CN106084140A - 一种含胍基基团的聚酰胺、其制备方法以及由其制得的水凝胶 - Google Patents

一种含胍基基团的聚酰胺、其制备方法以及由其制得的水凝胶 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种含胍基基团的聚酰胺，为以下单体形成的共聚物：N,N'‑亚甲基双(丙烯酰胺)、胍基丁胺硫酸盐以及1‑(2‑氨基乙基)‑哌嗪。本发明还提供了所述含胍基基团的聚酰胺的制备方法以及包含其作为聚合单体的水凝胶。本发明提供的含胍基基团的聚酰胺分子结构中含有胍基基团，可作为改性试剂用于水凝胶的制备，从而提高水凝胶的生物性能，而且，还可同时与其他改性剂(如香豆素衍生物)共同作用，综合提高水凝胶性能。本发明提供的水凝胶可具备良好的自修复能力和生物相容性，可广泛用作生物相容性的自修复材料。

Description

一种含胍基基团的聚酰胺、其制备方法以及由其制得的水 凝胶
技术领域
本发明涉及生物医用材料领域，具体涉及一种含胍基基团的聚酰胺、其制备方法以及由其制备的水凝胶。
背景技术
自修复现象广泛存在于生物体中，从血液凝固到皮肤修复。这种特殊的生物过程有助于生物体恢复完整性和延长寿命。模仿这种自然的修复特性，损坏后具有自修复能力的材料在生物医学应用中是高度期望的。例如，如果应用于组织工程中，自修复支架可以自我修复在植入期间或之后可能发生的裂缝或损坏，因此使进一步手术的需求最小化并且提高治疗的功效。
现有技术已经基于各种策略开发了多种具有自我修复能力的智能材料，包括光敏自修复聚合物等。香豆素类化合物是一类包括数百种衍生物的分子，一个世纪以前科学家发现了其光敏性，目前已经广泛研究了其光裂解行为和可逆的光交联性质。香豆素部分在UVA(长波UV)辐照(320nm至400nm)下的[2+2]环加成形成环丁烷环，另一方面，当暴露于UVC(短波UV)辐照(200nm至280nm)时，香豆素光二聚体发生裂解并释放出原始的香豆素部分。因此，含有香豆素结构部分的聚合物在不同波长的UV光下展现出快速的光响应和有效的光可逆性。基于香豆素类化合物的性质，含有香豆素类化合物的聚合物也已有较多研究，并广泛应用于许多领域，包括生物化学、有机-无机混合材料、液晶材料、光-电材料以及捕光/能量转移材料等等。
近年来，也出现了对于含有香豆素类化合物的自修复材料的研究，如合成水凝胶等。然而，由于通常需要使用如甲醛这样的交联剂，这些材料的细胞相容性存在缺陷。此外，目前的合成水凝胶还具有细胞粘附性差的特点，对此，已有多项研究来改善水凝胶的生物相容性和细胞粘附性，例如，使用聚阳离子如聚(L-赖氨酸)来提高水凝胶的细胞相容性，又如，引入4-氨基丁基胍或胍基丁胺以构建具有与三肽精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)结构相似的功能性两性重复单元，该RGD存在于细胞外基质(ECM)中，含有RGD模拟单元的PAA水凝胶显示出了较好的细胞粘附性能力。
发明内容
为克服现有水凝胶在自修复、生物相容性等方面存在的不足，本发明的一个目的是提供一种含胍基基团的聚酰胺，可用于改性水凝胶。
本发明的另一个目的是提供所述含胍基基团的聚酰胺的制备方法。
本发明的还一个目的是提供一种聚酰胺水凝胶。
本发明提供的含胍基基团的聚酰胺，为以下单体形成的共聚物：
单体A：N,N'-亚甲基双(丙烯酰胺)；
单体B：胍基丁胺硫酸盐；
单体C：1-(2-氨基乙基)-哌嗪；
其中，所述单体A、单体B及单体C的摩尔比为3～20:1～10:1～5，所述共聚物的数均分子量为1000～1800。
如图3所示，含胍基基团的聚酰胺的片段端基含有双键，并与其它部分(R2)形成超枝化共聚物，其中m:n约为3～8:4～10。
