CN106105456A

CN106105456A - 采用碳纳米材料调控草坪堆肥基质放线菌鉴定分析方法

Info

Publication number: CN106105456A
Application number: CN201610443408.5A
Authority: CN
Inventors: 赵树兰; 多立安; 郑亚南
Original assignee: Tianjin Normal University
Current assignee: Tianjin University; Tianjin Normal University
Priority date: 2016-06-21
Filing date: 2016-06-21
Publication date: 2016-11-16

Abstract

本发明公开了一种碳纳米材料调控草坪堆肥基质放线菌鉴定分析方法，以生活垃圾堆肥和土壤混合物为草坪基质材料，以向其中混合四种不同碳纳米材料作为处理组，通过草坪植物培养，研究添加不同碳纳米材料一段时间后基质中可培养放线菌类群的变化，并通过分子测序技术分析基质中可培养放线菌的分类地位。通过将碳纳米材料添加进草坪建植体系后放线菌类群的变化的认识，为碳纳米材料在垃圾堆肥草坪基质中放线菌调控应用提供技术支撑。

Description

采用碳纳米材料调控草坪堆肥基质放线菌鉴定分析方法

技术领域

本发明属于环境保护技术领域，涉及一种采用碳纳米材料调控草坪堆肥基质放线菌鉴定分析方法。

背景技术

碳纳米材料是三维结构中至少有一个小于100 nm的材料。碳纳米材料具有尺寸小，比表面积大，表面能高，表面原子比例大的特点，在力学、光学、热学、电学等方面表现出了优异性能。纳米颗粒存在很多微界面, 各种界面反应可以通过其强化, 在土壤重金属污染以及污水净化方面发挥着显著的作用。

碳元素在自然界含量非常高，对于有机物和生命体也非常重要。1985 年，科学家发现了由60 个C原子组成的C₆₀。随后碳纳米管和石墨烯等也相继被发现。2004年, Geim等人成功制备出了单层石墨烯。之后随着石墨烯在光、电、热、磁上的特殊性质被陆续发现,有关碳材料的研究又进入了一个全新的领域。

随着科学技术、现代工业的快速发展以及人口的不断增加，世界上很多国家都呈现出水体、土壤以及大气污染日益严重的趋势。报道指出，中国50%的河流以及80%以上的湖泊已经遭受到了污染，地表水的Ⅲ类水质标准中国的许多湖泊已经达不到了。全国的耕地中有8000万hm ²以上受到了不同程度的污染, 而其中最突出的问题就是有机污染物以及重金属的污染, 这一情况已经严重制约了中国可持续发展战略的实施，甚至威胁到了国人的健康。

传统的水体修复技术比如截污、底泥疏浚等虽然暂时能够起一些作用，但是都治标不治本，而生物修复限制因素有很多，比如环境温度和酸碱性等, 这就使得生物修复客观上存在着很大的局限性。作为传统的污染土壤修复方法，客土法、淋滤法费时费力，并且对于大面积的修复起不到很好的作用。与传统的环境修复方法相比较, 将纳米材料用于重金属修复，因其超强的吸附能力和超大的比表面积，不仅不存在传统方法的缺点，还表现出极高的修复效率。另外大气污染方面形势也是十分严峻，空气中超标的SO₂、 CO和NO_x等时刻威胁着我们的身体健康。纳米材料具有极佳的催化效率，甚至能够催化极不易发生的反应为解决产生大气污染问题提供了新的方法和思路。因此，利用纳米材料解决水体和土壤以及大气的污染问题越来越值得人们关注。而碳纳米材料的研究又是其中极有发展前景的领域。

