合溶液的pH至7，然后注射至PBS后形成水凝胶。
实施例5 水凝胶的制备
1.改性壳聚糖的制备
在N2氛围中，将壳聚糖溶于100毫升0.1M的HCl中，制成终浓度4mM的溶液；将N-羟基琥珀酰亚胺钠(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶于10毫升二甲基亚砜(DMSO)，浓度分别为24mM，Fmoc-甘氨酸(Fmoc-G)溶于40毫升DMSO中，浓度为8mM。按照壳聚糖、NHS、EDC与Fmoc-甘氨酸的摩尔比为1：6：6：2，将NHS和EDC的混合溶液加入Fmoc-G溶液中搅拌30分钟，然后将所得混合溶液逐滴加入壳聚糖溶液，调整所得混合溶液的pH至6，25℃反应24h，整个过程维持在N2氛围中。将反应物装入截留分子量为3000的透析袋中，以去离子水为透析液透析3天，取截留液冷冻干燥，即得改性壳聚糖，也即Fmoc-甘氨酸接枝官能化壳聚糖。所述冷冻干燥条件为压强50Pa，温度-50℃，时间为72h。
2.功能性短肽Fmoc-RIKVAV的制备
利用短肽合成仪将Fmoc与功能性氨基酸序列IKVAV连接制得Fmoc-RIKVAV。
3.改性壳聚糖/功能性短肽Fmoc-RIKVAV复合的水凝胶的制备
将步骤1制备的改性壳聚糖和步骤2制备的功能短肽Fmoc-RIKVAV分别溶于去离子水中，制备得到浓度为100mg/mL的改性壳聚糖溶液，浓度为10mg/mL的功能短肽Fmoc-RIKVAV溶液混合，将两溶液以体积比为1:0.5混合，调节混合溶液的pH至7，然后注射至PBS后形成水凝胶。
实施例6 水凝胶的观察
对实施例1～5制备的水凝胶进行观察，实施例1～5制备的水凝胶均可注射且可自修复。将实施例1～5的改性壳聚糖溶液与功能性短肽溶液混合注入PBS后均可以形成连续的水凝胶线；利用扫描电镜观察水凝胶均是多孔结构，孔与孔直接相连；将被切开的水凝胶块挤压后可以重新形成整体的水凝胶，具有自修复功能。
其中实施例1的水凝胶观察结果如图1，图1中A为改性壳聚糖/功能性短肽Fmoc-RIKVAV复合的水凝胶可注射图，从图1的A中可以看出，改性壳聚糖溶液与功能性短肽溶液混合注入PBS后均可以形成连续的水凝胶线；图1中B为改性壳聚糖/功能性短肽Fmoc-RIKVAV复合的水凝胶扫描电镜图，从图1的B中可以看出，水凝胶呈多孔结构，孔与孔直接相连；实施例1的改性壳聚糖/功能性短肽Fmoc-RIKVAV复合的水凝胶自修复效果如图2所示，图2中的1为两块完整的水凝胶，2为分别被切成三块的水凝胶块，3和4为被切开的水凝胶块挤压后重新形成整体的水凝胶，即被切割开的水凝胶可以重新形成整体的水凝胶，说明本发明水凝胶具有自修复的功能。
实施例7 含有姜黄素的水凝胶的制备
1.改性壳聚糖的制备，同实施例1。
2.功能性短肽Fmoc-RIKVAV的制备，同实施例1。
3.含有姜黄素的改性壳聚糖/功能性短肽Fmoc-RIKVAV复合的水凝胶的制备
将步骤1制备的改性壳聚糖和步骤2制备的功能短肽Fmoc-RIKVAV分别溶于去离子水中，配制浓度为10mg/mL的改性壳聚糖溶液和100mg/mL的功能短肽Fmoc-RIKVAV溶液，改性壳聚糖溶液与功能短肽Fmoc-RIKVAV溶液以体积比为1:1混合，调节pH至7，然后加入姜黄素，使姜黄素的最终浓度为10mM，混合均匀，静置40min，注射至PBS后形成含有姜黄素的水凝胶。
实施例8 背根节培养
利用改性壳聚糖/功能性短肽Fmoc-RIKVAV复合的水凝胶培养背根节。
将背根节球种分散于实施例1制备的改性壳聚糖/功能性短肽Fmoc-RIKVAV复合的溶液中，将混合后的溶液注入背根神经球培养基中(在Neurobasal-A基础培养基中，加入2w/v％B27,0.3wt％L-glutamine，100ngmL-1NGF，混合均匀)，形成包裹有背根节的水凝胶。在37℃、5％CO2的培养箱中培养7天固定并染色，利用激光共聚焦显微镜观察。
背根节神经在水凝胶上培养7天后的形貌图如图3所示，从图3可以看出，水凝胶中出现了神经纤维和雪旺细胞，大量的神经纤维和雪旺细胞向神经球外迁移，并且雪旺细胞与神经纤维紧密结合，说明本发明的改性壳聚糖/功能性短肽Fmoc-RIKVAV复合的水凝胶具有良好的细胞安全性，并且能够促进神经生长；本发明的改性壳聚糖/连接有Fmoc的功能性短肽复合的水凝胶可用于背根神经节的三维培养。
实施例9 脊髓损伤修复
利用改性壳聚糖/功能性短肽Fmoc-RIKVAV复合的水凝胶对脊髓损伤进行修复。
