CN106146629A - 一组胰蛋白酶抗性抗菌肽及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一组具有胰蛋白酶抗性的抗菌肽及其制备办法。利用蛋白质定向改造技术，针对NZ2114序列中存在的六处胰蛋白酶活性位点进行有选择突变。设计氨基酸序列为SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：33的胰蛋白酶抗性突变体并实现其在毕赤酵母中的重组表达。本发明首次实现NZ2114抗胰蛋白酶衍生物的设计，经测定部分突变体(尤其是双突变体和全部三突变体)胰蛋白酶降解率显著改善，为16.67％-25％。胰蛋白酶抗性抗菌肽对金黄色葡萄球菌ATCC25923，ATCC43300和ATCC6538具有显著抑菌活性，MIC介于0.25-16μg/ml。本发明所述方法获得的胰蛋白酶抗性抗菌肽可应用于抗菌药物、食品添加剂、化妆品、饲料添加剂等领域，具有广阔的应用价值和市场前景。

Description

一组胰蛋白酶抗性抗菌肽及其制备方法

技术领域

本发明涉及蛋白质工程和基因工程领域，具体涉及系列抗菌肽定向改造和基因工程生产的方法。

背景技术

菌丝霉素Plectasin是Mygind研究组利用从欧洲北部松林中分离出的腐生子囊类真菌Pseudoplectania nigrella构建cDNA文库，通过BLASTX和SSEARCHp序列相似性搜索程序，筛查到的具有高效抗G⁺菌活性抗菌肽。Plectasin基因编码含有95个氨基酸残基的多肽序列，其1～23是信号肽序列，24～55位为前导肽序列，56～95位为成熟肽(Plectasin)序列。Plectasin理论分子量为4407.9Da，具有六个组氨酸(His)和五个赖氨酸(Lys)，在不同pH环境中，由于组氨酸解离状态不同，Plectasin的净电荷数在+1到+3之间变化(Mygind等，Plectasin isa peptide antibiotic with therapeutic potential from a saprophytic fungus.Nature，2005，437(7061)：975-980)。

Plectasin对革兰氏阳性细菌具有强烈杀伤作用。Mygind等研究了Plectasin对130余株不同来源肺炎链球菌的抑制作用，发现对于青霉素敏感或抗性菌株，最小杀菌浓度(MIC)均在0.1-8μg/ml之间，MIC₅₀为1μg/ml。Gottlieb等(2008)研究Plectasin对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)杀菌能力，MIC值介于1和32μg/ml，MIC₅₀为8μg/ml(Gottlieb等，Antimicrobial peptides effectively killa broad spectrum of Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus strainsindependently of origin，sub-type，or virulence factor expression.BMC Microbiol，2008，8(1)：205-214)。此外，Novozymes以Plectasin为母体，经易错PCR构建突变文库，从274个突变体中筛选到抗菌性能大幅提高的突变体NZ2114，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)临床分离菌株平均MIC仅为1μg/ml，并且对耐万古霉素肠球菌(VRSA)也具有很强的抑制作用，MIC值仅为2～4μg/ml。此外，杀菌动力学实验证明，Plectasin具有高效杀菌能力，5×MIC Plectasin在5h内能够杀灭99.9％供试病原菌。小鼠腹腔感染模型显示，10mg/kg Plectasin 5h内杀菌效率相当于70mg/kg万古霉素，腹腔中病原菌数量减少3个数量级(相当于99.9％杀菌效率)。7天后对照组小鼠全部死亡，按10mg/kg Plectasin给药的小鼠存活率依给药频度不同介于80～100％。NZ2114在兔心内膜炎感染模型中的治疗效果也得到相似结论，10mg/kg NZ2114即可大于或等于15mg/kg万古霉素或12mg/kg达托霉素疗效，3天后相关脏器(肾脏，脾脏)中病原菌的数量减少99％以上(Xiong等，Efficacy of NZ2114，a novel plectasin-derived cationic antimicrobial peptideantibiotic，in experimental endocarditis due to methicillin-resistant Staphylococcusaureus.Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2011，55(11)：5325-5330)。

在胃肠道主要消化酶中，plectasin和NZ2114对胃蛋白酶具有良好的稳定性，在胃蛋白酶中孵育4h几乎不产生降解。但是，其对胰蛋白酶非常敏感，与胰蛋白酶孵育后活性几乎全部丧失。分析表明，NZ2114序列中存在6处胰蛋白酶切割位点，分别为R14，K20，K23，K26，K32，K38，这些位点的存在严重影响NZ2114胰蛋白酶稳定性，制约其口服治疗和作为添加剂的使用效果。目前，未见有关于NZ2114胰蛋白酶稳定性改造的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用蛋白质定向设计与改造技术提高NZ2114胰蛋白酶抗性的方法。