本发明所述的含胍基基团的聚酰胺中，所述单体A、单体B及单体C的摩尔比可优选为12～16:4～8:2～5。
本发明提供的所述聚酰胺的制备方法为：将单体A、单体B及单体C在氢氧化锂单水合物的催化下通过共聚反应制得。所述共聚反应可采用常规的共聚反应设备或工艺，也可添加可选的助剂、溶剂、引发剂等物质。
本发明提供的聚酰胺水凝胶为聚酰胺类的水凝胶，所述水凝胶为包括丙烯酰胺类单体以及以上技术方案任一项所述的含胍基基团的聚酰胺作为聚合单体共聚形成的聚合物；其中，所述含胍基基团的聚酰胺按摩尔比为所述丙烯酰胺类单体的1～20％。
本发明所述的水凝胶中，所述含胍基基团的聚酰胺按摩尔比可优选为所述丙烯酰胺类单体的2～16％。
本发明所述的水凝胶中，所述丙烯酰胺类单体可选自现有聚酰胺水凝胶常用的单体种类，包括但不限于丙烯酰胺、(甲基)丙烯酰胺、二甲基丙烯酰胺等。
本发明所述的水凝胶由于添加了含胍基基团的聚酰胺，可明显增加水凝胶的生物相容性。在此基础上，还可进一步改进所述水凝胶的性能，如添加含有香豆素结构的聚合单体以使水凝胶具备良好的自修复性能，添加量按摩尔比可以为所述丙烯酰胺类单体的1～5％。
优选地，添加的香豆素衍生物具有以下结构：
上述香豆素衍生物通过结构改性，可以方便地被引入水凝胶的共聚结构中，反应活性好，基团的引入量可进行控制。与含胍基基团的聚酰胺共同引入水凝胶时，不会产生影响，二者都具有良好的反应活性，可共同作用改进水凝胶性质，同时，该香豆素衍生物制备过程简便，成本较低。
本发明提供的含胍基基团的聚酰胺分子结构中含有胍基基团，可作为改性试剂用于水凝胶的制备，从而提高水凝胶的生物性能，而且，还可同时与其他改性剂(如香豆素衍生物)共同作用，综合提高水凝胶性能。本发明提供的含胍基基团的聚酰胺制备过程简便，反应条件温和，适用于大规模生产。
本发明提供的水凝胶具备优异的生物相容性，在此基础上还可进一步改进其自修复性质，基于此，可广泛用作生物相容性的自修复材料。
附图说明
图1为本发明制备例1的合成路线图。
图2为本发明制备例1制得的香豆素衍生物(本文简称CMA)的1H NMR谱图。
图3为本发明所述含胍基基团的聚酰胺(本文简称PAA交联剂)的合成路线示意图。
图4为本发明制备例2制得的PAA交联剂的1H NMR谱图。
图5为本发明测试例1的水凝胶自修复过程的荧光共聚焦显微镜图像。
图6为本发明测试例1的拉伸试验相关图，其中，(a)图为水凝胶切割、接触图像；(b)-(d)图分别为拉伸试验所得的断裂延长率、拉伸应力、拉伸模量结果图表。
图7为本发明测试例1的拉伸试验测试过程图像。
图8为本发明测试例1的光可逆测试在不同条件下的应力-应变曲线图，其中，曲线1的样品为水凝胶切割后修复30分钟，曲线2的样品为水凝胶切割后修复30分钟，然后进一步暴露于254nm波长的UV光10分钟，曲线3的样品为水凝胶切割后修复30分钟，然后进一步暴露于254nm波长的UV光30分钟。
图9为本发明测试例2所得的含有或不含CMA的水凝胶的溶胀比测试结果图表。
图10为本发明测试例3培养BMSCs细胞后的活细胞/死细胞测试共聚焦显微镜图像。
图11为本发明测试例3水凝胶上培养BMSCs细胞的共聚焦显微镜图像。
图12为本发明测试例3的MTT测试归一化结果图表。
图13为本发明测试例3的BMSCs中的成骨基因表达量图表。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
