CN106075417A - 一种肿瘤融合细胞疫苗的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种肿瘤融合细胞疫苗的制备方法，将αTCR及βTCR的基因融合为αβTCR，获得重组质粒后将αβTCR构建成穿梭质粒pMP71‑αβTCR，将αβTCR基因转染γδT细胞，采用电融合技术融合γδT细胞及肿瘤细胞制成疫苗。本发明利用αβTCR基因转染γδT细胞与肿瘤细胞形成融合细胞制备疫苗，该肿瘤疫苗能够对肿瘤细胞特异性识别，融合细胞诱导肿瘤细胞凋亡的能力最强，并且能够激活机体受体主动免疫来治疗肿瘤。

Description

一种肿瘤融合细胞疫苗的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种疫苗制备方法，尤其涉及一种肿瘤融合细胞的疫苗制备方法，是一种利用αβTCR基因转染γδT细胞与肿瘤细胞形成融合细胞制备疫苗。
背景技术
恶性肿瘤作为一种严重危害人类的身体健康的疾病，发病率呈现逐年上升的趋势。根据卫生部肿瘤防治办公室的数据显示，近20年来，中国每4至5个死亡者中就有1个死于癌症，已成为威胁国民健康的头号杀手。我国每年癌症发病人数约260万人，死亡约180万人。
近年来，肿瘤的免疫治疗备受关注，已成为继手术、放疗、化疗后的第4种治疗方法。主要分两种手段：一是过继性将体外扩增的具有抗肿瘤活性的特异性毒性免疫细胞，特别是将T细胞输入到体内的被动性免疫治疗；二是直接在体内刺激抗原递呈细胞(APC)扩增及细胞因子释放，达到抗肿瘤作用的主动性免疫治疗。以往，针对肿瘤的免疫治疗的研究主要集中于CD8+αβT细胞(CTL)、NK细胞和细胞因子方面，CD8+αβT细胞免疫疗法主要是通过刺激αβT细胞来诱导抗肿瘤反应，但是在肿瘤细胞中经常发现MHC分子的丢失，表现为肿瘤细胞对αβT细胞介导的细胞毒性的耐受，而其他方面的免疫治疗也不尽人意，故在较长一段时间内，肿瘤免疫治疗的基础及临床研究处于相对停滞状态(Lai Q,Ma S,Ge J,Huang Z,Huang X,etc.Tcrgammadelta(+)Cd4(-)Cd8(-)T Cells Suppress the Cd8(+)T-CellResponse to Hepatitis B Virus Peptides,and Are Associated with Viral Controlin Chronic Hepatitis B.PloS one.2014；9(2):e88475)。
传统上主要采用有抗原肽刺激树突状细胞(DC)，肿瘤细胞提取物致敏DC及基因修饰DC，但因大部分肿瘤缺乏特异性抗原肽，或易诱发自身免疫性疾病，或缺乏特异性筛选标记分子限制了这些方法的使用与效果。近年来，肿瘤细胞直接融合DC来致敏DC取得了良好的效果。尽管DC是体内最强的APC，但PBMCs中提取的DC扩增能力很低，多种因子刺激后至多获取107个混合DC(包含未成熟，成熟及衰老型)，导致它们的抗原提呈能力和持续时间良莠不齐，大大降低DC肿瘤疫苗的治疗效果(Wu Y,Wu W,Wong WM,etc.Human Gamma Delta TCells:A Lymphoid Lineage Cell Capable of Professional Phagocytosis.JImmunol.2009；183(9):5622-5629)。
发明内容
本发明针对目前抗肿瘤免疫治疗的缺陷，提供一种肿瘤融合细胞疫苗的制备方法，是一种利用αβTCR基因转染γδT细胞与肿瘤细胞形成融合细胞制备疫苗的方法。本发明通过以下步骤实现：
1.取外周血单核细胞(PBMC)，加入唑来膦酸1μM和人重组IL-2 400IU/mL并分离出γδT细胞；将HER2369(10-8M)与β2-微球蛋白(10μmol/l)加入到细胞中，37℃，放置2h；每20min轻轻点到混匀使其充分结合；用与HER2369结合的T2细胞刺激与外周血HLA-A2-T细胞；刺激7-14天后，对细胞进行梯度稀释可得到HER2特异性T细胞。