近年来的研究发现碳纳米管能够有效的吸附水体中重金属离子。Li 等的实验表明碳纳米管能够吸附水体中的铅离子，并且与溶液的PH值有很大的相关性。随着溶液 pH值的增加，碳纳米管对铅离子的吸附能力也随之增大。Langmuir和 Freundlich 模型可以解释这个吸附过程。随后，Li 等还研究了不同氧化方式处理的碳纳米管对镉离子的吸附效果比较，发现经过氧化处理后，碳纳米管的比表面积显著增加，表面官能团的数量也有明显增多。具体来说，碳纳米管经KMnO₄氧化之后的吸附效果明显高于 H₂O₂和 HNO₃的氧化效果。另外，Li 等人接下来又进行了碳纳米管吸附铜离子的实验、研究了不同形态的碳纳米管对铅离子的吸附比较、碳纳米管对铅离子的吸附动力学性质以及解吸附的情况，并且讨论了碳纳米管对铅离子、铜离子以及镉离子在相同溶液中的竞争吸附情况。研究发现，碳纳米管对对溶液中以上三种不同离子的吸附顺序为Pb²⁺＞Cu²⁺＞Cd²⁺，其中对铅离子（Pb²⁺）、铜离子（Cu²⁺）的吸附可以用Langmuir 方程解释。

李延辉等利用HNO₃氧化处理的碳纳米管进行了对Pb²⁺的吸附实验。研究发现HNO₃氧化处理之后的碳纳米管表面积明显增大，另外-OH、-CO、-COOH等官能团被引入到了碳纳米管的表面。这能够明显增强碳纳米管吸附Pb²⁺的作用面积以及作用力，从而提高碳纳米管对Pb²⁺的吸附量。结果表明，吸附量随着温度的升高而升高，这说明碳纳米管对Pb²⁺的吸附是一个放热过程。再生试验表明，吸附效果随pH值的增加而显著增加。当pH低至2时，碳纳米管上吸附的Pb²⁺脱附率到了85%，从而为实现碳纳米管吸附材料的循环利用提供了理论依据。

除此之外，石墨烯和氧化石墨烯对于有机物污染以及由石油泄露造成的环境污染也有很强的修复作用。石墨烯改性之后对环境中污染物的吸附效果更佳，并且吸附量增大、性能更加稳定。Chen 等人^]制备出的三维多孔氧化石墨烯薄膜在选择吸附方面表现出了巨大的潜力。它吸附机油的重量能够达到自身重量的37 倍，吸附有机溶剂的重量则大于自身重量的 26 倍，它的吸附效果相比片状石墨烯和泡沫石墨烯高很多。除此之外，该多孔氧化石墨烯薄膜的性质十分稳定，可利用己烷去除表面的吸附物质之后循环利用。较高的吸附量和较长的循环使用次数使得该三维多孔氧化石墨烯薄膜去除有机物以及清理石油污染方面表现出了极大的应用前景。

上述分析表明，石墨烯和碳纳米管等碳纳米材料在环境领域的应用主要在土壤、水体以及大气污染修复方面，而作为生物调控剂进行应用，尤其碳纳米材料在堆肥草坪基质中作为微生物调控剂，研究目前尚无文献报道。

随着我国经济增长和城市化速度的加快，城市生活和生产过程中产生的垃圾废物呈现显著增加的趋势。与此同时，生活垃圾的配套处理却还不够完备，大量垃圾暴露在城市中，对环境造成了很大的影响。堆肥化处理是城市生活垃圾处理及资源化比较便捷的方式，这不仅能够消化城市中的生活垃圾，缓解了生活垃圾带来的城市环境压力，同时也生产出了大量堆肥肥料供给农业生产。

生活垃圾中含有大量植物生长所必需的营养元素，因此将生活垃圾堆肥化处理并将堆肥用于农业生产是其资源化利用的有效途径。

研究发现将适量垃圾堆肥添加到土壤当中能够有效增加作物产量。因土壤理化性质以及作物类型不同，其增幅也存在显著差异。周德智等^]研究了添加垃圾堆肥后，黄棕壤、潮土以及红壤中种植的小麦产量变化。结果显示，添加适量垃圾堆肥后，作物均有增产效果，其中红壤土效果最好(作物增产46%)。贺立源等^[43]研究发现，小白菜的产量随着垃圾堆肥施用量的提高而增加，且与对照相比差异达到显著水平。此外，堆肥的施用不仅对作物产量有影响，对作物的品质也有显著的提高效果。方亭等人的研究发现，将垃圾堆肥添加到棕红壤土中，土壤作物油菜的籽粒中蛋白质的含量显著升高，大豆籽粒中所含的蛋白质明显增加。

