CN106085964B - 一种鸭坦布苏病毒ns1蛋白单克隆抗体及其识别的b细胞表位及其应用 - Google Patents
一种鸭坦布苏病毒ns1蛋白单克隆抗体及其识别的b细胞表位及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一株分泌鸭坦布苏病毒NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株、其分泌的单克隆抗体及其鉴定的TMUV‑NS1蛋白的TMUV特异性细胞表位。本发明利用TMUV NS1蛋白制备了单克隆抗体，利用单克隆抗体筛选鉴定了1个NS1蛋白的B细胞表位269DEKEIV313，该表位具有高度的保守性和特异性，可用于TMUV多肽疫苗的研制及特异性血清学方法的建立等方面。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种鸭坦布苏病毒NS1蛋白单克隆抗体及其识别的B细胞表位及其应用。
背景技术
坦布苏病毒感染(Tembusu virus，TMUV)是近年来新出现的一种以水禽感染为主的病毒性传染病。雏鸭感染后主要表现为瘫痪、倒地震颤等神经症状，产蛋鸭感染后主要表现为产蛋率下降、卵泡膜出血、卵泡破裂，形成卵黄性腹膜炎等病变特征。该病传播速度快，传播范围广，给养禽业造成了巨大的危害。
TMUV属于黄病毒科黄病毒属恩塔亚病毒群中的蚊媒类病毒，该病毒的基因组全长为10990bp，仅含有一个开放阅读框(Open reading frame，ORF)，编码一个多聚蛋白，包括3种结构蛋白(C，prM，E)和7种非结构蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B，NS5)。NS1蛋白是一种与细胞膜功能密切相关的糖蛋白，通常在感染细胞的表面表达或以细胞相关蛋白的形式存在，可能参与病毒早期的复制、装配和释放。NS1蛋白是病毒感染过程中产生的主要免疫原，含有多个T细胞和B细胞表位，在病毒感染后的免疫应答及诱导保护性免疫反应中发挥着重要作用。NS1蛋白诱导的免疫反应主要是基于NS1蛋白具有可溶性补体结合活性，可诱导产生非中和活性的免疫保护性抗体，而且该抗体不产生病毒的抗体依赖性增强作用。因此NS1蛋白是研制坦布苏病毒亚单位疫苗的重要靶抗原。
目前，关于TMUV感染的防控主要是通过弱毒苗或灭活疫苗的免疫。灭活苗在使用时虽然比较安全，但也存在着抗体产生的速度慢，鸭群免疫后存在一定时期的免疫空白期，而且基本不产生体液免疫，因此该疫苗的免疫效果不如弱毒苗。弱毒苗虽然免疫效果确实，但存在散毒、毒力容易返强等缺点，有可能造成在生产实践中抵抗力较弱的鸭群出现弱毒苗感染发病的情况，给养殖业带来一定的危害。
因此，通过筛选TMUV NS1蛋白的B细胞表位，研制以表位为基础的新型疫苗及特异性血清学检测方法将为临床上更好的防控该病提供重要的、有价值的工具。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一株分泌鸭坦布苏病毒NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
本发明的目的之二是提供一种由上述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，该单克隆抗体可与TMUV NS1蛋白发生特异性反应。
本发明的目的之三是鉴定一个TMUV-NS1蛋白的TMUV特异性细胞表位。
本发明采用PET-28a(+)原核表达载体对TMUV NS1蛋白进行表达，将表达的蛋白作为免疫原免疫BALB/C小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞进行融合。同时利用表达的NS1蛋白建立间接ELISA检测方法，进行杂交瘤细胞株的筛选，最终获得1株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其微生物保藏号是：CCTCC No.C2016104；分类命名是：小鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞株；保藏时间：2016.5.31；保藏单位是：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；保藏地址是：武汉市武汉大学校内。