2.提取HER2特异性T细胞RNA，用提取的RNA产物来进行下一步逆转录反应，反应条件：室温10min，42℃1h，99℃5min灭活AMV Reverse Transcriptase；将反转录的cDNA置于-80度冰箱保存，备用。以反转录得到的cDNA为模板PCR合成TCRα-以及TCRβ目的片段，合成的目的片段带有Not I、EcoR I酶切位点。提取的RNA产物行PCR反应，PCR反应程序如下：预热95℃，2min；95℃变性30s，65℃退火30s，70℃延伸2min，(35个循环)70℃10min，4℃停止。凝胶电泳检测PCR产物，参照说明书用凝胶回收试剂盒回收PCR产物；或者用PCR纯化试剂盒对PCR产物进行纯化。纯化后的目的片段与载体进行酶切反应，Not I和EcoR I双酶切目的片段以及载体pMP71(比例5：1)，之后进行连接，16℃连接16h，65℃加热10min使酶灭活，连接产物转化至TOP10感受态细胞。以碱裂法提取得到pMP71/TCRαβ质粒。
3.用脂质体Lipofectamine2000将穿梭质粒pMP71-αβTCR和骨架质粒(腺病毒转染需要穿梭质粒与骨架质粒)共转染293T细胞，质粒与脂质体2000的比率为1μg:1.5μl。取2x105-5x105激活的γδT细胞，在室温下将冻存的慢病毒颗粒融化，轻轻混匀，将0.75ml慢病毒颗粒加入T细胞中；2周后，使用抗人CD3，CD45，CD4，CD8，CD45RO，CD62L抗体以及FITC标记的羊抗鼠F(ab')2抗体，进行流式细胞仪分析；转染成功HER2αβTCR-γδT细胞。
4.采用电融合技术融合γδT细胞及肿瘤细胞制成疫苗。将上述转染的HER2-αβTCR-γδT细胞与经80Gy射线照射后的SAOS-2-LUC细胞在融合介质中洗涤、重悬，细胞浓度在5×106-15×106/ml，利用电融合仪进行融合得到融合细胞。
本发明的另一个目的是提供所述方法在制备肿瘤融合细胞疫苗中的应用。
本发明制备对肿瘤细胞特异性识别且激活机体受体主动免疫的细胞疫苗，增加特异性，提高其在体内的作用时间和效果。本发明在制备出肿瘤疫苗后测试其效果，分别对肿瘤细胞进行CCK-8增殖活性检测，LDH细胞毒性反应检测，细胞凋亡流式检测。实验分组：①SAOS-2-LUC肿瘤细胞对照组、②γδT+SAOS-2-LUC细胞组、③HER2αβTCR-γδT+SAOS-2-LUC细胞组、④肿瘤融合细胞+SAOS-2-LUC细胞组，每个组别设置3个重复孔，37℃、5％CO2培养。实验结果表明，该肿瘤疫苗能够对肿瘤细胞特异性识别，融合细胞诱导肿瘤细胞凋亡的能力最强，能够激活机体受体主动免疫来治疗肿瘤。
附图说明
图1是显微镜检测γδT细胞体外诱导效果。
图2是流式细胞术鉴定γδT细胞。
图3是LDH法检测γδT细胞对SAOS的杀伤作用。
图4是ELISA检测HER2特异性(*与Control比较P<0.05，***与Control比较P<0.001，n＝3)。
图5是CCCK-8检测靶细胞增殖活性(*与Control比较P<0.05，***与Control比较P<0.01，n＝3)。
图6是LDH法检测靶细胞毒性反应(*与Control比较P<0.05，**与Control比较P<0.01，n＝3)。
图7是流式细胞术检测靶细胞凋亡。
具体实施方式
本发明结合实施例作进一步的说明。
实施例1 一种肿瘤融合细胞疫苗制备方法
1.外周血单核细胞(PBMC)的分离
取外周血单核细胞PBMC(或以RPMI 1640培养基1:1稀释外周血标本，加入含有淋巴细胞分离液的离心管(稀释静脉血与淋巴细胞分离液体积比2:1)，500×g离心20min。吸取淋巴细胞分离液界面乳白色单核细胞层，以RPMI 1640培养基洗涤2次以完全培养基调整细胞浓度至106细胞/mL备用。
2.γδT细胞的制备
1)正常人及OS患者γδT细胞的分离，计数外周血单个核细胞总量，调整细胞浓度为1～2×106/mL，取24孔板，每孔加入1mL细胞悬液，置于37℃、5％CO2培养箱内培养；