然而，近些年来人们也开始意识到垃圾堆肥中不仅含有营养物质，同时还含有一定量的重金属，如果长期施用会增加土壤中重金属的含量。因此,将堆肥用于农业生产可能会带来一系列的食品安全问题。可见，避开食物链实现垃圾堆肥的资源化利用意义重大。不仅如此，为防止堆肥利用导致土壤重金属污染，甚至给生态环境带来威胁，在应用的同时必须考虑重金属修复的问题。

传统的草皮生产通常是利用优质土壤。这会对土壤的物理性质产生很大的影响，导致肥力下降。另外草皮生产时2 cm以上的耕层土壤会被带走，肥沃的耕层土壤进入城市生态系统，而经过几次的草皮生产之后，农田土壤将变得越来越贫瘠，以致于最终无法再进行农业生产, 这是对国土资源极大的浪费。如果草坪建植以生活垃圾堆肥作为基本体系，不仅能够消化城市垃圾，还能够减轻草坪生产带给耕层土壤的破坏作用。

纳米技术近年来发展十分迅速，在材料、信息、环境等方面均表现出了广阔的应用前景。虽然已经有一些研究理论研究，表明纳米材料会对微生物的生长产生不同程度的影响，但应用其调控作用，还尚无相关技术报道。

众所周知，放线菌具有很高的经济价值，用途也十分广泛。8000多种从微生物中发现的活性物质中有近70%来自放线菌。但由于培养条件等的限制，目前人们分离得到的放线菌种类只占土壤中放线菌总数的10%左右。这一数量与我们未知的相比还有很大差距。一些放线菌还能够产生蛋白酶等各种具有工业用途的酶。在纤维素降解、污水处理方面，放线菌也发挥着重要的作用。利用放线菌产生的抗生素来制备的新型农药, 已经成为未来农药生产极有前景的发展方向。

放线菌可以说是与人类关系最密切的一类微生物，各种环境中都有它的身影而且形态各异。到目前为止人类发现的所有天然抗生素中，有70%都是链放线菌生产的。而其中由链霉素产的抗生素就有一半以上。链霉菌属于革兰氏阳性的放线菌，生活周期复杂并且能够产生多种次生代谢产物。放线菌本身就是最大的一类能够产生抗生素活性的微生物，而链霉菌又是其中抗生素的主要产生菌，物种多样性丰富，是重要的资源微生物。

绝大多数链霉菌对人类是无害的，并且他们产生的抗生素还能够特异性的作用于某些病原体，抑制其生长。人们已经发现了很多抗生素都是来自于链霉素，例如四环素、氯霉素、链霉素等等。这些抗生素的发现对人类社会的发展起到了显而易见的促进作用。因此，碳纳米材料调控下草坪堆肥基质体系放线菌鉴定分析方法具有重要的应用价值。

发明内容

碳纳米材料因其特殊的结构具有很大的应用范围，吸附水体和土壤中的重金属就是其中一项重要的应用。本技术从基质微生物角度出发，以生活垃圾堆肥和土壤混合物为草坪基质材料，以向其中混合四种不同碳纳米材料作为处理组，通过草坪植物培养，添加不同碳纳米材料草坪基质基质中可培养放线菌类群变化的认识，以分子测序技术鉴定分析基质中可培养放线菌的分类地位，为碳纳米材料在垃圾堆肥草坪基质中放线菌调控应用提供技术支撑。

为实现上述目的本发明公开了如下的技术内容：

一种采用碳纳米材料调控草坪堆肥基质放线菌鉴定分析的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）实验材料

实验用土壤取自天津师范大学校园0-20 cm表层土壤，基本性质为：含水量19.4%，pH7.27，电导率2250 µS/cm，有机质、全磷、全氮分别为52.3、3.75、2.15 g/kg。

实验用生活垃圾堆肥来自天津市小淀垃圾处理厂。pH为7.49，电导率2300 µS/cm，有机质、全磷、全氮分别为132、6.81、25.1 g/kg。重金属Cr、Cu、Pb、Zn、Cd含量分别为703、341、217、677、5.01 mg/kg。