所用材料2-溴-2-甲基丙酰基溴、丙烯酰氯、7-羟基-4-甲基香豆素、2-溴乙醇、三乙胺、碳酸钾、乙醇、乙醚、无水硫酸钠、二氯甲烷、氯化钠、DMSO、丙烯酰胺、N,N'-亚甲基双(丙烯酰胺)(MBA)、胍基丁胺硫酸盐、1-(2-氨基乙基)-哌嗪(AEPZ)、N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED)、过硫酸铵(APS)和氢氧化锂(LiOH)均购自Sigma-Aldrich公司，未进行进一步纯化。PBS 1x粉末，Hoechst 33342,FL phallacidin,To-Pro-3碘化物和Live-Cell染色盒均购自Invitrogen。3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2、5-二苯基四唑基溴化物(MTT)细胞活力检测盒是购自Biotium Inc.(Hayward，CA)。O.C.T.化合物购自VWR FITC荧光染料并且RT-PCR试剂盒购自Thermo Scientific。
UV照射功率为16mw/cm2。
1H NMR光谱使用Advance 300MHz光谱仪，以每百万份(ppm)报告化学位移(δ)。
制备例1端烯基香豆素的制备
如图1所示合成路线。
1、将7-羟基-4-甲基香豆素(5.0克，25.7毫摩尔)、2-溴乙醇(5.0克，40.0毫摩尔)和碳酸钾(3.0克，21.7毫摩尔)的混合物在50毫升乙醇中回流下加热20小时。然后将混合物冷却至室温，用乙醚和水稀释。分离混合物，水层用乙醚萃取。将合并的有机层用硫酸镁干燥，接着除去溶剂。得到的固体是足够纯的，无需进一步纯化即可用于下一步骤中。
2、向三乙胺(5.0克，6.89毫升，49.4毫摩尔)和步骤1所得的7-(2-羟基乙氧基)-4-甲基香豆素(5.0克，20.14毫摩尔)在80毫升二氯甲烷中的溶液中滴加丙烯酰氯(5.0克，4.48毫升，55.24毫摩尔)。在室温下搅拌12小时后，加入水。分离混合物，用二氯甲烷萃取水层。用氯化钠水溶液洗涤合并的有机层，随后用无水硫酸钠干燥并除去溶剂以得到固体。将粗产物从乙醇中重结晶，得到无色粉状晶体。
1H NMR(ppm,CDCl3)δ:,2.44(CH3,s,3H),4.28(CH2-O-芳香性,t,2He),4.55(CH2-OCO,t,2Hf),6.10(乙烯,dd,1Hh),6.28(芳香性,s,1Ha),6.38(乙烯,dd,1Hg),6.68(乙烯,dd,1Hi),7.14(O-C6H3-,d,1Hc),7.17(O-C6H3-,s,1Hd),7.64(O-C6H3-,d,1Hb)。参见图2。
制备例2PAA交联剂的制备
如图3所示合成路线。
将MBA(234毫克，1.52毫摩尔)、胍基丁胺硫酸盐(138毫克，0.6毫摩尔)和AEPZ(52毫克，0.4毫摩尔)溶解于水/甲醇(体积/体积＝5/1，总共5毫升)中，同时搅拌。当溶液澄清时，向溶液添加LiOH·H2O(25.2毫克，0.6毫摩尔)。然后将混合物缓慢搅拌，并让其在45℃下黑暗中反应72小时。反应后，将溶剂用旋转蒸发仪蒸发。通过冷冻干燥回收最终将产物并将其储存在-20℃的冰箱中备用。该产物的数均分子量为1250。
1H NMR(ppm):δ,1.5(H14+H13,m,4nH),2.0-3.0(H2+H5+H7+H9+H10+H11+H12,m,8nH),3.17(H15,t,2nH),4.53and 4.62(H1+H6,s,(2n+2)H),5.77(乙烯,dd,2H18),6.21(乙烯,dd,2H17),6.225(乙烯,dd,2H16)。参见图4。
制备例3水凝胶的制备
在1.0毫升的DMSO中添加APS(0.20毫摩尔)和TEMED，再添加丙烯酰胺(6.2毫摩尔)、7-(2-甲基丙烯酰氧基乙氧基)-4-甲基香豆素(0.31毫摩尔)和PAA交联剂(0.97毫摩尔)，在65℃下使之共聚。通过用大量DMSO洗涤，随后暴露于水中几小时，然后重复用水洗涤得到纯化后的凝胶状物质。
也可按照表1的单体用量制备水凝胶。
表1.