2)培养第一天加入唑来膦酸1μM和人重组IL-2 400IU/mL(Zol+IL-2组)；
3)每3d更换一次培养基，添加含人重组IL-2 400IU/mL的新鲜培养基，培养12-14d后收获正常人的γδT细胞。结果见图1。
3.γδT细胞分离、培养、鉴定
胰酶消化下细胞，1500rpm离心5min，并用0.01M PBS清洗细胞2次；用0.01M PBS制备细胞悬浮液，细胞浓度约为5×106/mL。根据细胞需要量分细胞于3个1.5mL干净的EP管中。分别标记为ctr组；IL-2组、Zol+IL-2组；Ctr组为PBS对照(未处理组)加入TCR-γδT-PE抗体+CD3-FITC抗体；IL-2组加入TCR-γδT-PE抗体+CD3-FITC抗体；Zol+IL-2组加入TCR-γδT-PE抗体+CD3-FITC抗体；上述三组细胞室温孵育30min；0.01M PBS清洗两遍，重新调整细胞浓度，上机前先用筛网过滤细胞，以防止细胞堵塞分选孔，然后上机检测。结果见图2。
4.正常人γδT细胞杀伤活性验证
将分离得到的正常人γδT细胞与SAOS共培养4h，LDH法检测γδT细胞对SAOS的杀伤作用，筛选杀伤率较高者进行后续实验。
1)将分离得到的正常人及OS患者γδT细胞与SAOS细胞共培养4h；
2)依照不同比例进行共培养，通常比例设置,1.5:1；3:1；6:1；12:1；
3)每个组别设置3个重复孔，37℃5％CO2培养；
4)24h后取上清，根据LDH ELISA检测试剂盒的说明书步骤操作；
5)酶标仪读数。结果见图3。
3.HER2特异性T细胞的制备
制备步骤
1)用RPMI-1640清洗HLA-A2+T2细胞(品牌：IBL-America，货号：Cell-02816)两次，以去除细胞培养基中的多肽；
2)将细胞以2x106/ml浓度重悬于无血清培养基(AIM-V)中；
3)将HER2369(10-8M)与β2-微球蛋白(10μmol/l)加入到细胞中，37℃，放置2h；每20min轻轻点到混匀使其充分结合；
4)RPMI-1640清洗细胞一次，重悬于培养基中；
5)用与HER2369结合的T2细胞刺激与从健康志愿者血液中分离得到HLA-A2-T细胞；
6)刺激7-14天后，对细胞进行梯度稀释可得到HER2特异性T细胞。
4.pMP71/TCRα和pMP71/TCRβ质粒构建
HER2特异性T细胞RNA提取：
1)收取激活后的HER2特异性T细胞1×106，用PBS冲洗2遍；
2)去掉上清后，向细胞沉淀中加入1ml Trizol，吹打成均匀细胞悬浮液；
3)1ml注射器来回抽吸以剪切基因组DNA，然后用注射器直接将样品转移到一新的1.5ml EP管中；
4)向EP管中加入200微升氯仿，剧烈震荡30sec，12000rpm离心5min；
5)将上清移至另一新的1.5ml EP管中，并加入等体积的异丙醇，室温放置5min；
6)12000rpm离心5min，吸走上清液；
7)加入70％乙醇700微升，不需吹打，12000rpm离心2min；
8)尽可能彻底去除上清，室温干燥使乙醇挥发；
9)用50微升DEPC水溶解沉淀；
10)取溶解的RNA 2微升加入1ml DEPC水中，紫外分光光度计测量260nm和280nm的吸光度值。按1OD＝40微克RNA计算RNA的产率：OD260/280在1.8-2.0视为提取的RNA纯度很高；
11)用提取的RNA产物来进行下一步RT反应。
表1 RT反应条件
OligodT-Adaptor Primer 0.5μL
dNTP Mixture(各10nM) 1μL
AMV Reverse Transcriptase 0.5μL
10X RT Buffer 1μL
RNase Free dH2O 3.75μL
MgCl 2 2μL
RNase Inhibitor 0.25μL
总RNA 1μL
Total 10μL