供试纳米炭黑（CB）购于天津秋实炭黑厂，粒径为20~70 nm，比表面积为 1200 m²/g，pH 值为7.0，实验前利用KMnO₄对其改性处理。

石墨烯(G)微片购于南京吉仓纳米科技有限公司，结构为黑色薄片状，微片尺寸0.5-20 um，厚度5-25 nm，比表面积40-60 m²/g，密度约2.25 g/cm³，电导率 8000-10000 S/m，含碳量>99.5%。

氧化石墨烯(GO)购于苏州恒球纳米公司，为黑色或褐黄色粉末，平均厚度3.4-7nm，片层直径10-50 μm，比表面积100-300 m²/g，纯度>90%。

碳纳米管(CNT)购于北京博宇高科技新材料技术有限公司，直径20-40 nm，长度10-30 um，-COOH含量1.43%，纯度>90wt%，灰粉<8wt%，比表面积>110 m²/g，导电：>102 s/cm。

（2）实验方法：

取土后立即测量土壤含水量，计算得到土壤干重与湿重的比例。按照比例算得干重1500 g所对应的湿土重量。称得相应重量的湿土与30 g垃圾堆肥混合，搅拌均匀，装入内径15 cm高20 cm的塑料花盆中，共装15盆。

实验共设5个处理，石墨烯（G）、氧化石墨烯(GO)、碳纳米管(CNT)、改性纳米炭黑(CB)按干土重1%的比例分别加入到混合基质中，以不添加碳纳米材料的处理为对照（CK），添加碳纳米材料后充分混匀，每盆播种高羊茅种子5g。培养期间温度为 19~27 ℃，相对湿度为 60~72%，每天给土壤补充水分，使土壤湿度保持在土壤持水量的70%。培养130d后，将盆中0-5cm深度土壤取出混匀，过60目筛，冰箱-20℃保存，供微生物分离与计数分析。

本发明进一步公开加了采用碳纳米材料调控草坪堆肥基质放线菌鉴定分析方法在确定放线菌菌落的组成方面的应用。本发明分离出的11株放线菌菌株序列遗传变异性较低。其中菌株1、3、4、5、6、7、8、10分别与链霉菌菌株Streptomycessp. ZZY-2013 strainTRM46798-28、Streptomyces griseoplanus strain Ca314、Streptomycessp. GS10、Streptomyces microflavus strain HBUM174884、Streptomycessp. HYKH4/C1、Streptomycessp. HBUM179165-2、Streptomyces griseoplanus strain Ca314、 Streptomyces sp. XAS586的相似度达到了97%以上，而菌株2、9、11与已知菌株的遗传相似性分别为 92%、89%和94%，所以可能是潜在新种。

本发明所述的纳米碳是指石墨烯、氧化石墨烯、碳纳米管、纳米炭黑（CB）。纳米炭黑（CB）实验前利用KMnO₄对其改性处理指的是：称取纳米碳10 g于250 mL锥形瓶中，加入100 mL0.03 mol·L^-1的KMnO₄溶液，静置10 min后，放于万用电热器上沸腾回流1 h。冷却后，用去离子水反复冲洗，使溶液不再浑浊且pH稳定。转移至烧杯，110℃条件下烘干至恒重。

本发明进一步公开了采用碳纳米材料调控草坪堆肥基质放线菌鉴定分析方法在确定放线菌菌落的组成方面的应用。主要指的是：发现的11株放线菌均为链霉菌属（Streptomyces）。

本发明更加详细的描述如下：

1研制材料与方法

1.1实验材料

技术设计

实验共设5个处理，石墨烯（G）、氧化石墨烯(GO)、碳纳米管(CNT)、改性纳米炭黑(CB)按干土重1%的比例分别加入到混合基质中，以不添加碳纳米材料的处理为对照（CK），每个处理三次重复。添加碳纳米材料后充分混匀，每盆播种高羊茅种子5g。培养期间温度为19~27 ℃，相对湿度为 60~72%，每天给土壤补充水分，使土壤湿度保持在土壤持水量的70%。培养130d后，将盆中0-5cm深度土壤取出混匀，过60目筛，冰箱-20℃保存，供微生物分离与计数分析。

.3研制方法

1.3.1放线菌培养基配制方法

培养放线菌用高氏一号培养，具体配方为可溶性淀粉20g、 KNO₃ 1g、K₂HPO₄ 0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、NaCl 0.5g、FeSO₄· 7H₂O 0.01g、琼脂 18g，利用NaOH或HCl调节pH到7.4-7.6。121℃灭菌20分钟，室温晾至50-60℃时倒入培养皿备用。

