CN106092988B - 基于soi自发光特性的包虫蛋白分子的快速检测方法 - Google Patents
基于soi自发光特性的包虫蛋白分子的快速检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及包虫蛋白分子检测技术领域,是一种基于SOI自发光特性的包虫蛋白分子的快速检测方法,其按下述方法进行:将需要检测的包虫蛋白分子待测样品滴加到SOI基多孔硅上,然后进行干燥,用紫外可见荧光分光光谱仪测其荧光,激发波长为320nm至450nm,建立线性回归方程。本发明将具有无标记特性的SOI技术引入包虫蛋白分子检测的领域,在SOI材料上制备出的SOI基多孔硅用于检测包虫蛋白分子,其工艺简单、成本低廉、可控性强,根据光谱数据的变化可以实现待检测物的定量检测工作,检测流程更简单,操作方便快捷,检测时间短,为3小时至4小时,为研发基于SOI技术的可定量包虫病诊断技术提供了有利条件。
Description
技术领域
本发明涉及包虫蛋白分子检测技术领域,是一种基于SOI自发光特性的包虫蛋白分子的快速检测方法。
背景技术
绝缘体上硅(Silicon On InsulAtor,SOI)最初应用于微电子领域,它不仅具有良好的电学特性,同时还有良好的光学性能。近年来,基于SOI衬底的光子器件在光学领域迅速发展,基于SOI材料的光子器件已实际应用,如波导光栅(Rea I,Marino A,Iodice M,Coppola G,Rendina I,Destefano L.A porous silicon Bragg grating waveguide bydirect laser writing.J Phys-Condens Mat 2008;20:3931-3939)、光学微腔、光开关(Afonina SM.All-optical switching in photonic crystals based on poroussilicon.Plant Soil 1978;49:703-709.)和光子晶体等。在SOI材料上制备出多孔硅光波导或光子晶体,其工艺简单、成本低廉、可控性强,可作为高灵敏度的光子生物传感器,成为开发生物传感器阵列芯片的途径之一。目前,该材料已开发出针对DNA进行无标记检测的芯片(Kim SK,Cho H,Park HK,Kim JH,Chung BH.Fabrication of nanochannels byanisotropic wet etching on Silicon-on-Insulator wafers and their applicationto DNA stretch.J Nanosci Nanotecheno 2010;10:637-642.;Zhang H,Jia Z,Lv X,ZhouJ,Chen L,Liu R,Ma J.Porous silicon optical microcavity biosensor on silicon-on-insulator wafer for sensitive DNA detection.Biosens Bioelectron 2013;44:89-94.;Lv X,Zhong F,Jia Z,Chen L,Ma J,Zhang H,Cao Z,Zhou J.Development ofsilicon-on-insulator-based nanoporous si licon photonic crystals for label-free DNA detection.Opt Eng 2013;52)。