RT反应条件：室温10min，42℃1h，99℃5min灭活AMV Reverse Transcriptase；将反转录的cDNA置于-80度冰箱保存，备用。以反转录得到的cDNA为模板PCR合成TCRα-以及TCRβ目的片段，合成的目的片段带有Not I、EcoR I酶切位点。
表2 PCR体系
Synthesized cDNA 2μL
3’Primer(10μM) 1.6μL
5’Primer(10μM) 1.6μL
dNTP(2mM) 4μL
MgSO 4(25mM) 1.2μL
Buffer(10x) 4μL
Pfu Polymerase(5U/μl) 0.5μL
DEPC H2O To 40μL
Total 40μL
表3 PCR引物表
PCR反应程序如下：预热95℃，2min；95℃变性30s，65℃退火30s，70℃延伸2min，(35个循环)70℃10min，4℃停止。凝胶电泳检测PCR产物，参照说明书用凝胶回收试剂盒回收PCR产物；或者用PCR纯化试剂盒对PCR产物进行纯化。纯化后的目的片段TCR-HER2-1α和TCR-HER2-1β(具体序列详见序列表)与载体进行酶切反应，具体操作如下：
Not I和EcoR I双酶切目的片段以及载体pMP71(比例5：1)，之后进行连接，过程见表4。
表4 Not I和EcoR I双酶切体系：
PCR product/pMP71-GFP 2.5/40μg
Not I(10U/ml) 4μL
EcoR I(10U/ml) 4μL
NEB buffer 4(10x) 10μL
BSA(10x) 10μL
DEPC H2O To 100μL
Total 100μL
37℃酶切2h后进行连接，连接体系见表5。
表5
目的片段 279ng
pMP71 362ng
T4ligase(5U/μl) 1μL
Ligase Buffer(10x) 1μL
DEPC H2O To 10μL
Total 10μL
16℃连接16h，65℃加热10min使酶灭活，连接产物转化至TOP10感受态细胞。
质粒DNA的转化TOP10感受态细胞：
1)无菌状态下取新鲜感受态500微升；如果使用冻存的感受态细胞时，则将其从-70℃冰箱取出，置于冰上，待其解冻后立即吸取500微升，剩余的感受态可弃去，不能再冻存复用；
2)每管加入2微升连接产物，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30min；
3)42℃热激45s，冰上静置2min；
4)每管加200μl S.O.C培养基，37℃，300rpm 1h；
5)用无菌弯头玻璃铺菌器将100微升菌液铺于含氨卞青霉素(Amp)的LB平板表面，37℃平放20min，然后倒置培养过夜。挑取阳性克隆进行测序及PCR验证。
碱裂解法小量提取质粒(QIAGEN公司质粒提取试剂盒)：
1)用无菌牙签从LB平板上挑取单个菌落，接种于3mL含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养液中，37℃230×g，剧烈振摇12～16h；
2)取2mL菌液置eppendorf管中，12000×g离心2min，弃上清液；
3)用250μL的SolutionⅠ(含RNase A)充分悬浮细菌沉淀(注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器(Vortex)等剧烈振荡使菌体充分悬浮)；
4)加入150μL的SolutionⅡ轻轻地上下翻转混合5～6次，随后将离心管放置于冰上1～2min，使菌体充分裂解，形成透明溶液(此步骤不宜超过2min)；
5)加入150uL SolutionⅢ，立即温和颠倒离心管数次，室温放置5min。12000×g离心12min。要得到更好的质粒提取效果，请于步骤2和步骤3，冰上放置；
6)将420uL结合缓冲液加入离心吸附柱中，然后将步骤5中的上清加入A型离心吸附柱中(尽量去除杂质)，混匀，12000×g离心30s。倒掉废液收集管中的废液；