测试例1水凝胶的自修复能力
(1)样品制备
取制备例3所述过程制备所得的水凝胶置于两个玻璃盖玻片(25毫米×25毫米)之间用于自修复能力评价，用灭菌的PBS溶液彻底洗涤凝胶以除去化学残余物。
(2)自修复水凝胶的共聚焦激光扫描显微镜图像
将前述制备的水凝胶样品用FITC荧光染料染色，然后用刀片经过水凝胶的整个厚度划开一个裂缝，使经平分的样品在其切割截面接触并且暴露于365nm的UV光照射30分钟以进行自修复，通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)(Olympus FV1000，Japan)记录UV修复过程(λ＝365nm)，荧光图像(图5)显示，在UV处理30分钟后发生切割表面的自动融合，表明水凝胶的良好自修复能力。
(3)拉伸试验
为了进一步评价水凝胶的修复能力，进行下述拉伸试验。首先通过刀片切割20毫米长、4毫米宽和2毫米厚的水凝胶样品，将样品切割成两半，然后使两半材料在无压力下保持对齐和亲密接触(图6的(a)图)，然后分别暴露于365nm的UV光照射10分钟、20分钟、30分钟和60分钟，通过照射自修复过程之后，将连接棒固定到材料拉力机上，如图7所示，测试速率设为0.1毫米每分钟，通过软件记录应力-应变曲线。在恒定的温度和室内湿度下进行所有拉伸测试，每组样品个数为3个(n＝3)，同时测试无切割的初始水凝胶样品作为对照，以显示水凝胶的修复效率。
照射60分钟的凝胶的拉伸强度(200.2±24.7kPa)是仅照射10分钟的凝胶(44.9±17.2kPa)的近乎5倍，表明香豆素基团的引入改善了凝胶的自修复性能(图6的(c)图)。而且，照射时间的增加还显著改善了拉伸模量以及断裂延长率。照射10分钟、20分钟、30分钟和60分钟的凝胶分别表现出21.6％±7.2％、43.4％±5.2％、67.7％±10.4％和96.2％±9.5％的断裂延长率(图6的(b)图)。此外，还可以看出，60分钟的修复使切割样品恢复了88.6％的起始拉伸模量(图6的(d)图)，表明水凝胶的优异修复效率。
(4)光可逆测试
为了验证水凝胶的光可逆性质，向机械切分且随后修复的样品施加另一波长的UV光(λ<280nm)。具体而言，将20毫米长、4毫米宽和2毫米厚的水凝胶样品切成两半，随后使其修复30分钟，使修复样品分别进一步暴露于254nm波长的UV光10分钟和20分钟，再次用测试仪按照前述方法记录其拉伸强度和断裂延长率。
图8显示随着暴露时间增加，凝胶强度提高幅度降低，其可能是由于形成的环丁烷环在254nm的UV辐照下的光裂解造成的。
测试例2水凝胶的溶胀试验
在24孔板中制备了如前所述的水凝胶，然后称重并浸入室温下含PBS缓冲液(pH＝7.4)的小瓶中。在设计的时间间隔，该水凝胶从溶液中取出，拭去任何的可见表面水分后称重，使用下式计算吸收的缓冲液的百分量：
水(％)＝(Wt-W0)/W0×100
其中，Wt是在称重时间的水凝胶重量，W0是初始称量的水凝胶重量。为了减少误差，所有溶胀比率结果均得自三份样品。
如图9所示，含或不含CMA的水凝胶的溶胀比率均随时间而逐渐增大。含有CMA的水凝胶具有比不含CMA的凝胶稍低的溶胀比率，其可能源于交联密度的改变，但相差不大，说明CMA没有降低水凝胶的溶胀性质。
测试例3水凝胶的体外生物相容性测试
(1)在水凝胶上的细胞培养和生长
取制备例3所述过程制备所得的水凝胶置于玻璃盖玻片(直径：10毫米)，将玻璃盖玻片置于PBS溶液中2小时，以除去化学残余物，再将玻璃盖玻片取出并在生物安全的罩中在UV光下照射30分钟，最后，将涂覆水凝胶的玻璃盖玻片置于细胞培养皿(35毫米×10毫米)中，用补充有10％胎牛血清(FBS，GIBCO)、1.0×105UL-1的青霉素(Sigma)和100毫克/升链霉素(Sigma)的Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM,GIBCO)在37℃在5％CO2下培养小鼠骨髓基质细胞(BMSCs，来自ATCC，USA)。根据来自Invitrogen Inc.,Canada的方法进行活/死染色以评价水凝胶，使用水凝胶进行BMSCs的培养并且染色24小时和72小时，通过CLSM拍摄图像。并以不含PAA的水凝胶作为对照。