包虫病(Echinococcosis)是棘球绦虫寄生于人及某些动物等宿主体内所致的一种严重的人畜共患性疾病,呈世界性分布。引起人体包虫病的棘球绦虫主要有两种,即多房棘球绦虫(Echinococcus multiloculAris,Em)和细粒棘球绦虫(McManus DP,Zhang W,LiJ,Bartley PB.Echinococcosis.Lancet 2003;362:1295-1304.)。据“十二五”包虫病五年防治行动计划,我国现有50万包虫病例,受威胁人口达六千六百万以上,23个省、自治区均有包虫病例报道,流行区平均每10万人口就有患者2900例,仅新疆平均每年手术治疗病例就在2000例以上(Jiang C.Today's regional distribution of echinococcosis inChina.Chinese Medical Journal 2002;115:1244-1247.)。包虫病患每年造成经济损失达30亿元(Budke CM,Deplazes P,Torgerson PR.Global socioeconomic impact of cysticechinococcosis.Emerg Infect Dis 2006;12:296-303.)。按WHO以2%人群发病率为高发地区,西北畜牧业发达的省份现有大面积的高发区,其中青海、甘肃、宁夏、新疆部分地区人群患病率可高达5%至10%,是西部牧民群众“因病致贫、因病返贫”的原因之一(郭莉,阳爱国,侯巍.四川省家畜包虫病防治现状及防控对策探讨.草业与畜牧2011;192:52-54.;王立英,伍卫平,朱雪花.2004-2008年全国包虫病疫情分析.中国人兽共患病学报2010;26:699-702.)。抗原B(RiganòR,Buttari B,Profumo E,Ortona E,Delunardo F,Margutti P,Mattei V,Teggi A,Sorice M,Siracusano A.Echinococcus granulosus antigen Bimpairs human dendritic cel l differentiation and polarizes immaturedendritic cell maturation towards a Th2cel l response.Infect Immun 2007;75:1667-1678.)、Em18和P38(Gelmedin V,Caballero-Gamiz R,Brehm K.Characterizationand inhibition of a P38-l ike mitogen-activated protein kinase(MAPK)fromEchinococcus multilocularis:Antiparasitic activities of P38MAPKinhibitors.Biochem Pharmacol 2008;76:1068-1081.)等蛋白是包虫中的重要功能蛋白,定量检测这些蛋白对于指导包虫病的临床治疗具有重要意义(Fujimoto Y,Ito A,Ishikawa Y,Inoue M,Suzuki Y,Ohhira M,Ohtake T,Kohgo Y.Usefulness ofrecombinant Em18-ELISA to evaluate efficacy of treatment in patients withalveolar echinococcosis.J Gastroenterol 2005;40:426-431.)。目前在科研方面一般通过ELISA或免疫印迹的方法,半定量检测这些蛋白的表达。ELISA和免疫印迹这两种技术,需要专门的仪器设备,实验操作较为复杂,检测周期较长,一般为1天至2天。
发明内容
本发明提供了一种基于SOI自发光特性的包虫蛋白分子的快速检测方法,克服了上述现有技术之不足,其能有效解决目前通过ELISA或免疫印迹的方法进行半定量检测包虫蛋白分子的方法存在操作复杂和检测周期较长的问题。
本发明的技术方案是通过以下措施来实现的:一种基于SOI自发光特性的包虫蛋白分子的快速检测方法,按下述步骤进行:第一步,将需要检测的包虫蛋白分子待测样品滴加到SOI基多孔硅上,然后将滴加有包虫蛋白分子待测样品的SOI基多孔硅干燥至肉眼看不见水分为止,用紫外可见荧光分光光谱仪测干燥后的滴加有包虫蛋白分子待测样品的SOI基多孔硅的荧光,激发波长为320nm至450nm;第二步,根据不同浓度包虫蛋白分子待测样品检测得到的荧光变量,建立荧光下降程度与包虫蛋白分子浓度之间的线性回归方程,进而,由线性回归方程可以得知不同荧光下降程度下包虫蛋白分子的浓度。
下面是对上述发明技术方案的进一步优化或/和改进:
上述SOI基多孔硅按下述方法得到:将晶向<100>、电阻率为3Ω·cm至3.5Ω·cm、厚度为500μm至550μm的SOI单晶硅片切成2cm×2cm的正方形,在超声仪中依次用丙酮、无水乙醇、去离子水将其彻底清洗10min,将清洗好的SOI单晶硅片放到腐蚀槽中,使SOI单晶硅片浸泡于腐蚀液浓度为HF:C2H5OH的体积比为1:3的混合液中,在腐蚀电流强度为35mA/cm2的条件下进行电化学腐蚀600s,然后用去离子水反复冲洗经过电化学腐蚀的SOI单晶硅片并在氮气中干燥,最后将其在空气中氧化72小时后得到SOI基多孔硅。
上述SOI单晶硅片为N型SOI单晶硅片,在进行电化学腐蚀时,在腐蚀槽上方15cm处放置卤素灯,光照强度为100lux。
上述紫外可见荧光分光光谱仪的激发波长为370nm。
上述包虫蛋白分子为抗原B或Em18抗原或P38抗原。
上述将滴加有包虫蛋白分子待测样品的SOI基多孔硅在室温下干燥1小时至3.5小时即可。
本发明提供了一种基于SOI自发光特性的包虫蛋白分子的快速检测方法,将具有无标记特性的SOI技术引入包虫蛋白分子检测的领域,在SOI材料上制备出的SOI基多孔硅,是一种高灵敏度的光子生物传感器,该SOI基多孔硅可用于检测包虫蛋白分子,其工艺简单、成本低廉、可控性强,根据光谱数据的变化可以实现待检测物的定量检测工作,比免疫印迹、ELISA等蛋白质定量方法相比,检测流程更简单,操作方便快捷,检测时间短,为3小时至4小时,为研发基于SOI技术的可定量包虫病诊断技术提供了有利条件。
附图说明
图1为本发明中SOI基多孔硅加生物前标尺条为500nm SEM的SEM图。
图2为本发明中SOI基多孔硅加生物前标尺条为100nm SEM的SEM图。
图3为本发明中SOI基多孔硅加生物后标尺条为500nm SEM的SEM图。
图4为本发明中SOI基多孔硅加生物后标尺条为100nm SEM的SEM图。
图5为本发明中单晶硅片基底多孔硅与SOI基多孔硅光致发光对比图。
图6为本发明中SOI基多孔硅加生物前后的FTIR图谱。
图7为本发明中SOI基多孔硅加P38抗原前后的荧光图谱。
图8为本发明中SOI基多孔硅加NaCl前后的荧光图谱。
图9为本发明中SOI基多孔硅荧光下降量与P38抗原浓度的定量分析图。
具体实施方式
本发明不受下述实施例的限制,可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。
本发明中所提到各种化学试剂和化学用品如无特殊说明,均为现技术中公知公用的化学试剂和化学用品;本发明中的百分数如没有特殊说明,均为质量百分数;本发明中的溶液若没有特殊说明,均为溶剂为水的水溶液,例如,盐酸溶液即为盐酸水溶液。
下面结合实施例对本发明作进一步描述:
实施例1,该基于SOI自发光特性的包虫蛋白分子的快速检测方法按下述步骤进行:第一步,将需要检测的包虫蛋白分子待测样品滴加到SOI基多孔硅上,然后将滴加有包虫蛋白分子待测样品的SOI基多孔硅干燥至肉眼看不见水分为止,用紫外可见荧光分光光谱仪测干燥后的滴加有包虫蛋白分子待测样品的SOI基多孔硅的荧光,激发波长为320nm至450nm;第二步,根据不同浓度包虫蛋白分子待测样品检测得到的荧光变量,建立荧光下降程度与包虫蛋白分子浓度之间的线性回归方程,进而,由线性回归方程可以得知不同荧光下降程度下包虫蛋白分子的浓度。
实施例2,作为实施例1的优化,SOI基多孔硅按下述方法得到:将晶向<100>、电阻率为3Ω·cm至3.5Ω·cm、厚度为500μm至550μm的SOI单晶硅片切成2cm×2cm的正方形,在超声仪中依次用丙酮、无水乙醇、去离子水将其彻底清洗10min,将清洗好的SOI单晶硅片放到腐蚀槽中,使SOI单晶硅片浸泡于腐蚀液浓度为HF:C2H5OH的体积比为1:3的混合液中,在腐蚀电流强度为35mA/cm2的条件下进行电化学腐蚀600s,然后用去离子水反复冲洗经过电化学腐蚀的SOI单晶硅片并在氮气中干燥,最后将其在空气中氧化72小时后得到SOI基多孔硅。
实施例3,作为实施例2的优化,SOI单晶硅片为N型SOI单晶硅片,在进行电化学腐蚀时,在腐蚀槽上方15cm处放置卤素灯,光照强度为100lux。
实施例4,作为上述实施例的优化,紫外可见荧光分光光谱仪的激发波长为370nm。
