CN106093303B - 烟草甾醇突变体的筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种烟草甾醇突变体的筛选方法，包括以下步骤：⑴、用甲基磺酸乙酯处理烟草种子，获得M1代种子；⑵、对M1代种子进行种植，成熟后单株收获，获得M2代种子；⑶、配制梯度浓度的含伏立康唑的1/2MS培养基；⑷、利用步骤⑶梯度浓度的含伏立康唑的1/2MS培养基，培育烟草种子，根据烟草种子的生长发育，获得烟草种子生长发育对应的含伏立康唑的1/2MS培养基的梯度浓度；⑸、采用步骤⑷梯度浓度的含伏立康唑的1/2MS培养基，来培育M2代种子，根据M2代种子的生长发育状态，筛选烟草甾醇含量最低和最高的突变体。本发明筛选方法操作简单、成本低、效率高，可适用于大量突变体和群体单株筛选。

Description

烟草甾醇突变体的筛选方法
技术领域
本发明涉及烟草技术领域，尤其是一种烟草甾醇突变体的筛选方法。
背景技术
植物甾醇是植物性甾体化合物，其结构类似于动物性甾醇，广泛存在于植物根、茎、叶、果实和种子中，其基本结构为环戊氢化菲体系。植物甾醇不仅是植物细胞的重要组成成分，也是一种重要的植物活性成分。研究发现植物甾醇不仅参与植物的生长发育调控,而且通过植物甾醇含量的相对变化响应各种生物胁迫和非生物胁迫,如病原体、干旱、盐碱、极端温度、低氧、光照、ABA和UV-B等。植物甾醇作为信号分子参与逆境胁迫反应，在植物中发挥重要作用，被誉为“生命的钥匙”。
此外，植物甾醇具有重要的药用价值，对人类生活具有重要意义。目前已经研究证明植物甾醇可以促进胆固醇的异化，抑制胆固醇在肝脏内的生物合成和在肠道内的吸收，从而预防心血管疾病；胆固醇作为细胞膜的主要成分，参与血液中脂质的运输；β-谷甾醇等植物甾醇能够阻断致癌物诱发癌细胞的形成，因而对大肠癌、皮肤癌、宫颈癌的发生具有一定程度的抑制作用。植物甾醇促进人体内新陈代谢，与肾小管的重吸收作用有关，维持第二性征。植物甾醇在体内能表现出一定的激素活性，但却无激素的副作用。当人体激素水平高于正常值时，植物甾醇能够阻碍胆激素吸收的作用，降低人体激素水平；当人体激素水平低于正常值时，植物甾醇会转化成人体内的激素，提高人体激素水平。
目前烟草中已报道植物甾醇主要有胆甾醇，菜油甾醇，豆甾醇和β-谷甾醇。烟草中的植物甾醇主要存在于细胞膜中，不但能促进烟草生长，而且对烟草安全、品质都有较大的影响。研究表明，烟草中的甾醇是卷烟烟气致癌物多环芳烃的主要前体物，卷烟烟气中61％的苯并[α]芘是由甾醇裂解产生的。在卷烟抽吸时约有20％-25％的烟草植物甾醇完整的转移到主流和侧流烟气中，甾醇中的羟基，高温热解时会与其母体的四轮环戊烯[α]菲环结构形成稠环芳烃化合物。Stedman的研究表明豆甾醇在750℃下热解生成苯并[α]芘；Badger表明，在豆甾醇的裂解过程中，发生了甾醇骨架的一系列单分子反应后形成了菲，蒽等多环芳烃。因此，获得甾醇突变体植株对培育高品质、低危害烟草品种以及植物甾醇活性物质提取研究都具有重要意义。但是，目前烟草中甾醇的分析方法主要采用定量分析法，该方法样品前期需要经过多个工序处理，致使其测定周期较长，步骤繁琐，不适用于大批量材料的筛选。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提出一种烟草甾醇突变体的筛选方法，操作简便，实施效果好。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种烟草甾醇突变体的筛选方法，包括以下步骤：
⑴、用甲基磺酸乙酯处理烟草种子，获得M1代种子；
⑵、对M1代种子进行种植，成熟后单株收获，获得M2代种子；
⑶、配制梯度浓度的含伏立康唑的1/2MS培养基；
⑷、利用步骤⑶梯度浓度的含伏立康唑的1/2MS培养基，培育烟草种子，根据烟草种子的生长发育，获得烟草种子生长发育对应的含伏立康唑的1/2MS培养基的梯度浓度；
⑸、采用步骤⑷梯度浓度的含伏立康唑的1/2MS培养基，来培育M2代种子，根据M2代种子的生长发育状态，筛选烟草甾醇含量最低和最高的突变体。