本发明利用原核重组表达载体表达了覆盖NS1蛋白的全长的35条16氨基酸(AA)多肽，利用针对NS1蛋白的单抗与之进行反应，通过间接ELISA筛选，获得了1个16 AA多肽表位。Western-blot和Dot-ELISA方法鉴定了该表位的特异性。为了精确定位该表位，将16 AA多肽截短，构建10个原核表达载体进行短肽蛋白的表达。表达的短肽蛋白与相应的单抗进行反应，最终获得了1个6 AA线性B细胞表位，其氨基酸序列为269DEKEIV313，Dot-ELISA对该表位进行了鉴定。同时，序列对比结果显示，该表位具有高度的保守性和特异性。
综上，本发明利用TMUV NS1蛋白制备了单克隆抗体，利用单克隆抗体筛选鉴定了1个NS1蛋白的B细胞表位269DEKEIV313，该表位具有高度的保守性和特异性，可用于TMUV多肽疫苗的研制及特异性血清学方法的建立等方面。
附图说明
图1是TMUV NS1全基因扩增的电泳结果。
其中M是Marker DL2000；2是阴性对照；1、3是NS1基因PCR扩增产物。
图2是NS1蛋白纯化后的SDS-PAGE鉴定。
其中M是蛋白质Marker；1是含pET-28-NS1的BL21(DE3)经IPTG诱导；2是纯化后的NS1蛋白。
图3是单抗的Western-blot鉴定。
其中M是蛋白质Marker；C是对照，载体PET-28a(+)与单抗3G2的反应；1是单抗3G2与PET-28-NS1诱导表达的蛋白发生的反应，出现大小为46kd的条带。
图4是16 AA多肽蛋白的表达。
其中M是蛋白质Marker；1是含空载体的BL21(DE3)诱导后；2是含16AA多肽序列原核重组表达载体的BL21(DE3)诱导后的超声波沉淀；3：含16AA原核重组表达载体的BL21(DE3)诱导后的超声波上清。
图5是单抗3G2针对的B细胞表位的初步筛选。
其中阳性对照为NS1蛋白的阳性血清，阴性对照未免疫小鼠的血清。
图6是Western-Blot鉴定B细胞表位(16 AA)。
其中M是蛋白质Marker；1是阴性对照；2是NS1-27多肽蛋白与单抗3G2反应的条带。
图7是单抗3G2针对的B细胞表位的精确定位。
图中展示的是NS1-27多肽序列从氨基端和羧基端截短后的短肽蛋白与单抗3G2的反应，通过间接ELISA方法，精确筛选到单抗所针对的B细胞的精确表位。
图8是Dot-ELISA鉴定B细胞表位。
其中A1、A2、A3、A4、A5和A7是NS1-27-F-2短肽、NS1-27-F-4短肽、NS1-27-F-6短肽、NS1-27-F-7短肽、NS1-27-F-8短肽和NS1-27-R-2短肽与单抗3G2发生阳性反应；A6、A8、A9和A10是NS1-27-F-9短肽、NS1-27-R-3短肽、NS1-27-R-4短肽和NS1-27-R-6短肽与单抗3G2不发生反应。
图9是30株TMUV分离株NS1蛋白B细胞表位编码区的序列比对。
其中黑点表示相同的氨基酸，鉴定的表位用矩形标注。
图10是TMUV与不同黄病毒株NS1蛋白B细胞表位编码区的序列比对。
具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。这些实施例仅是范例性的，并不对本发明构成任何限制，本领域的技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改和替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
主要试验材料和来源：
1.细胞、毒株和抗体
TMUV-SDSG(KJ740747.1)、大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)均由山东农业大学动物科技学院禽病学研究室保存；BHK21细胞、小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14均购自武汉中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；HRP标记羊抗鼠荧光二抗购自北京博奥森生物科技有限公司；羊抗鼠酶标二抗购自北京全仕金有限公司。
2.主要试剂
琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒、质粒快速提取试剂盒、Random Premier、dNTP均购自大连宝生物工程有限公司；Trizol试剂、Taq HIFI DNA高保真扩增酶、反转录酶MLV、RNA酶抑制剂、T4 DNA连接酶、Premix Ex TaqTM kit、dd H2O等均购自北京全士金生物技术有限公司；BamHⅠ、XhoⅠ、单克隆抗体亚类鉴定试剂盒购自Thermo Scientific公司；琼脂糖、弗氏佐剂购自Sigma公司；Gelred核酸染料购自北京索莱宝科技有限公司；PEG4000、HT、氨基喋呤(A)购自Sigma公司；高糖型DMEM购自海克隆；底物显色液购自北京全士金生物公司；BCA蛋白测定试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；蛋白质Marker(Blue PlusII Protein Marker)、无支原体胎牛血清购自北京全士金生物技术有限公司；二甲基亚砜(DMSO)、青/链霉素混合液(100×)购自北京索莱宝科技有限公司；FastAP去磷酸化试剂购自MBI Fermentas公司。
3.试验动物
6～10周龄BALB/C小鼠购自山东大学医学院，SPF鸭胚购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所SPF鸭场。
实施例1 TMUV NS1蛋白单克隆抗体的制备
1.免疫原的制备
根据GenBank中发布的TMUV NS1蛋白的全基因序列(登录号：KJ740748.1)，设计引物，上游引物为：5’-CGGAATTCGACACGGGGTGCTCAATC-3’，(下划线为EcoRⅠ酶切位点)；下游引物为：5’-CCCAAGCTTAGCCATGACCTTTGATTTGA-3’，(下划线为HindⅢ酶切位点)。引物由上海生物工程有限公司合成。将本研究室分离保存的TMUV-SDSG毒株，通过尿囊腔途径接种SPF鸭胚进行病毒扩增，取400μL病毒尿囊液，采用Trizol法进行病毒RNA的提取，取出部分RNA进行反转录，得到TMUV全基因组的cDNA。以该cDNA为模板，利用设计的引物进行NS1全基因的扩增。PCR反应程序如下：95℃5min预变性，然后95℃30s,55℃30s,72℃1min进行30个循环，最后72℃延伸10min。PCR扩增结果参见图1，图1是TMUV NS1全基因扩增的电泳结果，其中M是Marker DL2000；2是阴性对照；1、3是NS1基因PCR扩增产物。将扩增产物与载体PET-28a(+)连接后构建原核重组表达载体PET-28-NS1，然后将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，进行蛋白的诱导表达。
将100mL诱导培养后的菌液离心，超声波裂解(400w，工作3s，间歇2s，共200次)，超声波裂解后的沉淀首先用PBS洗涤1次，12 000r/min×5min。之后，沉淀分别用0.5moL/L、1moL/L和3moL/L的尿素溶液进行洗涤，每次12 000r/min×5min。最后将洗涤后的沉淀用8moL/L的尿素溶液进行溶解，取部分溶液进行SDS-PAGE电泳，结果参见图2，图2是NS1蛋白纯化后的SDS-PAGE鉴定，其中M是蛋白质Marker；1是含pET-28-NS1的BL21(DE3)经IPTG诱导；2是纯化后的NS1蛋白。纯化后的NS1蛋白采用BCA蛋白测定试剂盒测定其蛋白的浓度。
2.动物免疫
采用6周龄SPF级BALB/c小鼠，通过腹部皮下注射途径进行免疫，免疫抗原为实施例1获得的纯化的NS1蛋白。首免，免疫原NS1蛋白采用弗氏完全佐剂进行乳化，NS1蛋白的剂量为100μg/只。之后每隔2周免疫1次，免疫原均采用弗氏不完全佐剂进行乳化，每次免疫的蛋白剂量不变。第3次免疫后1周，进行小鼠的眶下窦采血，间接ELISA法测定小鼠血清的效价，若为阳性，再加强免疫1次(免疫剂量加倍)，3d后进行细胞融合。
3.细胞融合
无菌获取免疫小鼠的脾淋巴细胞，与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0以3∶1的比例进行混合，融合剂采用PEG-4000。细胞融合前，小鼠摘眼球采血制备阳性血清，作为杂交瘤细胞筛选时的阳性对照。融合后的细胞用HAT选择培养基进行悬浮，分装于96孔细胞培养板中。
4.阳性杂交瘤细胞的筛选及克隆
采用间接ELISA法进行阳性杂交瘤细胞株的筛选，阳性对照采用免疫小鼠的血清，阴性对照采用骨髓瘤细胞上清和未免疫小鼠的血清。将检测结果为阳性的细胞孔中的杂交瘤细胞进行扩大培养，并及时冻存。同时采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，一般亚克隆2-3次，至到所有的亚克隆细胞孔的阳性率均为100％。将亚克隆后的阳性杂交瘤细胞株冻存备用。阳性杂交瘤细胞株命名为3G2，其微生物保藏号是CCTCC No.C2016104。
实施例2单克隆抗体的鉴定
1.单抗亚类鉴定