实施例5,作为上述实施例的优化,包虫蛋白分子为抗原B或Em18抗原或P38抗原。
实施例6,作为上述实施例的优化,将滴加有包虫蛋白分子待测样品的SOI基多孔硅在室温下干燥1小时至3.5小时即可。
本发明中的包虫蛋白分子待测样品为纯化的包虫蛋白分子,可以为纯化的抗原B蛋白分子或纯化的Em18抗原蛋白分子或纯化的P38抗原蛋白分子。
本发明提供了一种基于SOI自发光特性的包虫蛋白分子的快速检测方法,将具有无标记特性的SOI技术引入包虫蛋白分子检测的领域,在SOI材料上制备出的SOI基多孔硅,是一种高灵敏度的光子生物传感器,该SOI基多孔硅可用于检测包虫蛋白分子,其工艺简单、成本低廉、可控性强,根据光谱数据的变化可以实现待检测物的定量检测工作,比免疫印迹、ELISA等蛋白质定量方法相比,检测流程更简单,操作方便快捷,检测时间短,为3小时至4小时,为研发基于SOI技术的可定量包虫病诊断技术提供了有利条件。
将包虫蛋白分子滴加到在SOI材料上通过电化学腐蚀制备出的可发光的SOI基多孔硅上,发现滴加包虫蛋白分子后,SOI基多孔硅的荧光强度会下降,而SOI基多孔硅的的荧光下降程度与蛋白浓度之间的关系是随着蛋白浓度的逐渐增大,SOI基多孔硅的荧光下降程度也在增加。
具体分析过程:
一、实验步骤
N型SOI单晶硅片(晶向<100>,电阻率3Ω·cm至3.5Ω·cm,厚度525±25μm),将N型SOI单晶硅片切成2cm×2cm的正方形,在超声仪中依次用丙酮、乙醇、去离子水将其彻底清洗10min,把清洗好的N型SOI单晶硅片放到腐蚀槽中,并在腐蚀槽上方15cm处放置卤素灯,光照强度为100lux,N型SOI单晶硅片浸泡于腐蚀液浓度为HF:C2H5OH=1:3(体积比)的混合液中,腐蚀电流强度为35mA/cm2,腐蚀时间为600s,进行电化学腐蚀,结束后用去离子水反复冲洗并在氮气中干燥,最后将其在空气中氧化72小时得到SOI基多孔硅。
氧化完成之后,取六片多孔硅,并分别用紫外可见荧光分光光谱仪测所有SOI基多孔硅的荧光,激发波长为370nm,配制六种不同浓度的包虫P38蛋白分子待测样品,浓度分别为2×10-3mg/mL、2×10-4mg/mL、2×10-5mg/mL、2×10-6mg/mL、2×10-7mg/mL、2×10-8mg/mL;取每种浓度10μg,分别滴到六片SOI基多孔硅上,在室温条件下自然干燥3.5小时,再用紫外可见荧光分光光谱仪测滴有包虫P38蛋白分子待测样品的SOI基多孔硅,激发波长370nm,并将滴加包虫P38蛋白分子待测样品前后的SOI基多孔硅的荧光迁移进行对比分析。
二、结果与讨论
电镜特征分析:如图1和图2所示,给出了N型大电阻率SOI硅片制备的SOI基多孔硅的正面形貌,可以看到SOI基多孔硅表面的平均孔径约为500nm左右,各类分子可以充分的进入。
如图3和图4所示,给出了加入包虫抗原后SOI基多孔硅的正面形貌,我们看到SOI基多孔硅孔洞很多被抗原分子所填充,与单晶硅片上制备多孔硅类似,通过不同分辨率照片的对比分析,我们可以明显的发现对于包虫分子这种大分子进入,SOI基多孔硅的孔洞(至少是表面)大部分被填充,SOI基多孔硅复杂的孔隙结构对于大分子有很好的包嵌作用。
SOI基多孔硅荧光特性分析:如图5所示,图5是单晶硅片基底多孔硅与SOI基多孔硅光致发光对比图,可以看到相同的实验条件和光致发光入射激发光下,SOI基多孔硅发光中心发生了明显的红移,可以推测其纳米硅单元内部有较大的不同,这与电化学腐蚀制备SOI基多孔硅时阴、阳两极均在表面有关。
FTIR特性分析:为了确认是否能够将包虫蛋白分子较好的包嵌到到SOI基多孔硅中,实验采用傅里叶变换红外光谱仪观测了样品的红外吸收光谱,如图6所示。可以看到,加入包虫蛋白分子之前,769cm-1附近出现了明显的Si-H键特征峰,加入抗原之后在3000cm-1处出现了-NH键特征峰,表明包虫蛋白分子充分嵌入到了SOI基多孔硅的孔洞之中。
包虫病P38蛋白分子快速检测实验与分析:图7是多孔硅浸泡2×10-4mg/mL包虫P38蛋白分子待测样品前后的荧光对比示意图,与APTES类似,包虫P38蛋白进入到SOI基多孔硅后,会导致SOI基多孔硅的光致发光的部分淬灭,从图7中可以看到,浸泡2×10-4mg/mL包虫抗原包虫P38蛋白分子待测样品后,SOI基多孔硅的荧光强度下降了近400个单位。