优选的，步骤⑴为：用pH 6.5的0.01mol/L磷酸缓冲液作为溶剂，配置体积浓度为0.6％的甲基磺酸乙酯溶液；将烟草种子加入甲基磺酸乙酯溶液中，放置于26℃、110rpm的摇床内，处理16小时。
优选的，摇床处理后的种子，用pH 6.5的0.01mol/L磷酸缓冲液每隔半小时润洗一次，洗3次后用蒸馏水冲洗2h。
优选的，步骤⑶包括：
①、配制100μM伏立康唑溶液；
②、1/2MS培养基配制：称取MS培养基粉末2.37g，加热溶解于1000ml蒸馏水中，116℃高压灭菌30min备用；
③、设置梯度浓度：将梯度浓度的伏立康唑溶液分别加入1/2MS培养基中，得到梯度浓度的伏立康唑的1/2MS培养基。
优选的，烟草种子为红花大金元。
优选的，步骤⑶的浓度梯度为0.01μΜ、0.03μΜ、0.1μΜ、0.3μΜ、1μΜ、3μΜ和10μΜ。
优选的，步骤⑷或步骤⑸中，获得烟草种子生长发育对应的含伏立康唑的1/2MS培养基的梯度浓度为：1μM和3μM。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：利用不同浓度伏立康唑的1/2MS培养基探索红花大金元对伏立康唑的敏感性，从而筛选出红花大金元正常生长和生长受到抑制时伏立康唑的临界浓度，其次，利用上述临界浓度，筛选红花大金元EMS突变体，获得烟草低甾醇含量突变体和烟草高甾醇含量突变体。该方法能够对烟叶总甾醇物质进行定性检测，筛选方法操作简单、成本低、效率高，可适用于大量突变体和群体单株筛选。
附图说明
图1为甾醇抑制剂福利康挫筛选红花大金元；
图2为甾醇抑制剂福利康挫筛选红花大金元突变体。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进行详细描述，本部分的描述仅是示范性和解释性，不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。
一种烟草甾醇突变体的筛选方法，包括以下步骤：
1)用化学诱变剂甲基磺酸乙酯(sthyl methyl sulfonate，EMS)处理烟草种子，获得M1代种子；
2)对M1代种子进行种植，成熟后单株收获，获得M2代种子；
3)制备含不同浓度甾醇抑制剂伏立康唑(Voriconazole)的1/2MS培养基。首先，配制1 00μM伏立康唑溶液：称取0.01g伏立康唑，加入286ml无菌水，混匀，棕色瓶保存备用。其次，配制1/2MS培养基：称取MS培养基粉末2.37g，加热溶解于1000ml蒸馏水中，116℃高压灭菌30min备用。最后，设置梯度浓度：根据实验要求设计含有不同浓度伏立康唑的梯度1/2MS培养基。
4)利用含0.00μΜ(对照)、0.01μΜ、0.03μΜ、0.1μΜ、0.3μΜ、1μΜ、3μΜ、10μΜ伏立康唑的1/2MS培养基，探索不同浓度伏立康唑抑制烟草红花大金元的生长情况。
5)甾醇含量的突变体的筛选。利用摸索好的适宜浓度的甾醇抑制剂伏立康唑的1/2MS培养基从烟草突变体中筛选低甾醇含量的突变体。
本发明利用筛选出的临界浓度对EMS诱变的红花大金元500个M2代家系进行筛选，获得高伏立康唑浓度下正常生长的突变体和低伏立康唑浓度下生长受到抑制的突变体材料。最后参照《衍生化气相色谱质谱联用法同时测定烟叶多种植物甾醇》定量测定烟草品种红花大金元和伏立康唑法筛选获得的突变体单株中菜油甾醇、豆甾醇和β谷甾醇的含量，以此验证伏立康唑法定性筛选甾醇突变体的准确性。
伏利康唑能够通过抑制细胞色素P450依赖性14-α-固醇去甲基酶的活性，进而抑制功能性真菌膜的形成和维持真菌生长的甾醇的生物合成，使得细胞膜合成受阻，细胞破裂死亡。伏立康唑的植物生长调控特性和相关的苯三唑被鉴定具有抑制包括模式生物拟南芥在内的大多数双子叶植物和单子叶植物体内甾醇生物合成的能力，进而影响植物生长发育。烟草甾醇突变体的筛选和深入研究，有助于深入认识甾醇合成代谢途径的分子机理。通过筛选甾醇合成代谢突变体，高甾醇突变体材料可以作为生物反应器提取甾醇作为药物生产原料；低甾醇突变体材料可以用于培育低害烟草品种。
本发明具体操作步骤如下：