在培养24小时后，发现大多数细胞附着至水凝胶。培养72小时后，发现了一些死细胞，但是其大多数仍然是活的，如图10所示(红色为死细胞，绿色为活细胞，100微米比例尺)，BMSCs的数目在含有PAA交联剂的水凝胶中显著增加，然而，在对照组中观察到显著低的细胞密度。结果表明，PAA交联剂可能改善细胞对于水凝胶的附着。
如图11所示(200微米比例尺)，细胞在水凝胶上生长24小时后观察到细胞分布图案，图像表明，细胞倾向于在一定的方向上排列。
(2)MTT试验
使用BMSCs在37℃下在96孔培养板中通过MTT试验测试细胞活力。细胞先以每孔1×104个细胞的密度接种到96孔培养板中的水凝胶中，每两天更换培养基，在指定的时间点，将10微升MTT试剂添加至每个孔中并进一步温育4小时，然后从孔中除去溶液和将甲臜晶体溶解于200微升DMSO中，记录570nm处的吸光度(n＝3)。作为对照组，还评价了不含细胞的水凝胶。将接种的细胞活力归一化为100％，如图12所示，本发明提供的水凝胶在培养24和72小时后具有高的细胞活力。
(3)定量实时PCR分析
将100毫升培养基中的密度为每毫升2×106个细胞的小鼠骨髓基质细胞(BMSCs)接种到水凝胶上30分钟，然后，向培养皿添加2毫升培养基。2天后，将封装有细胞的水凝胶转移至含有成骨化学补充剂的FBS补充的DMEM：50毫克/ml的L-抗坏血酸-1-磷酸(Sigma)，10mM的b-甘油磷酸酯(Sigma)和100nM地塞米松(Sigma)。将含有细胞的水凝胶温育不同时间，每两天更换成骨培养基，在预定的时间间隔，用未附着的细胞抽吸介质并且用DPBS洗涤孔，然后，用液氮处理凝胶上的细胞并打碎，为了验证所有样品中的成骨分化的基因表达，总的RNA分离和cDNA合成使用TRIzol和Oligo dT(Thermo Scientific,USA)根据标准方法进行。通过SYBER Green分析仪(Applied Biosystems,USA)进行定量实时PCR(qPCR)。扩增条件如下：在95℃保持10分钟，随后40个循环的在95℃下15秒，在60℃下1分钟。使用StepOnePlusTM实时PCR系统(Applied Biosystems,USA)进行热循环和荧光检测。通过ΔCt法测定了相对于GAPDH的mRNA的表达水平。基因引物为(形式5'-3')：
SEQ ID NO：1
ALP-F：CTC CAA AAG CTC AAC ACC AAT G；
SEQ ID NO：2
ALP-R:ATT TGT CCA TCT CCA GCC G；
SEQ ID NO：3
BSP-F:CCA CAC TTT CCA CAC TCT CG；
SEQ ID NO：4
BSP-R:CGT CGC TTT CCT TCA CTT TTG；
SEQ ID NO：5
COL I–F:AAC AGT CGC TTC ACC TAC AG；
SEQ ID NO：6
COL I-R:AAT GTC CAA GGG AGC CAC；
SEQ ID NO：7
OPN-F:CTA CGA CCA TGA GAT TGG CAG；
SEQ ID NO：8
OPN-R:CAT GTG GCT ATA GGA TCT GGG；
SEQ ID NO：9
OCN:F–ATTGTGACGAGCTAGCGGAC；
SEQ ID NO：10
OCN:R-TCGAGTCCTGGAGAGTAGCC；
SEQ ID NO：11
GAPDH-F:AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG；
SEQ ID NO：12
GAPDH-R:TGT AGA CCA TGT AGT TGA GGT CA.