为实现本发明目的，本发明提供了一系列抗菌肽，氨基酸序列包含SEQIDNo.1-SEQ IDNo.33中的任意一项。本发明还提供一系列抗菌肽基因，核苷酸序列包含SEQ IDNo.34-SEQ IDNo.66中的任意一项。

此外，本发明包含系列重组表达载体，其特征在于，携带有编上述编码抗菌肽基因序列(SEQ IDNo.34-SEQ IDNo.66)中的任意一项。

本发明还提供了含有上述表达载体的宿主细胞。优选地，所述宿主细胞为毕赤酵母基因工程菌。

本发明进一步提供了在重组毕赤酵母中表达抗菌肽(SEQ IDNo.1-SEQIDNo.33)的方法，其特征在于，其是将上述的重组毕赤酵母发酵培养，分泌产生抗菌肽。

本发明首次实现胰蛋白酶抗性抗菌肽NZ2114系列衍生物的定向改造并实现其在毕赤酵母中的表达。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，本发明实施例中所用的实验材料、试剂和仪器等均可市售获得，若未具体指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(New York：Gold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。

以下实施例中使用的酶和试剂：限制性内切酶、pfuDNA聚合酶、T4DNA连接酶等分别购自Biolabs、Invitrogen和Promega公司。四种dNTP购自Promega公司。DNA和蛋白质分子量标准为Biolabs产品。其它常规试剂采用进口分装或国产分析纯。

以下实施例中涉及的培养基和缓冲液配方：

LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母浸提取物5g/L，NaCl 10g/L；固体LB培养基则加入2％的琼脂糖。

低盐LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母浸提取物5g/L，NaCl 5g/L；固体低盐LB培养基则加入2％的琼脂粉。

MH培养基：酪蛋白水解物17.5g/L，牛肉浸粉5g/L，淀粉1.5g/L。

MHA培养基：固体MH培养基则加入2％的琼脂粉。

YPD培养基：蛋白胨20g/L，酵母浸提取物10g/L，葡萄糖20g/L；固体YPD培养基则加入2％琼脂粉。

YPDS培养基：蛋白胨20g/L，酵母浸提取物10g/L，山梨醇182.2g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L。

有关LB培养基、低盐LB、MH、YPD、YPDS等培养基的使用参照Invitrogen毕赤酵母操作手册。

20mM磷酸盐缓冲液(A液)：0.465g Na₂HPO₄，2.917g NaH₂PO₄，加去离子水至950mL，置于磁力搅拌器至完全溶解后调pH 5.7，定容至1000mL。

1M NaCl 20mM磷酸盐缓冲液(B液)：0.465g Na₂HPO₄，2.917g NaH₂PO₄，58.44g NaCl，加去离子水至950mL，置于磁力搅拌器至完全溶解后调pH 5.7，定容至1000mL。

以下实施例中涉及的基因扩增及转化子鉴定方法为PCR法及DNA测序法。

以下实施例中涉及的蛋白检测方法为Tricine-SDS-PAGE，参照(H.Tricine-SDS-PAGE.Nat protoc，2006，1(1)：16-22)。

以下实施例中涉及的蛋白质浓度测定方法为考马斯亮蓝法。

以下实施例中涉及的蛋白分子量的确定方法为MALDI-TOF MS法。

以下实施例中涉及的蛋白纯化的方法为基于离子层析法。

以下实施例中涉及的发酵方法为高密度发酵法。

以下实施例中涉及的菌种和质粒见表1：

表1 供试菌种和质粒

实施例1 胰蛋白酶抗性抗菌肽分子设计与基因合成

依据NZ2114序列中存在6处胰蛋白酶切割位点(R14，K20，K23，K26，K32，K38)，结合其活性位点和关键结构位点。分别设计单位点突变体、双位点突变体和三位点突变体共33条序列(SEQ IDNo.1-SEQ IDNo.33)。

依据毕赤酵母密码子偏爱性设计突变体基因序列(SEQ IDNo.34-SEQIDNo.66)。为保证表达过程中序列的完整性，在突变体基因序列5’端添加XhoI酶切位点和Kex2切割位点，在3’端添加TAA，TAG终止子序列和XbaI酶切位点。以上序列由上海生工生物工程股份有限公司完成。

实施例2 毕赤酵母组成型表达载体pGAPNZTYR1～pGAPNZTYR33的构建

用限制性内切酶XhoI和XbaI分别对合成的基因片段和载体pGAPZaA进行双酶切，回收pGAPZaA载体片段和突变体基因片段，连接，得到载体pGAPNZTYR 1～pGAPNZTYR33；

载体pGAPNZTYR1～pGAPNZTYR33详细构建过程：利用限制性内切酶XhoI和XbaI分别对合成的基因片段和pGAPZaA进行双酶切，酶切体系和条件如下：