7)加入750uL漂洗液于离心吸附柱中，静置1min后，12000×g离心15s。倒掉废液收集管中的废液。重复一次。倒掉废液后。再次于12000×g离心2min，尽量除去漂洗缓冲液；
8)小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的1.5mL Eppendorf离心管中，加入适量dH2O水或洗脱缓冲液(Elution buffer)，室温放置2～5min后，12，000×g离心1min；
9)柱子上还挂有适量质粒DNA，重复步骤8，取20uL洗脱，室温放置1～3min，12000×g离心1min，最后将洗脱的体积合为一管。
以克隆得到的pMP71/TCRα和pMP71/TCRβ质粒为模板，进行αβTCR的基因融合及克隆，获得重组质粒后将αβTCR连接到腺病毒穿梭质粒pMP71载体中构建穿梭质粒pMP71-αβTCR；具体操作步骤如下：αβTCR重组质粒与pMP71载体分别进行Not I、EcoR I双酶切，酶切体系见表6。
表6
将酶切产物进行纯化，准备连接，过程参见表7。
表7连接体系
目的片段 588ng
pMP71 362ng
T4ligase(5U/μl) 1μL
Ligase Buffer(10x) 1μL
DEPC H2O To 10μL
Total 10μL
16℃连接16h，65℃10min使酶失活，将连接产物转化至TOP10感受态中。质粒的提取参照上法。将阳性克隆进行PCR及测序验证。
碱裂解法小量提取质粒(QIAGEN公司质粒提取试剂盒)方法见上。
重组质粒的大量提取(QIAGEN公司无内毒素质粒大提试剂盒)，大量制备穿梭质粒为转染做准备：
1)收集菌体：500ml离心管收集菌体，4500rpm 10min，加STE 15m悬浮菌液于50ml离心管中；
2)4℃，8000rpm，15min去上清，菌液悬浮于solution I 3.2mL；
3)加solution II 6.4mL，立即温和震荡，至菌体清亮，室温放置3-10min；
4)加solution III 4.8mL，立刻摇匀，于0℃放3-5min；
5)4℃，8000rpm，15rain，收集上清于50ml离心管；
6)加等体积氯仿：异戊醇(24：1)混匀，4℃，8000rpm，15min；
7)取上清于50ml离心管中，加0.6倍体积的异丙醇，20℃30min；
8)4℃，8000rpm，15min，去上清；
9)加lml 50×TE，溶解沉淀，再加lml RNase酶母液(终浓度lmg/m1)，37℃1-2h；
10)加2倍体积的无水乙醇和1/10体积的NaAc(3M，pH5.2)，混匀5min，4℃，9000rpm，15min，去上清；
11)70％乙醇洗涤1min，9000rpm 1mim；
12)500ul TE溶解，-20℃保存。
5.稳定细胞系构建
PS：腺病毒包装中的难点主要在于怎么将外源基因表达框构建至腺病毒骨架载体上。由于腺病毒骨架载体比较大(～30kb)，而且载体中的一些常用酶切位点几乎都有多个，如果用常规的酶切-连接的方式将外源基因构建至腺病毒骨架载体上，成功率很低，因此，目前的腺病毒表达系统基本上都是用穿梭载体利用同源重组的方法将外源基因构建至腺病毒骨架载体上。现在使用的慢病毒载体大多是四质粒系统，四质粒共转染293细胞，即是Gag/Pol、Rev、VSV-G(代替HIV-1的Env)分别独立放置在3个质粒上即骨架质粒(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)，另外的一个就是可以放目的基因的质粒即穿梭质粒。VSV-G来源于水泡口炎病毒具有广泛的嗜性，能够感染大多数细胞。四质粒系统将Gag/Pol、Rev分别放在不同的载体上，增强了病毒载体的安全性。
慢病毒颗粒获取
1)75cm2的细胞培养瓶培养293T细胞，选取融合度60-70％293T细胞，换液后三小时后备用；
2)用脂质体Lipofectamine2000将穿梭质粒pMP71-αβTCR和骨架质粒(腺病毒转染需要穿梭质粒与骨架质粒)共转染293T细胞，质粒与脂质体2000的比率为1μg:1.5μl；