如图13所示(数值表示为平均值±SE(n＝3))，在BMSCs中的成骨基因(ALP、BSP、COL、OCN和OPN)表达在培养14天之后显著上升。说明水凝胶具备良好的细胞附着性，从而具备良好的生物相容性。
骨涎蛋白(BSP)是一种重要的蛋白骨通用分化物，其可以表达为成骨细胞或分化的干细胞。在第2天，发现BSP基因的表达增加并在第7天和第14天观察到相同的趋势。胶原(COL)是骨分化后期的关键标志物，也发现COL的表达水平随时间增加。骨桥蛋白(OPN)是另一种重要的与成骨相关的人类基因，起到骨的有机连接组件的作用，骨桥蛋白的表达相对低于BSP和COL，但OPN的表达在成骨细胞分化期间在7天和14天之后仍然具有正向趋势。碱性磷酸酶(ALP)是存在于人体内的所有组织中的酶，其能够从核苷酸或蛋白质除去磷酸基团，ALP可以是用于骨代谢的标记物，如果观察到高水平的ALP，一般认为已形成活性骨组织，当在水凝胶上培养BMSCs时进行ALP表达的评价，结果表明，水凝胶在两周中均具有高的ALP表达水平。骨钙素(OCN)是在骨的成骨细胞分化后期的关键标志物，在两周后OCN具有显著更高的表达。
本发明提供的水凝胶具备良好的自修复能力和生物相容性。香豆素衍生物的引入可使水凝胶显示出明显的自修复性质，修复后的长时间内还具有较高的机械强度、应力强度以及大于96％的断裂延长率。通过引入含有胍基基团的PAA交联剂，增强了细胞附着性质，从而增强了水凝胶的生物相容性。基于水凝胶的性质，可广泛用作生物相容性的自修复材料。
除非特别限定，本发明所用术语均为本领域技术人员通常理解的含义。
本发明所描述的实施方式仅出于示例性目的，并非用以限制本发明的保护范围，本领域技术人员可在本发明的范围内作出各种其他替换、改变和改进，因而，本发明不限于上述实施方式，而仅由权利要求限定。

Claims (8)

1.一种含胍基基团的聚酰胺，其特征在于，为以下单体形成的共聚物：
单体A：N,N'-亚甲基双(丙烯酰胺)；
单体B：胍基丁胺硫酸盐；
单体C：1-(2-氨基乙基)-哌嗪；
其中，所述单体A、单体B及单体C的摩尔比为3～20:1～10:1～5，所述共聚物的数均分子量为1000～1800。
2.根据权利要求1所述的聚酰胺，其特征在于，所述单体A、单体B及单体C的摩尔比为12～16:4～8:2～5。
3.权利要求1或2所述聚酰胺的制备方法，其特征在于，将单体A、单体B及单体C在氢氧化锂单水合物的催化下通过共聚反应制得。
4.一种聚酰胺水凝胶，其特征在于，所述水凝胶为包括丙烯酰胺类单体以及权利要求1或2所述的含胍基基团的聚酰胺作为聚合单体共聚形成的聚合物；其中，所述含胍基基团的聚酰胺按摩尔比为所述丙烯酰胺类单体的1～20％。
5.根据权利要求4所述的水凝胶聚合物，其特征在于，所述含胍基基团的聚酰胺按摩尔比为所述丙烯酰胺类单体的2～16％。
6.根据权利要求4或5所述的水凝胶，其特征在于，所述丙烯酰胺类单体选自丙烯酰胺、(甲基)丙烯酰胺、二甲基丙烯酰胺中的一种或多种。
7.根据权利要求4或5所述的水凝胶，其特征在于，所述聚合单体还包括香豆素衍生物，按摩尔比为所述丙烯酰胺类单体的1～5％。
8.根据权利要求7所述的水凝胶，其特征在于，所述香豆素衍生物具有以下结构：
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