1.3.2 放线菌培养最适浓度的确定

根据微生物学实验指导以及以往培养经验初步确定放线菌培养观察的最适浓度在10^-3-10^-5之间。取0.5g对照组中的基质土壤倒入装有50ml无菌水的锥形瓶中，封口后置于摇床上，以 150 rpm 振荡 20 min。振荡停止后静置 10 S。吸取l mL土壤浸出液移入试管中并添加9 mL 无菌水，将其稀释10倍，制成10^-3浓度的土壤浸出液，之后利用此方法分别制成10^-4、10^-5浓度的土壤浸出液。取200ul土壤浸出液均匀涂布到LB培养基上，将培养皿倒置放入37度的恒温培养箱中，避光培养。连续观察放线菌生长情况，待其大小适宜数量稳定后进行计数。预实验的结果发现10^-4这一浓度培养出的放线菌数量偏少，而10^-3这一浓度培养出的放线菌数量又偏多，经过第二次预实验最终确定5*10^-3这个浓度为放线菌培养的最适浓度。培养最适时间为6d。

放线菌平板计数方法

通过预实验已确定出最适浓度为5*10^-3，所以实验可以直接将草坪堆肥基质稀释5000倍进行培养。具体操作过程为：称取0.5g土壤将其倒入装有50 mL无菌水的锥形瓶中，封口后置于摇床上，以 150 rpm 振荡 20 min。振荡停止后静置 10 s。吸取1mL 土壤浸出液移入装有50ml无菌水的锥形瓶中制成5*10^-3浓度的土壤悬浊液，充分混匀后，吸取 200uL并将其注射到固体LB培养基上，涂布均匀，之后将培养皿倒置于 37 ℃恒温培养箱内培养6d，选取菌落数在 30-300范围内的平板进行分离计数，并按照其不同菌落特征归类、编号。之后进行划线纯培养以达到对分离到的放线菌纯化的目的。将培养皿做好标签倒置于37度培养箱中培养6d，之后转移到 4℃冰箱中保存备用。

放线菌的分子生物学鉴定方法

由于放线菌细胞中的16s rDNA一部分碱基序列十分保守的，不受微生物所处环境条件的影响，而一部分序列又是可变的，因此，可以通过分析比较放线菌之间16S rDNA的同源性，揭示它们的亲缘关系以及系统发育地位。

利用Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒（上海生工）提取纯培养得到的放线菌基因组DNA，其过程按照试剂盒要求进行。将所得基因组DNA用于放线菌 16S rDNA的PCR扩增。引物为 27f：

5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTCAG-3′ 1492r：

5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′

PCR 反应条件与步骤：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火45s，72℃延伸45s，30个循环，72℃延伸10min。扩增体系如下（50 μL）：引物1(27F) 2μL；引物2(1492R) 2μL；10xBuffer(Mg²⁺) 5μL；dNTP 1μL；Taq酶 1μL；DNA模板 10μL；ddH2O 29μL。吸取不同扩增产物各7µL分别与2µL 6×Glycerol DNA loading buffer混合均匀，吸取7µL混合液进行点样，并进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，将琼脂糖凝胶浸入EB水溶液中染色10min，在紫外凝胶成像系统中观察，观察到明亮目标条带后，将实验所得PCR产物交由北京华大基因公司纯化与测序。

.3.5放线菌16SrDNA序列分析方法

测序结果经 NCBI Blast( http: ∥www．ncbi．nlm．nih．gov)比对分析，获得相似度最高的五个菌株的16SrDNA 序列。运用ClustalX进行多重对比、用MEGA 软件进行系统发育分析，采用Neighbor-join法构建系统发育树，自展数(Bootstrap)为1000。根据序列的同源程度初步确定待鉴定的菌株在分类学上的地位。将培养得到菌株与NCBI数据库中的模式菌株进行比较，如果相似度达到96%以上，那么可将培养得到的菌株与模式菌株归为一个属，也就将培养菌株鉴定到了属的水平。

