CN106074549A - 一种靶向炭疽杆菌水肿因子的中药小分子组合在肿瘤防治中的应用 - Google Patents

一种靶向炭疽杆菌水肿因子的中药小分子组合在肿瘤防治中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种靶向炭疽杆菌水肿因子的中药小分子组合在肿瘤防治中的应用，以炭疽杆菌水肿因子为靶，筛选了靶向炭疽杆菌水肿因子的中药小分子，并将其组合成复合物开展了肿瘤预防及肿瘤治疗研究，经筛选，我们发现大黄素、厚朴酚、乌头碱有较好的抑制炭疽杆菌水肿因子作用，进一步证明大黄素：厚朴酚：乌头碱=5：3：2组合有最佳的抑制炭疽杆菌水肿因子作用，有很好的肿瘤预防和治疗效果。

Description

一种靶向炭疽杆菌水肿因子的中药小分子组合在肿瘤防治中 的应用
技术领域
本发明属于肿瘤防治技术领域，尤其是涉及一种靶向炭疽杆菌水肿因子的中药小分子组合在肿瘤防治中的应用。
背景技术
肿瘤发生的病因不完全清楚，进一步探索肿瘤发生的原因和发现新的治疗药物仍是肿瘤研究的重要任务。以前人们认为肿瘤营养的供给依赖于新生血管形成，然而，抗新生血管形成饿死肿瘤的治疗方法在临床上遇到了加速肿瘤恶性进展的困境。我们在研究中发现，肿瘤细胞间液能比肿瘤新生血管更好的供给肿瘤营养，降低肿瘤细胞间液能很好的改善肿瘤患者生存质量。相反，肿瘤胸腹水可以严重影响患者生存质量、加速患者死亡。炭疽杆菌水肿因子引起的组织细胞水肿坏死是炭疽杆菌感染致死的主要原因，肿瘤在中医上被看作阴疽，与炭疽病有很多相似之处，我们在研究中发现肿瘤细胞也能产生炭疽杆菌水肿因子，从而引起类似炭疽杆菌感染的组织细胞水肿坏死，并且是胸腹水形成的主要原因。因此，靶向炭疽杆菌水肿因子有可能组织肿瘤发展和治疗癌症相关的胸腹水。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种靶向炭疽杆菌水肿因子的中药小分子组合在肿瘤防治中的应用，具有肿瘤预防效果好的优点。
为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：一种靶向炭疽杆菌水肿因子的中药小分子组合在肿瘤防治中的应用，依次包括以下步骤：
a）对数生长期的人肝癌HepG-2细胞5×103个/孔接种于96孔板，培养24h后，应用Lipofectamine2000将构建的炭疽杆菌水肿因子启动子偶联的绿色荧光蛋白表达质粒对HepG-2细胞进行转染，建立筛选炭疽杆菌水肿因子抑制剂的细胞模型；细胞继续培养 12h后加入5～20µmol/L的筛选复合药物作用 24h；吸弃培养上清，加入磷酸缓冲盐溶液后用多功能微板读数仪检测各孔荧光强度，根据各加入筛选复合药物的孔相对于未加筛选复合药物的孔的荧光相对值作为评价筛选复合药物抑制炭疽杆菌水肿因子的强弱，荧光相对值为0.8～1.0时，抑制能力为弱；荧光相对值0.5～0.8时，抑制能力为中等； 荧光相对值<0.5时，抑制能力为强；选择荧光相对值<0.5时的筛选复合药物进行肿瘤防治试验；
b）将雄性昆明小鼠的皮肤组织在培养皿中进行体外培养，各皮肤组织的尺寸大小相等，并将皮肤组织分为模型组、组合物高剂量组、组合物中剂量组、组合物低剂量组，每组20个，模型组中不添加筛选复合药物，组合物高剂量组中保持培养皿中培养基中筛选复合药物为100～300mg/kg，组合物中剂量组中保持培养皿中培养基中筛选复合药物为50～150mg/kg，组合物低剂量组中保持培养皿中培养液中筛选复合药物为10～30mg/kg，模型组添加等剂量的生理盐水，用紫外线(UVB 275～390nm) 30 mJ/cm2 照射皮肤组织2次/周，连续44周；每天1次, 连续44周，计数各组出现皮肤肿瘤的组数和每组皮肤出现的肿瘤数。
作为优选，所述的筛选复合药物包括大黄素，厚朴酚，乌头碱，且大黄素：厚朴酚：乌头碱按照5：3：2的比例组成，所述的筛选复合药物能够使荧光相对值<0.5，抑制能力表现为强。