采用单抗亚类胶体金鉴定试剂条(Thermo Scientific)对实施例1获得的单抗进行亚类鉴定，结果显示该单抗的亚类为IgG2a，轻链为kappa链。
2.Western-blot试验
分别诱导含有重组质粒PET-28-NS1和空载体PET-28a(+)的大肠杆菌BL21(DE3)，SDS-PAGE电泳后，采用湿式转印仪将凝胶上的蛋白条带转印到硝酸纤维素(NC)薄膜上，转印条件为120V 1h。转印后的NC膜用5％脱脂乳进行封闭，4℃封闭过夜，TBST洗涤3次，5min/次。加入杂交瘤细胞株的上清，37℃作用1h，TBST洗涤3次，5min/次。加入1∶5000稀释的羊抗鼠酶标二抗，37℃作用1h，TBST洗涤3次，5min/次。DAB避光显色，流水终止反应。
结果显示，该单抗与PET-28-NS1诱导表达的NS1蛋白发生反应，在大约46kd的位置上均出现了特异性的条带，而在诱导表达的空载体PET-28a(+)的位置上没有出现任何条带，结果见图3，图3是单抗的Western-blot鉴定，其中M是蛋白质Marker；C是对照，载体PET-28a(+)与单抗3G2的反应；1是单抗3G2与PET-28-NS1诱导表达的蛋白发生的反应，出现大小为46kd的条带。
实施例3 TMUV NS1蛋白B细胞表位鉴定
1.16氨基酸(AA)多肽蛋白的表达
将NS1蛋白截短成彼此有6个氨基酸(AA)重叠的35条16 AA多肽，分别命名为NS1-1～NS1-35，具体序列见表1。根据这些多肽序列设计引物，具体序列见表1，每条引物的5’端和3’端分别引入BamH I和Xhol I酶切位点，引物退火后形成35条16 AA多肽序列。与原核表达载体PGEX-6P-1连接后，构建35个原核重组表达载体，分别转化至表达菌BL21(DE3)中，进行多肽蛋白的表达，多肽与谷胱甘肽巯基转移酶(GST)形成融合蛋白的分子量大约为27.6kd。将诱导后的菌液超声波裂解，裂解后的细菌上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳。电泳结果显示，超声波裂解后的沉淀中出现了大小为27.6kd左右的目的条带，上清中没有目的条带出现。由此可见，多肽是以包涵体沉淀的形式与GST进行了融合表达，结果参见图4，图4是16 AA多肽蛋白的表达，其中M是蛋白质Marker；1是含空载体的BL21(DE3)诱导后；2是含16AA多肽序列原核重组表达载体的BL21(DE3)诱导后的超声波沉淀；3：含16 AA原核重组表达载体的BL21(DE3)诱导后的超声波上清。多肽的纯化和定量均按照实施例1中的方法进行。
表1覆盖TMUV NS1蛋白序列全长的35条多肽及其引物
2.B细胞表位的初步筛选
采用间接ELISA方法对16 AA多肽进行筛选。以纯化的16 AA多肽蛋白为包被抗原，以NS1蛋白的单抗为一抗，最后筛选到1个针对该单抗的16 AA多肽，即NS1-27(261KVQSSGPWDEKEIVID276)，结果参见图5，图5是单抗3G2针对的B细胞表位的初步筛选；其中阳性对照为NS1蛋白的阳性血清，阴性对照未免疫小鼠的血清。
3.Western-Blot鉴定B细胞表位
用Western-Blot鉴定筛选到的16 AA多肽。将16 AA多肽进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后将凝胶上的多肽条带转印到硝酸纤维素膜(NC)上，做好标记，具体步骤参考实施例1，结果参见图6，图6是Western-Blot鉴定B细胞表位(16 AA)；其中M是蛋白质Marker；1是阴性对照；2是NS1-27多肽蛋白与单抗3G2反应的条带。阴性对照采用非免疫SPF级BalB/c小鼠的血清。
4.B细胞表位的精确定位
将NS1-27多肽进一步截短，分别截掉5’端2个AA、4个AA、6个AA、7个AA、8个AA和9个AA及3’端2个AA、3个AA、4个AA和6个AA。多肽截短后形成10条短肽序列，设计10对引物，短肽和引物的具体序列见表2，引物两端的酶切位点不变(BamH I和Xhol I)。引物退火后形成10条短肽序列，与pGEX-6P-1连接后，构建10个原核重组表达载体，分别转化至表达菌BL21(DE3)中，进行短蛋白的表达及纯化。
表2 10条短肽及其引物序列