表8
(四质粒之间比例可以根据实际情况进行调节，以达到最大感染效率。)
3)待细胞长满培养板时，将其消化转移至10cm细胞培养皿中继续培养；
4)细胞转染后约10-14d时，可观察到病毒病变斑出现，继续培养1-2天使病变斑扩大；
5)1000g离心5min收集细胞，将细胞于-80℃和37℃反复冻融3次后1000g离心10min，上清液即为初次收获的病毒液。
慢病毒的浓縮
1)取收集的293T细胞上清液约35ml收集于50ml离心管中，2000rpm离心10min，去除293T细胞碎片；
2)将获得的上清液置于冰上，用60ml注射器连接0.45μm针头滤器将离心后的上清液过滤于35ml超速离心管中，25,000rpm离心3小时；
3)将离心管轻轻取出，置于冰上；
4)在病毒专用超净台中，打开金属离心管，吸去部分离心后的病毒上清，用镊子取出超速离心管，吸去大部分上清，剩余约4ml；
5)用5ml移液管反复吹打剩余的4ml病毒上清约10次，0.75ml/管进行分装，放入-80℃冰箱中保存备用。
慢病毒转染γδT细胞
1)取2x105-5x105激活的γδT细胞，在室温下将冻存的慢病毒颗粒融化，轻轻混匀，将0.75ml慢病毒颗粒加入T细胞中；
2)向24孔板中加入凝聚胺，用RPMI1640培养基调整至终浓度8μg/ml，将24孔板放入离心机离心，2500rpm，1.5小时。离心后将24孔板放于37℃、5％CO2培养箱中培养过夜；
3)离心过夜培养的24孔板，去掉大部分含慢病毒颗粒的上清培养液，加入新鲜的RPMI-1640培养液，扩增T细胞；
4)每2天计数T细胞，向RPMI-1640培养基中加入IL-2 400IU/ml，维持细胞密度为0.5-1x106/ml；
5)2周后，使用抗人CD3，CD45，CD4，CD8，CD45RO，CD62L抗体以及FITC标记的羊抗鼠F(ab')2抗体，进行流式细胞仪分析；
6)转染成功HER2αβTCR-γδT细胞。
HER2-αβTCR-γδT细胞体外功能检测(此步骤验证HER2-1的抗肿瘤免疫应答以及多肽识别特异性)
A：效应细胞与靶细胞共培养验证HER2特异性(黑色素瘤细胞系SK-Mel 29表达HER2/neu以及SAOS-2-LUC细胞作为靶细胞)
1)用0.25％胰酶消化相应细胞后，加入RPMI-1640培养基中和胰酶，离心后调整细胞密度为1x106/ml，取100ul(1x105)肿瘤细胞接种于U型96孔板中，设置3个复孔；
2)HER2特异性T细胞在无IL-2的RPMI-1640培养液中培养过夜，使T淋巴细胞静息；
3)收取静息的T淋巴细胞，离心去掉上清，将细胞重悬于RPMI-1640培养液中，计数，调整细胞密度为1x106/ml，取100ul(1x105)T细胞接种于U型96孔板中已经接种相应肿瘤细胞的孔中，将96孔板放置于37℃、5％CO2培养箱中培养过夜。只有T细胞的孔作为阴性对照孔。
B：IFN-γELISA检測HER2特异性
1)包被：按说明书指导，将Capture抗体稀释于1X包被缓冲液中，向试剂盒提供的微孔板中的各反应孔中各加0.1ml，塑料贴纸覆M微孔板，放置4℃过夜。
2)封闭：将过夜后的微孔板用自动ELISA洗板机洗漆4次后，抛干，用IX分析缓冲液100UI封闭1小时。
3)加样：将微孔板再次洗漆4次后，抛干，向各反应孔加入待检测的T细胞与肿瘤细胞共培养的上清液100ul，相应稀释倍数的上清液及IFN-γ标准品(1000pg/ml，倍比稀释至15.6pg/ml)，室温鮮育2小时。
4)加检测抗体：微孔板洗涤4次后，抛干，按说明书指定将Detection抗体用1X分析缓冲液稀释，取100UI加入各反应孔中，室温孵育1小时。
5)加辣根过氧化物酶标记的二抗：微孔板洗漆4次后，抛干，将HRP标记的抗体用1X分析缓冲液稀释，向各反应孔中各加100UI，室温孵育0.5小时。
6)微孔板洗漆4次后，抛干，向各反应孔中加入新鲜配制的TMB底物溶液100ul，避光孵育15分钟。