2 研制结果分析

2.1基质中可培养放线菌的 16SrDNA 分析

经过对草坪堆肥基质中放线菌的培养计数以及种类划分归类，挑选出了不同特征的放线菌菌落。图1是对其进行16SrDNA扩增之后的电泳图。

通过对不同放线菌16SrDNA的PCR过程，得到了多条扩增片段，将其对应的PCR产物送测后得到以下检测结果：

本技术共获得的11有效序列，将获得的序列通过Blast 程序与 Gen-Bank 数据库中已知序列进行相似性比对，其类别信息、相似性百分比及 GenBank登录号见表 1。

表1 基质中可培养放线菌的16SrDNA 序列相似性分析

通过序列相似性分析发现本技术得到的11株放线菌均为链霉菌属（Streptomyces）。

将本技术分离出的11形态不同的放线菌菌株的测序结果进行Blast分析及多重比对，之后利用MEGA5.1以 16SrDNA 同源性为基础构建系统进化树。

研制结论

本技术分离出的11株放线菌菌株序列遗传变异性较低。其中菌株1、3、4、5、6、7、8、10分别与链霉菌菌株Streptomycessp. ZZY-2013 strain TRM46798-28、Streptomyces griseoplanus strain Ca314、Streptomycessp. GS10、Streptomyces microflavus strain HBUM174884、Streptomycessp. HYKH4/C1、Streptomycessp. HBUM179165-2、Streptomyces griseoplanus strain Ca314、Streptomyces sp. XAS586的相似度达到了97%以上，而菌株2、9、11与已知菌株的遗传相似性分别为 92%、89%和94%，所以可能是潜在新种。

附图说明:

图1是放线菌16SrDNA 的PCR扩增结果；

图2是放线菌16SrDNA 的PCR重复扩增结果。

具体实施方式：

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料、试剂均有市售。

实施例1

（1）实验材料

实验用土壤取自天津师范大学校园10 cm表层土壤，基本性质为：含水量19.4%，pH7.27，电导率2250 µS/cm，有机质、全磷、全氮分别为52.3、3.75、2.15 g/kg。

供试纳米炭黑（CB）购于天津秋实炭黑厂，粒径为20 nm，比表面积为 1200 m²/g，pH 值为7.0，实验前利用KMnO₄对其改性处理。

石墨烯(G)微片购于南京吉仓纳米科技有限公司，结构为黑色薄片状，微片尺寸0.5 um，厚度5 nm，比表面积40 m²/g，密度约2.25 g/cm³，电导率 8000 S/m，含碳量>99.5%。

氧化石墨烯(GO)购于苏州恒球纳米公司，为黑色或褐黄色粉末，平均厚度3.4-7nm，片层直径10μm，比表面积100 m²/g，纯度>90%。

碳纳米管(CNT)购于北京博宇高科技新材料技术有限公司，直径20 nm，长度10um，-COOH含量1.43%，纯度>90wt%，灰粉<8wt%，比表面积>110 m²/g，导电：>102 s/cm。

（2）实验方法：

实验共设5个处理，石墨烯（G）、氧化石墨烯(GO)、碳纳米管(CNT)、改性纳米炭黑(CB)按干土重1%的比例分别加入到混合基质中，以不添加碳纳米材料的处理为对照（CK），添加碳纳米材料后充分混匀，每盆播种高羊茅种子5g。培养期间温度为 19 ℃，相对湿度为60%，每天给土壤补充水分，使土壤湿度保持在土壤持水量的70%。培养130d后，将盆中1cm深度土壤取出混匀，过60目筛，冰箱-20℃保存，供微生物分离与计数分析。

实施例2

（1）实验材料

实验用土壤取自天津师范大学校园20 cm表层土壤，基本性质为：含水量19.4%，pH7.27，电导率2250 µS/cm，有机质、全磷、全氮分别为52.3、3.75、2.15 g/kg。

供试纳米炭黑（CB）购于天津秋实炭黑厂，粒径为70 nm，比表面积为 1200 m²/g，pH 值为7.0，实验前利用KMnO₄对其改性处理。

石墨烯(G)微片购于南京吉仓纳米科技有限公司，结构为黑色薄片状，微片尺寸20um，厚度25 nm，比表面积60 m²/g，密度约2.25 g/cm³，电导率 10000 S/m，含碳量>99.5%。