以上酶切体系加样完毕后于37℃反应3个小时，2％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条件：120V，30min。电泳完毕在紫外灯下利用手术刀分别切割载体片段与基因片段对应电泳条带并利用天根生物技术有限公司胶回收试剂盒进行DNA片段回收，按试剂盒提供说明书的相关细节进行操作。

利用琼脂糖凝胶电泳检测回收片段并使用定量软件(GeneTools)进行初步定量，按照片段/载体(3∶1)的摩尔比例使用T4DNA连接酶进行连接，体系和条件如下：

以上连接体系加样完毕后于金属浴22℃反应2小时，转化E.coli DH5α。转化操作细节如下：

1)连接产物加入100μLE.coli DH5α感受态细胞，冰浴30min；

2)42℃热激90s，立即冰浴2～3min；

3)加入900μL 37℃预热的LB低盐培养基，37℃，80-100rpm恢复培养1h；

4)5000rpm离心2min，吸去700μL上清；

5)重悬菌体后取100-200μL涂布含有25μg/mL Zeocin的LB低盐固体培养基；

6)37℃倒置培养12-16h。

挑取阳性转化子，根据基因序列设计引物，进行菌液PCR验证转化子正确性，PCR体系、条件如下：

PCR体系：

PCR条件：

2％琼脂糖凝胶电泳检测阳性转化子菌液PCR产物，电泳条件：120V，30min。15％甘油管保存含有重组表达载体的E.coli并提取质粒，为线性化电转P.pastoris准备，相关实验细节按照质粒提取试剂盒(天根生物科技有限公司)说明书操作。

实施例3 含pGAPNZTYR1～pGAPNZTYR33重组酵母菌株的构建

3.1 重组载体pGAPNZTYR1～pGAPNZTYR33的线性化

利用AvrII对组成型重组表达载体pGAPNZTYR1～pGAPNZTYR33进行酶切，酶切体系和反应条件如下：

以上酶切体系加样完毕后于37℃反应3个小时，2％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条件：120V，30min。电泳完毕检测重组表达载体正确线性化后利用DNA回收试剂盒回收线性化的重组表达载体。

3.2 线性化载体的毕赤酵母电转化与鉴定

1)挑取YPD平板上的X-33单菌落，接种至10mL YPD液体培养基，30℃，250rpm，过夜培养；

2)取50μL过夜培养液接种至100mL YPD液体培养基，30℃，250rpm，培养至OD₆₀₀吸光值为1.2；

3)50mL培养物，4℃，4000rpm，5min离心后加入50mL无菌水重悬；

4)4℃，4000rpm，5min离心后加入25mL无菌水重悬；

5)4℃，4000rpm，5min离心后加入2mL 1M山梨醇重悬；

6)4℃，4000rpm，5min离心后加入100μL 1M山梨醇重悬后即为X-33感受态细胞(以上6步操作须在冰上操作，动作轻柔)；

7)预混80μL X-33感受态细胞和5-10μg线性化载体，转移至冰上预冷的0.2cm电转杯中，冰上放置5min后电转仪操作(1200V，25μF，400Ω)；

8)立即加入1mL 1M山梨醇，混匀；

9)30℃温育1-2h；

10)取100μL温育后的X-33细胞涂布含有100μg/mL Zeocin的YPDS平板，30℃倒置培养2-4天。

挑取YPDS平板上的单菌落接种至100μg/mL Zeocin的YPD液体培养基中，30℃，250rpm，过夜培养。取1mL过夜培养物4℃，12000rpm，5min离心后PBS重悬，沸水浴10min，快速放置于-70℃30min，立即再次沸水浴10min，4℃，12000rpm，5min离心后取上清作为模板进行PCR验证阳性转化子，PCR体系与条件如下：

PCR体系：

PCR条件：

2％琼脂糖凝胶电泳检测阳性转化子菌液PCR产物，电泳条件：120V，30min。将大小正确的阳性转化子一一对应转移至含有100μg/mL Zeocin的YPD平板上以备进一步表达。

实施例4 胰蛋白酶抗性抗菌肽的表达

4.1 转化子的表达

挑取阳性转化子，接种至YPD液体培养基，30℃，250rpm振荡培养18-20h；0.5-1％接种量转接至50mL YPD液体培养基，30℃，250rpm振荡培养1天后以4层灭菌纱布替换玻璃纸封口膜包裹摇瓶口，30℃，250rpm振荡培养3天至发酵结束。

4.2 重组酵母发酵液抗菌活性检测

抑菌圈实验分析：挑取S.aureusATCC 25923单菌落接种于10mLMH培养基中，37℃，250rpm培养至OD600nm≈0.4，1％接种量转移至50mL MH固体培养基中，混匀，迅速倒19cm×19cm的方形培养皿中，待凝固后，在培养基表面小心放置牛津杯，加入50μL发酵液上清。