采用间接ELISA方法进行B细胞表位的精确筛选。以纯化的10种短肽蛋白作为包被抗原，以NS1蛋白的单抗作为一抗，进行筛选。结果显示，当截去5’端2个AA(NS1-27-F-2,259QSSGPWDEKEIVID276)、4个AA(NS1-27-F-4,257SGPWDEKEIVID276)、6个AA(NS1-27-F-6,255PWDEKEIVID276)、7个AA(NS1-27-F-7,254WDEKEIVID276)和8个AA(NS1-27-F-8,253DEKEIVID276)后的短肽蛋白能与单抗3G2发生反应，而截去5’端的9个AA(NS1-27-F-9,252EKEIVID276)后的短肽蛋白则不能与单抗3G2发生反应；截去其3’端的2个AA(NS1-27-R-2,259KVQSSGPWDEKEIV274)后的短肽蛋白能与单抗3G2发生反应，而截去其3’端的3个AA(NS1-27-R-3,259KVQSSGPWDEKEI273)、4个AA(NS1-27-R-4,259KVQSSGPWDEKE272)和6个AA(NS1-27-R-6,259KVQSSGPWDE270)后的短肽蛋白则不能与单抗3G2发生反应。由此可见，单抗3G2所针对的B细胞精确表位为NS1-27多肽序列的5’端截去8个AA和3’端截去2个AA后的序列，即含有6个AA的多肽序列269DEKEIV274，命名为NS1-27-6，结果参见图7和图8，图7是单抗3G2针对的B细胞表位的精确定位，图中展示的是NS1-27多肽序列从氨基端和羧基端截短后的短肽蛋白与单抗3G2的反应，通过间接ELISA方法，精确筛选到单抗所针对的B细胞的精确表位。图8是Dot-ELISA鉴定B细胞表位，其中A1、A2、A3、A4、A5和A7是NS1-27-F-2短肽、NS1-27-F-4短肽、NS1-27-F-6短肽、NS1-27-F-7短肽、NS1-27-F-8短肽和NS1-27-R-2短肽与单抗3G2发生阳性反应；A6、A8、A9和A10是NS1-27-F-9短肽、NS1-27-R-3短肽、NS1-27-R-4短肽和NS1-27-R-6短肽与单抗3G2不发生反应。
5.Dot-ELISA试验
Dot-ELISA方法对10条短肽进行鉴定。首先用打孔器对NC膜打孔，打孔后获得圆形的NC膜，将其浸泡在PBS中5～10min，取出NC膜放置37℃恒温箱中烘干。将纯化后的10条短肽蛋白在NC膜上点样，点样后的NC膜放置在37℃恒温箱中烘干。用含0.05％吐温-20的TBST洗涤NC膜，洗涤3次，每次5min。烘干NC膜，加入NS1蛋白单抗作为一抗，37℃作用1h，TBST洗涤3次，每次5min。烘干NC膜，加入HRT标记的羊抗鼠酶标二抗，37℃作用1h，TBST洗涤3次，每次5min。烘干NC膜，加入DAB显色液，37℃作用15min，显色。观察每个圆形NC膜的颜色。
结果显示，点样NS1-27-R-2、NS1-27-F-2、NS1-27-F-4、NS1-27-F-6、NS1-27-F-7和NS1-27-F-8的6种短肽蛋白的圆形NC膜上均出现了肉眼可见的红棕色，而点样NS1-27-F-9、NS1-27-R-3、NS1-27-R-4和NS1-27-R-6的4种短肽蛋白的圆形NC膜上没有出现肉眼可见的颜色，参见图8.
6.B细胞表位的保守性和特异性分析
为了鉴定获得的B细胞表位的保守性，将上述筛选获得的6 AA表位与Genebank上发布的30株分离自不同国家、不同宿主和不同时间TMUV分离株相同表位的氨基酸序列进行同源性比对。结果显示，该表位在30株TMUV分离株中高度保守，其序列同源性均为100％，结果参见图9，图9是30株TMUV分离株NS1蛋白B细胞表位编码区的序列比对，其中黑点表示相同的氨基酸，鉴定的表位用矩形标注。这与间接ELISA的筛选结果是一致的。
为了鉴定该表位的特异性，将其与黄病毒属的其它成员(JEV、DENV、WNV、YFV、BAGV、MVEV)NS1蛋白相应的表位序列进行同源性比对，结果显示，该表位与其它黄病毒的同源性均低于50％，特异性高，结果参见图10，图10是TMUV与其它黄病毒NS1蛋白B细胞表位编码区的序列比对。
因此该表位可用于TMUV多肽疫苗的研制及特异性血清学方面的建立。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一株分泌抗鸭坦布苏病毒(Tembusu virus)NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其微生物保藏号为：CCTCC No.C2016104。
2.权利要求1所述杂交瘤细胞株在制备诊断鸭坦布苏病毒药物中的应用。
3.权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体在制备诊断鸭坦布苏病毒药物中的应用。
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