(1)种子诱变处理：用pH 6.5的0.01mol/L磷酸缓冲液(Na2HPO4·12H2O-NaH2PO4·H2O)作为溶剂，配置浓度为0.6％的EMS溶液(V/V)。将红花大金元的种子加入EMS溶液中，放置于26℃、110rpm的摇床内，诱变处理16小时。处理后种子用pH 6.5的0.01mol/L磷酸缓冲液每隔半小时润洗一次，洗3次后用蒸馏水冲洗2h。经EMS诱变获得的烟草种子即为M1代种子。
(2)突变体种植：M1代种子播种后移栽大田，单株成熟后收获M2代种子。
(3)突变体种子消毒：选取红花大金元和500份红花大金元突变体M2代材料，分别取适量种子，加入无菌水配制的70％乙醇冲洗30s，再用无菌水洗涤3次，每次1min。加入无菌水配制的10％H2O2浸泡10min，再用无菌水洗涤5次。
(4)不同浓度伏立康唑的1/2MS培养基的制备
1)100μM伏立康唑溶液配制：称取0.01g伏立康唑，加入286ml无菌水，混匀，棕色瓶保存备用。
2)1/2MS培养基配制：称取MS培养基粉末2.37g，加热溶解于1000ml蒸馏水中，116℃高压灭菌30min备用。
3)设置梯度浓度：根据实验要求设计含有不同浓度伏立康唑的梯度1/2MS培养基。如下所示：
(5)适宜的甾醇抑制剂伏立康唑浓度筛选：首先检测烟草烤烟品种红花大金元在不同浓度伏立康唑的1/2MS培养基上的生长情况，探索不同浓度伏立康唑抑制红大生长情况。
将消毒后的烟草红花大金元种子分别点播于含0.00μΜ(对照)、0.01μΜ、0.03μΜ、0.1μΜ、0.3μΜ、1μΜ、3μΜ、10μΜ伏立康唑的1/2MS培养基上，保鲜膜密封后将培养皿放置于人工气候室内，培养条件温度25℃，45天后用测量尺测量植株大小及根长。结果发现，烤烟红花大金元在不同浓度伏立康唑的1/2MS培养基上生长情况如下：与对照(不添加伏立康唑)相比，在浓度为0.01μΜ、0.03μΜ、0.1μΜ、0.3μΜ、1μΜ培养基上，红花大金元整个植株正常生长，根长与对照一致；在浓度为3μΜ条件下红花大金元幼苗和根部生长发育明显受到抑制；在浓度为10μΜ条件下，幼苗和根部生长受到更强的抑制性。说明甾醇抑制剂伏立康唑影响烟苗的发育，出现矮小表型，而且随着浓度不断增大，抑制性逐渐明显(图1)。
(6)甾醇突变体的定性筛选
初期筛选发现，红花大金元在含3μM伏立康唑浓度下发育受阻，1μM浓度下正常发育。因此，选择含1μM和3μM伏立康唑的1/2MS培养基作为选择培养基，从烟草突变体中筛选在1μM伏立康唑浓度下筛选发育受阻的突变体材料，在3μM浓度下筛选生长正常的突变体材料。将消毒后的500份EMS诱导的红花大金元突变体M2代单株种子分别点播于适宜浓度的伏立康唑的1/2MS平板培养基上。每个单株点种30粒，以红花大金元作为对照，保鲜膜密封后将培养皿放置于人工气候室内，培养条件温度25℃，45天后，用测量尺测量植株大小及根长。结果共获得3份1μM伏立康唑浓度下发育受阻的突变体MHE00083、MHE00098和MHE00099，2份发育3μM浓度下生长正常的突变体MHE000065和MHE00079(图2；表1)。
表1衍生化气相色谱质谱联用法测定伏立康唑筛选的突变体中甾醇含量
(7)烟草突变体中甾醇含量定量分析验证伏立康唑法定性筛选甾醇突变体的准确性
对已经获得的3份1μM伏立康唑浓度下发育受阻的突变体，2份3μM浓度下生长发育正常的突变体，进一步移栽后打顶工艺成熟期，经对现有技术文献的检索发现，参照《衍生化气相色谱质谱联用法同时测定烟叶多种植物甾醇》测定突变体中菜油甾醇、豆甾醇、β谷甾醇含量。具体方法如下：将1μM伏立康唑浓度下生长抑制的突变体和3μM浓度下生长正常的突变体植株以及对照红花大金元植株移栽至假植盘中，约1个月后移植到大田。打顶后工艺成熟期取中部3片烟叶，将鲜烟叶样品带回实验室，去主脉，放入DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱105℃杀青10min，然后在60℃条件下烘干。烟叶切丝后40℃干燥处理8h，粉碎后混匀过40目筛。准确称取5.0000g烟末(精确至0.0001g)，用100mL丙酮超声提取30min，抽提液低压蒸干，加入25mL 1％(V/V)的硫酸乙醇溶液，75℃搅拌水解4h，冷却至室温，加入50mL2.0mol/L氢氧化钾乙醇溶液，80℃皂化60min，冷却至室温，加入35mL饱和氯化钠水溶液，用正己烷萃取3次，合并萃取液，用饱和氯化钠溶液洗涤至中性，加入10g无水硫酸钠，干燥过夜。