4.3 重组酵母分泌蛋白水平Tricine-SDS-PAGE检测

对所获得的高活性重组酵母菌株进一步采用Tricine-SDS-PAGE分析重组AgPlectasin表达水平，电泳方法参照(2006)。

实施例5 胰蛋白酶抗性抗菌肽的纯化

5.1 G25除盐

收集发酵上清液，冻干后去离子水复溶，Bradford法测定蛋白浓度，4℃，13000rpm离心5min后取上清。在AKTA上用脱盐柱Sephadex G-25(Bedvolume，53ml；GE Healthcare)进行除盐，上样量4mL，流速8mL/min，除盐后冻干。

5.2 阳离子交换层析纯化

Bradford法测定蛋白浓度，4℃，13000rpm离心5min后取上清。将HiTrapSP FF阳离子交换柱(长度25mm，内径7mm，GE Healthcare)利用A液平衡5-10个柱体积后上样。进样完毕后，利用含有1M NaCl的50mM，pH5.7的磷酸盐洗脱缓冲液(B液)进行梯度洗脱。洗脱步骤为：70％A液，30％B液，洗脱5个柱体积；40％A液，60％B液，洗脱5个柱体积；100％B液，洗脱5个柱体积。利用UV215nm监测洗脱情况并收集洗脱峰，Tricine-SDS-PAGE和抑菌圈实验检测目标产物纯化情况。

实施例6 抗菌肽胰蛋白酶降解率检测

称取纯化后冻干粉，Tris-HCl(pH 8.0)溶解后Bradford法测定蛋白浓度。取100μL样品与等浓度等量胰蛋白酶混合，37℃孵育3h后利用二倍稀释法测定对金黄色葡萄球菌ATCC25923抑菌效价。结果(表2)表明，突变体表现出不同程度的胰蛋白酶耐受性，其中双突变体SEQ IDNo.17和三突变体SEQ IDNo.26～SEQ IDNo.33胰蛋白酶耐受性大幅提高，降解率在25％以下。

表2 抗菌肽胰蛋白酶降解率

实施例7 抗金黄色葡萄球菌活性检测

胰蛋白酶抗性抗菌肽对病原菌的最小抑菌浓度(MIC)参照Tian等(Tian等，Expression of antimicrobial peptide LH multimers in Escherichia coli C43(DE3).Applied Microbiology and Biotechnology，2009，83(1)：143-149)建立的微量肉汤稀释法，根据具体情况略有改动，操作细节如下：

1)挑取供试菌株单克隆至MH培养基，37℃，250rpm，振荡过夜培养；

2)将抗菌药物按2倍梯度系列稀释至1.5mL无菌离心管中，浓度分别是终浓度的10倍；

3)以1％的接种量分别将供试菌株转接至MH液体培养基中37℃，250rpm振荡培养至0.5个麦氏标准比浊；

4)稀释供试菌培养液1000倍(最终菌体浓度为10⁵CFU/mL左右)，转移至无菌细胞培养板中，每孔含稀释后菌液90μL；

5)加入稀释后的药物10μL，每个浓度3个平行样，并预留无药物阴性对照孔。加无菌培养板板盖，封口膜封闭后37℃静止培养至阴性对照空出现肉眼可见的明显浑浊菌液。将细胞培养板取出，观测结果，MIC值是能够明显抑制受试菌株生长的最小浓度。如出现跳孔或平行样间结果不一致情况，则重新测试。

取胰蛋白酶降解率50％以下突变体进行抗菌活性测定，结果如表3所示。

表3 胰蛋白酶抗性抗菌肽对金黄色葡葡球菌活性

由表2可知，抗胰蛋白酶抗菌肽对金黄色葡萄球菌有较强抑制作用：对金黄色葡萄球菌ATCC25923的MIC介于0.25-1μg/ml；对ATCC6538的MIC介于1-4μg/ml；对ATCC43300的MIC介于4-16μg/ml，效果优于万古霉素和氨苄青霉素。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一系列抗菌肽，氨基酸序列包含SEQ ID No.1-SEQ IDNo.33中的任意一项。

2.一系列抗菌肽基因，核苷酸序列包含SEQ ID No.34-SEQ ID No.66中的任意一项。

3.一种重组表达载体，其特征在于，携带有编码权利要求2中所述编码抗菌肽基因序列(SEQ ID No.34-SEQ ID No.66)中的任意一项。

4.含有权利要求3所述表达载体的宿主细胞。

5.含有权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为毕赤酵母基因工程菌。

6.在重组毕赤酵母中表达抗菌肽(SEQ ID No.1-SEQ ID No.33)的方法，其特征在于，是将权利要求5所述的重组毕赤酵母发酵培养，分泌产生抗菌肽。