对照实验分析:图8是滴加NaCl溶液的对照实验光谱图,图中我们可以看到,滴加过NaCl溶液的SOI基多孔硅前后的荧光图谱下降不多,检测实验中荧光光谱发生了红移,说明滴加NaCl溶液对SOI基多孔硅发光中心的偏移也具有一定的影响,但是荧光强度几无改变,因为NaCl为小分子,说明SOI基多孔硅对类似于NaCl等小分子的包嵌效果一般,结合图7可知,SOI基多孔硅对类似于包虫P38蛋白分子等大分子的包嵌效果较好,包嵌效果好,检测结果也更为准确。
结果的定量分析:图9反映了不同包虫抗原浓度对应SOI基多孔硅的荧光下降程度,即多孔硅的荧光下降程度与抗原浓度之间的关系,从图9中可以看到,随着抗原浓度的逐渐增大,SOI基多孔硅的荧光下降程度也在增加,图中实验每个点基于3次同样实验的平均值,可以看到呈近似线性关系,建立线性方程,便能根据荧光下降量得知包虫蛋白分子待测样品,同APTES实验类似,这也和SOI基多孔硅荧光机理的复杂性有关。
本发明所用的实验材料如表1所示,本发明所用的实验材料如表2所示。
表1、实验材料
表2、实验仪器
仪器 | 产地 |
Labview8.0软件(National Instruments) | 美国 |
卤素灯 | 实验室自制 |
紫外可见分光光谱仪(Hitachi U-4100) | 日本 |
场发射扫描电子显微镜(ZEISS SUPRA55VP) | 德国 |
高温节能箱式电阻炉 | 湖北英山国营无线电元件厂 |
E3611A型直流电流源(Agilent) | 美国 |
单槽腐蚀槽 | 实验室自制 |
紫外可见荧光分光光谱仪(F4600) | 日本 |
以上技术特征构成了本发明的实施例,其具有较强的适应性和实施效果,可根据实际需要增减非必要的技术特征,来满足不同情况的需求。
Claims (6)
1.一种基于SOI自发光特性的包虫蛋白分子的快速检测方法,其特征在于按下述步骤进行:第一步,将需要检测的包虫蛋白分子待测样品滴加到SOI基多孔硅上,然后将滴加有包虫蛋白分子待测样品的SOI基多孔硅干燥至肉眼看不见水分为止,用紫外可见荧光分光光谱仪测干燥后的滴加有包虫蛋白分子待测样品的SOI基多孔硅的荧光,激发波长为320nm至450nm;第二步,根据不同浓度包虫蛋白分子待测样品检测得到的荧光变量,建立荧光下降程度与包虫蛋白分子浓度之间的线性回归方程,进而,由线性回归方程可以得知不同荧光下降程度下包虫蛋白分子的浓度;其中:包虫蛋白分子为P38抗原。
2.根据权利要求1所述的基于SOI自发光特性的包虫蛋白分子的快速检测方法,其特征在于SOI基多孔硅按下述方法得到:将晶向<100>、电阻率为3Ω·cm至3.5Ω·cm、厚度为500µm至550µm的SOI单晶硅片切成2cm×2cm的正方形,在超声仪中依次用丙酮、无水乙醇、去离子水将其彻底清洗10min,将清洗好的SOI单晶硅片放到腐蚀槽中,使SOI单晶硅片浸泡于腐蚀液浓度为HF:C2H5OH的体积比为1:3的混合液中,在腐蚀电流强度为35mA/cm2的条件下进行电化学腐蚀600s,然后用去离子水反复冲洗经过电化学腐蚀的SOI单晶硅片并在氮气中干燥,最后将其在空气中氧化72小时后得到SOI基多孔硅。
3.根据权利要求2所述的基于SOI自发光特性的包虫蛋白分子的快速检测方法,其特征在于SOI单晶硅片为N型SOI单晶硅片,在进行电化学腐蚀时,在腐蚀槽上方15cm处放置卤素灯,光照强度为100lux。
4.根据权利要求1或2或3所述的基于SOI自发光特性的包虫蛋白分子的快速检测方法,其特征在于紫外可见荧光分光光谱仪的激发波长为370nm。
5.根据权利要求1或2或3所述的基于SOI自发光特性的包虫蛋白分子的快速检测方法,其特征在于将滴加有包虫蛋白分子待测样品的SOI基多孔硅在室温下干燥1小时至3.5小时即可。
6.根据权利要求4所述的基于SOI自发光特性的包虫蛋白分子的快速检测方法,其特征在于将滴加有包虫蛋白分子待测样品的SOI基多孔硅在室温下干燥1小时至3.5小时即可。
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