7)向各反应孔中加入1M硫酸100ul终止反应。
8)结果判定：在EUSA检测仪上，以空白对照孔调零，检测各孔450nm吸光值(0D值)，计算IFN-γ浓度值。结果见图4。
6.HER2αβTCR-γδT和骨肉瘤细胞的融合、纯化。
SAOS-2-LUC人骨肉瘤细胞培养
SAOS-2-LUC细胞复苏后在用含体积分数为10％的胎牛血清的RPMI1640培养基中100U/mL青霉素和100g/mL链霉素的RPMI1640培养液，制成单细胞悬液，于37℃、5％CO2培养箱培养常规培养，每3d换液1次。0.25％的胰蛋白酶消化传代。换液后，在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。
融合细胞制备
将上述转染的HER2-αβTCR-γδT细胞与经80Gy射线照射后的SAOS-2-LUC细胞在融合介质中洗涤、重悬，细胞浓度在5×106-15×106/ml，利用电融合仪进行融合。得到骨肉瘤融合细胞。具体操作步骤如下：
1)融合条件：融合电极3.2mm；AC 50V，5Sec；DC 250V，30μSec；2pulses(ECM 2001型细胞融合仪：美国BTX公司)；
2)HER2-αβTCR-γδT细胞:SAOS-2-LUC＝5:1，用0.3M葡萄糖溶液洗一次，将总数为5×106个的细胞悬浮在0.5ml葡萄糖溶液中；
3)把细胞加到电极槽中，按上述条件设定融合仪参数，触发融合按钮放电融合；
4)用吸管转移细胞到培养瓶中加含10％FBS的RPMI-1640完全培养液。
MACS纯化融合细胞
利用MACS系统(MiniMACS磁性分离仪；德国Miltenyi Biotec GmbH公司)纯化骨肉瘤融合细胞操作步骤如下:
1)融合后细胞在培养24h后用胰蛋白酶消化，收集107个细胞悬浮在80μl PBS中；
2)加20μl 1:10稀释的OX62 mAb，工作浓度1:50，混匀后在4℃放置10min；
3)加1ml PBS，300g离心10min，共洗2次；
4)细胞重悬在80μl PBS中，加20μl已标记的磁微球，在4℃放置15min；
5)用1ml的PBS洗细胞1次，300g离心10min收集细胞，重悬在500μl PBS中；
6)细胞加到预先用500μl PBS洗过的分离柱中；
7)收集流出液，再用500μl PBS洗3次柱子，流出液收集到一起；
8)把分离柱从架子上取下来，然后加500μl PBS，用针芯快速推出缓冲液，把细胞洗脱下来；
9)将分离纯化后的细胞置瓶中继续培养。
g.靶细胞的增值活性检测
1)将冻存的SAOS-2-LUC细胞进行复苏，离心后，用含10％FBS的1640完全培养基进行培养；
2)待SAOS-2-LUC细胞长满后进行传代分盘，接于96孔板中进行CCK-8实验；
3)取处于对数生长期的SAOS-2-LUC细胞，用0.25％胰酶消化后，接种5×105/mL细胞于96孔板中，每孔加入200μL的培养液，于37℃，5％CO2培养箱中培养；
4)进行实验分组：①SAOS-2-LUC control组、②γδT+SAOS-2-LUC细胞组、③HER2αβTCR-γδT+SAOS-2-LUC细胞组、④骨肉瘤融合细胞+SAOS-2-LUC细胞组，每个组别设置3个重复孔，37℃、5％CO2培养；
5)分别于24h、48h加入CCK-8试剂，每孔20μL，继续于培养箱37℃，5％CO2培养3h后，450nm波长进行检测。结果见图5。
H.靶细胞的毒性反应检测
1)取处于对数生长期的SAOS-2-LUC细胞，用0.25％胰酶消化后，接种5×105/mL细胞于96孔板中，每孔加入200μL的培养液，于37℃，5％CO2
培养箱中培养；
2)进行实验分组：①SAOS-2-LUC control组、②γδT+SAOS-2-LUC细胞组、③HER2αβTCR-γδT+SAOS-2-LUC细胞组、④骨肉瘤融合细胞+SAOS-2-LUC细胞组，每个组别设置3个重复孔，37℃、5％CO2培养；
3)24h后取上清，根据LDH ELISA检测试剂盒的说明书步骤操作；结果见图6。