将滤液浓缩蒸干，加入8mL无水吡啶，再加入500μL 6-酮胆甾烷醇(内标)，置于10mL衍生化试管中，依次加入0.4mL六甲基二硅胺烷和0.2mL三甲基氯硅烷，常温振荡1min，静置10min，离心5min(3000r/min)，取上清液，过0.22μm有机相微滤膜，取滤液立即进行GC/MS分析。气相色谱条件：色谱柱-[HP-5MS(60m×0.25mm×0.25μm)]；进样量2.0μL，分流比10:1；进样口温度280℃；载气-He；流速2.0mL/min；程序升温180℃下保持10min，然后以35℃/min的速率升至275℃，保持42min。质谱条件：离子源温度230℃；四极杆温度150℃；EI源；电离电压70eV；辅助加热区280℃；采集模式-全扫描(Scan)与选择离子检测(SIM)同时采集。结果发现，红花大金元中菜油甾醇、豆甾醇和β谷甾醇总含量为758.05mg/kg,而突变体MHE00083、MHE00098和MHE00099三种甾醇总含量分别为475.43mg/kg、414.71mg/kg和359.09mg/kg，突变体MHE000865和MHE00079中三种甾醇总含量分别为1074.80mg/kg和1201.35mg/kg(表1)。3μM浓度下生长正常的突变体单株三种甾醇总含量远远大于1μM伏立康唑浓度下发育受阻的突变体单株三种甾醇总含量。该结果说明利用抑制剂伏立康唑能够有效的筛选甾醇含量突变体。
本发明优点：烟草中常见甾醇的分析方法有衍生化气相色谱法、高效液相色谱法、超临界流体色谱法和气相色谱质谱联用法等。这些植物甾醇定量分析的方法需经过样品处理，(烟苗移植到大田长至成株时期采样、烘干、研磨)萃取分离，纯化富集，定量检测等分析步骤。这些方法测定周期长，步骤繁琐，不适用于大批量材料的筛选。本次报道了一种简易的定性筛选烟草甾醇含量突变体的方法，并利用标准的GC/MS定量测定甾醇的方法对筛选结果进行了验证分析，该方法能够对烟叶总甾醇物质进行定性检测，筛选方法操作简单、成本低、效率高，可适用于大量突变体和群体单株筛选。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种烟草甾醇突变体的筛选方法，包括以下步骤：
⑴、用甲基磺酸乙酯处理烟草种子，获得M1代种子；
⑵、对M1代种子进行种植，成熟后单株收获，获得M2代种子；
⑶、配制梯度浓度的含伏立康唑的1/2MS培养基；
⑷、利用步骤⑶梯度浓度的含伏立康唑的1/2MS培养基，培育烟草种子，根据烟草种子的生长发育，获得烟草种子生长发育对应的含伏立康唑的1/2MS培养基的梯度浓度：1μM和3μM；
⑸、采用步骤⑷梯度浓度的含伏立康唑的1/2MS培养基，来培育M2代种子，根据M2代种子的生长发育状态，筛选烟草甾醇含量最低和最高的突变体。
2.如权利要求1所述烟草甾醇突变体的筛选方法，其特征在于：步骤⑴为：用pH 6.5的0.01mol/L磷酸缓冲液作为溶剂，配置体积浓度为0.6％的甲基磺酸乙酯溶液；将烟草种子加入甲基磺酸乙酯溶液中，放置于26℃、110rpm的摇床内，处理16小时。
3.如权利要求2所述烟草甾醇突变体的筛选方法，其特征在于：摇床处理后的种子，用pH 6.5的0.01mol/L磷酸缓冲液每隔半小时润洗一次，洗3次后用蒸馏水冲洗2h。
4.如权利要求1所述烟草甾醇突变体的筛选方法，其特征在于：步骤⑶包括：
①、配制100μM伏立康唑溶液；
②、1/2MS培养基配制：称取MS培养基粉末2.37g，加热溶解于1000ml蒸馏水中，116℃高压灭菌30min备用；
③、设置梯度浓度：将梯度浓度的伏立康唑溶液分别加入1/2MS培养基中，得到梯度浓度的伏立康唑的1/2MS培养基。
5.如权利要求1所述烟草甾醇突变体的筛选方法，其特征在于：烟草种子为红花大金元。
6.如权利要求5所述烟草甾醇突变体的筛选方法，其特征在于：步骤⑶的浓度梯度为0.01μΜ、0.03μΜ、0.1μΜ、0.3μΜ、1μΜ、3μΜ和10μΜ。
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