氧化石墨烯(GO)购于苏州恒球纳米公司，为黑色或褐黄色粉末，平均厚度7 nm，片层直径50 μm，比表面积100-300 m²/g，纯度>90%。

碳纳米管(CNT)购于北京博宇高科技新材料技术有限公司，直径40 nm，长度30um，-COOH含量1.43%，纯度>90wt%，灰粉<8wt%，比表面积>110 m²/g，导电：>102 s/cm。

（2）实验方法：

实验共设5个处理，石墨烯（G）、氧化石墨烯(GO)、碳纳米管(CNT)、改性纳米炭黑(CB)按干土重1%的比例分别加入到混合基质中，以不添加碳纳米材料的处理为对照（CK），添加碳纳米材料后充分混匀，每盆播种高羊茅种子5g。培养期间温度为 27 ℃，相对湿度为72%，每天给土壤补充水分，使土壤湿度保持在土壤持水量的70%。培养130d后，将盆中5cm深度土壤取出混匀，过60目筛，冰箱-20℃保存，供微生物分离与计数分析。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津师范大学

<120> 采用碳纳米材料调控草坪堆肥基质放线菌鉴定分析方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims

1.一种采用碳纳米材料调控草坪堆肥基质放线菌鉴定分析的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）实验材料

实验用土壤取0-20 cm表层土壤；

供试纳米炭黑粒径为20~70 nm，比表面积为 1200 m²/g，pH 值为7.0，实验前利用KMnO₄对其改性处理；

石墨烯微片尺寸0.5-20 um，厚度5-25 nm，比表面积40-60 m²/g，密度约2.25 g/cm³，电导率 8000-10000 S/m，含碳量>99.5%；

氧化石墨烯平均厚度3.4-7 nm，片层直径10-50 μm，比表面积100-300 m²/g，纯度>90%；

碳纳米管直径20-40 nm，长度10-30 um，-COOH含量1.43%，纯度>90wt%，灰粉<8wt%，比表面积>110 m²/g，导电：>102 s/cm；

（2）实验方法：

取土后立即测量土壤含水量，计算得到土壤干重与湿重的比例，按照比例算得干重1500 g所对应的湿土重量，称得相应重量的湿土与30 g垃圾堆肥混合，搅拌均匀，装入内径15 cm高20 cm的塑料花盆中，共装15盆；

实验共设5个处理：石墨烯（G）、氧化石墨烯(GO)、碳纳米管(CNT)、改性纳米炭黑(CB)按干土重1%的比例分别加入，添加碳纳米材料后充分混匀，以不添加碳纳米材料的处理为对照（CK），每盆播种高羊茅种子5g，培养期间温度为 19~27 ℃，相对湿度为 60~72%，每天给土壤补充水分，使土壤湿度保持在土壤持水量的70%，培养130d后，将盆中0-5cm深度土壤取出混匀，过60目筛，冰箱-20℃保存，供微生物分离与计数分析。

2.权利要求1所述的方法，其中土壤的基本性质为：含水量19.4%，pH 7.27，电导率2250µS/cm，有机质、全磷、全氮分别为52.3、3.75、2.15 g/kg；

实验用生活垃圾堆肥来自天津市小淀垃圾处理厂，pH为7.49，电导率2300 µS/cm，有机质、全磷、全氮分别为132、6.81、25.1 g/kg；

重金属Cr、Cu、Pb、Zn、Cd含量分别为703、341、217、677、5.01 mg/kg；

纳米炭黑，粒径为20~70 nm，比表面积为 1200 m²/g，pH 值为7.0，实验前利用KMnO₄对其改性处理；

碳纳米管，直径20-40 nm，长度10-30 um，-COOH含量1.43%，纯度>90wt%，灰粉<8wt%，比表面积>110 m²/g，导电：>102 s/cm。

3.权利要求1所述采用碳纳米材料调控草坪堆肥基质放线菌鉴定分析方法在确定放线菌菌落的组成方面的应用。

4.权利要求3所述的应用，其中所述的确定放线菌菌落的组成指的是：11株放线菌均为链霉菌属（Streptomyces）。