i靶细胞凋亡检测
共培养48h后，利用Annexin V和PI双染靶细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡
1)从正常人血液中分离PBMC细胞，进行诱导分离，收获γδT细胞；
2)进行实验分组：①SAOS-2-LUC control组、②γδT+SAOS-2-LUC细胞组、③HER2αβTCR+SAOS-2-LUC细胞组、④骨肉瘤融合细胞+SAOS-2-LUC细
胞组，37℃、5％CO2培养48h；
3)PBS洗涤细胞两次，收集细胞1～5×105细胞；
4)加入500μL的AnnexinV Binding Buffer悬浮细胞；
5)加入5μL AnnexinV-FITC混匀后，加入5μLPropidium Iodide(周期检测只加5μLPropidium Iodide)，混匀；
7)用流式细胞仪检测(Ex＝488nm；Em＝530nm)凋亡情况。结果见图7。

Claims (4)

1.一种肿瘤融合细胞疫苗的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
(1)取外周血单核细胞，加入唑来膦酸1μM和人重组IL-2400IU/mL并分离出γδT细胞；将HER2369与β2-微球蛋白加入到细胞中，37℃，放置2h；每20min轻轻点到混匀使其充分结合，用与HER2369结合的T2细胞刺激与外周血HLA-A2-T细胞，刺激7-14天后，对细胞进行稀释得到HER2特异性T细胞；
(2)提取HER2特异性T细胞RNA，用提取的RNA产物进行下一步逆转录反应，将反转录的cDNA置于-80度冰箱保存，备用，以反转录得到的cDNA为模板PCR合成TCRα-以及TCRβ目的片段，合成的目的片段带有Not I、EcoR I酶切位点，提取的RNA产物行PCR反应，凝胶电泳检测PCR产物，参照说明书用凝胶回收试剂盒回收PCR产物，或者用PCR纯化试剂盒对PCR产物进行纯化，纯化后的目的片段与载体进行酶切反应，Not I和EcoR I双酶切目的片段以及载体pMP71，比例5：1，之后进行连接，16℃连接16h，65℃加热10min使酶灭活，连接产物转化至TOP10感受态细胞，以碱裂法提取得到pMP71/TCRαβ质粒；
(3)用脂质体Lipofectamine2000将穿梭质粒pMP71-αβTCR和骨架质粒共转染293T细胞，质粒与脂质体2000的比率为1μg:1.5μl，取2x105-5x105激活的γδT细胞，在室温下将冻存的慢病毒颗粒融化，轻轻混匀，将0.75ml慢病毒颗粒加入T细胞中，2周后，使用抗人CD3，CD45，CD4，CD8，CD45RO，CD62L抗体以及FITC标记的羊抗鼠F(ab')2抗体，进行流式细胞仪分析，转染成功HER2αβTCR-γδT细胞；
(4)采用电融合技术融合γδT细胞及肿瘤细胞制成疫苗，将上述转染的HER2-αβTCR-γδT细胞与经80Gy射线照射后的SAOS-2-LUC细胞在融合介质中洗涤、重悬，细胞浓度在5×106-15×106/ml，利用电融合仪进行融合得到融合细胞。
2.根据权利要求1所述的一种肿瘤融合细胞疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(2)逆转录反应条件：室温10min，42℃1h，99℃5min灭活AMV Reverse Transcriptase。
3.根据权利要求1所述的一种肿瘤融合细胞疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(2)PCR反应程序如下：预热95℃，2min；95℃变性30s，65℃退火30s，70℃延伸2min，(35个循环)70℃10min，4℃停止。
4.根据权利要求1所述的制备方法在制备肿瘤融合细胞疫苗中的应用。
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