构建大鼠脊髓T8至T9全横断(2mm缺损)损伤，将实施例7制备的含有姜黄素的改性壳聚糖/功能性短肽Fmoc-RIKVAV复合的溶液注射至损伤部位即可形成水凝胶。依次缝合硬脊膜、肌肉和皮肤。14天后用4％多聚甲醛溶液灌注动物后取脊髓组织，冰冻切片。以NF200和GFAP作为一抗，在4℃条件下过夜孵育，然后在与荧光标记的二抗室温孵育2h。利用激光共聚焦显微镜拍照并检测脊髓横断处再生神经纤维的分布。
脊髓横断处矢状切片免疫荧光染色结果如图4所示，从图4可以看出再生神经纤维向损伤区域生长；说明本发明的改性壳聚糖/功能性短肽Fmoc-RIKVAV复合的水凝胶具有良好的安全性，并且能够促进神经生长；本发明含有姜黄素的改性壳聚糖/功能性短肽Fmoc-RIKVAV复合的水凝胶可用于脊髓损伤修复。
对比例
利用实施例1的方法制备改性壳聚糖，然后将改性壳聚糖溶于去离子水中，制备成浓度为100mg/mL的改性壳聚糖溶液，调整pH至7，然后将改性壳聚糖溶液注射至PBS中。
改性壳聚糖溶液注射至PBS后的效果如图5所示，从图5可以看出，单独的改性壳聚糖溶液注射至PBS后不能形成连续的水凝胶线，说明单独的改性壳聚糖溶液并不能形成可注射的水凝胶。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种可注射和自修复的水凝胶，其特征在于，由改性壳聚糖和连接有Fmoc的功能性短肽复合而成，所述改性壳聚糖为Fmoc-甘氨酸接枝官能化的壳聚糖；所述连接有Fmoc的功能性短肽为Fmoc与功能性氨基酸序列连接形成的短肽。
2.根据权利要求1所述水凝胶，其特征在于，所述连接有Fmoc的功能性短肽的Fmoc与功能氨基酸序列之间含有1～3个带正电荷的氨基酸。
3.根据权利要求2所述复合水凝胶，其特征在于，所述带正电荷的氨基酸为赖氨酸和/或精氨酸。
4.根据权利要求1～3任一所述水凝胶，其特征在于，所述功能性氨基酸序列包括：促进神经细胞黏附的氨基酸：精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸、酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸；可促轴突生长的功能性氨基酸序列异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸。
5.根据权利要求1～4任一所述水凝胶，其特征在于，所述水凝胶pH为6～8。
6.一种可注射和自修复的水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.改性壳聚糖的制备
在惰性气体氛围中，将N-羟基琥珀酰亚胺钠和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的二甲基亚砜混合溶液与Fmoc-甘氨酸的二甲基亚砜溶液充分混合，然后再与壳聚糖的酸溶液充分混合，调整混合溶液的pH值至5.5～6，充分反应；透析、干燥即得改性壳聚糖；
S2.功能性短肽的制备
将Fmoc与功能性氨基酸序列连接制备连接有Fmoc的功能性短肽；
S3.可注射和自修复的水凝胶的制备
将步骤S1制备的改性壳聚糖和步骤S2制备的连接有Fmoc的功能性短肽溶解、混合，然后将混合溶液注射至缓冲溶液或细胞培养基即得。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤S1所述壳聚糖、N-羟基琥珀酰亚胺钠、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与Fmoc-甘氨酸的摩尔比为1：4～8：4～8：1～4。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤S3所述混合溶液中改性壳聚糖溶液与功能性短肽溶液的体积比为1：0.5～2；所述混合溶液pH为6～8。
9.权利要求6～8任一所述制备方法制备的可注射和自修复的水凝胶。
10.权利要求1～5任一所述水凝胶或权利要求9所述水凝胶在作为载药材料和/或作为细胞培养材料和/或制备脊髓损伤修复材料中的应用。
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| CN202111604925.3A CN114381015A (zh) | 2021-12-24 | 2021-12-24 | 一种可注射和自修复的水凝胶及其制备方法和应用 |
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|---|---|---|---|---|
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