作为优选，组合物高剂量组中保持培养皿中培养基中筛选复合药物为200mg/kg，组合物中剂量组中保持培养皿中培养基中筛选复合药物为80mg/kg，组合物低剂量组中保持培养皿中培养液中筛选复合药物为20mg/kg。
与现有的技术相比，本发明的优点在于：以炭疽杆菌水肿因子为靶，筛选了靶向炭疽杆菌水肿因子的中药小分子，并将其组合成复合物开展了肿瘤预防及肿瘤治疗研究，经筛选，我们发现大黄素、厚朴酚、乌头碱有较好的抑制炭疽杆菌水肿因子作用，进一步证明大黄素：厚朴酚：乌头碱=5：3：2组合有最佳的抑制炭疽杆菌水肿因子作用，有很好的肿瘤预防和治疗效果。
具体实施方式
本方案具体为一种靶向炭疽杆菌水肿因子的中药小分子组合在肿瘤防治中的应用，依次包括以下步骤：
a）对数生长期的人肝癌HepG-2细胞5×103个/孔接种于96孔板，培养24h后，应用Lipofectamine2000将构建的炭疽杆菌水肿因子启动子偶联的绿色荧光蛋白表达质粒对HepG-2细胞进行转染，建立筛选炭疽杆菌水肿因子抑制剂的细胞模型；细胞继续培养 12h后加入10µmol/L的筛选复合药物作用 24h；吸弃培养上清，加入磷酸缓冲盐溶液后用多功能微板读数仪检测各孔荧光强度，根据各加入筛选复合药物的孔相对于未加筛选复合药物的孔的荧光相对值作为评价筛选复合药物抑制炭疽杆菌水肿因子的强弱，荧光相对值为0.8～1.0时，抑制能力为弱；荧光相对值0.5～0.8时，抑制能力为中等； 荧光相对值<0.5时，抑制能力为强；选择荧光相对值<0.5时的筛选复合药物进行肿瘤防治试验；
b）将雄性昆明小鼠的皮肤组织在培养皿中进行体外培养，各皮肤组织的尺寸大小相等，并将皮肤组织分为模型组、组合物高剂量组、组合物中剂量组、组合物低剂量组，每组20个，模型组中不添加筛选复合药物，组合物高剂量组中保持培养皿中培养基中筛选复合药物为200mg/kg，组合物中剂量组中保持培养皿中培养基中筛选复合药物为80mg/kg，组合物低剂量组中保持培养皿中培养液中筛选复合药物为20mg/kg，模型组添加等剂量的生理盐水，用紫外线(UVB 275～390nm) 30 mJ/cm2 照射皮肤组织2次/周，连续44周；每天1次, 连续44周，计数各组出现皮肤肿瘤的组数和每组皮肤出现的肿瘤数。
具体地说，所述的筛选复合药物包括大黄素，厚朴酚，乌头碱，且大黄素：厚朴酚：乌头碱按照5：3：2的比例组成，所述的筛选复合药物能够使荧光相对值<0.5，抑制能力表现为强。
筛选复合药物中，10µmol/L大黄素及乌头碱使荧光相对值0.5～0.8为中等；10µmol/L厚朴酚使荧光相对值0.8～1.0为弱。将3种小分子按不同比例混合后以10µmol/L处理筛选细胞，大黄素：厚朴酚：乌头碱=5：3：2组合使荧光相对值<0.5，抑制能力表现为强。
试验结果：模型组20个皮肤组织全部发生皮肤癌，小鼠皮肤出现的肿瘤数为8.2±2.3；组合物高剂量组出现皮肤肿瘤的组织数为13个，小鼠皮肤出现的肿瘤数为3.3±1.2（与模型组比较 p<0.001）；组合物中剂量组出现皮肤肿瘤的组织为17个，小鼠皮肤出现的肿瘤数为4.1±1.8（与模型组比较 p<0.01）；组合物低剂量组出现皮肤肿瘤的组织个数为19个，小鼠皮肤出现的肿瘤数为4.5±2.0（与模型组比较 p<0.05）。
以上结果表明，该筛选复合药物按对UVB引起小鼠皮肤癌有明显预防作用。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (3)

1.一种靶向炭疽杆菌水肿因子的中药小分子组合在肿瘤防治中的应用，依次包括以下步骤：
a）对数生长期的人肝癌HepG-2细胞5×103个/孔接种于96孔板，培养24h后，应用Lipofectamine2000将构建的炭疽杆菌水肿因子启动子偶联的绿色荧光蛋白表达质粒对HepG-2细胞进行转染，建立筛选炭疽杆菌水肿因子抑制剂的细胞模型；细胞继续培养 12h后加入5～20µmol/L的筛选复合药物作用 24h；吸弃培养上清，加入磷酸缓冲盐溶液后用多功能微板读数仪检测各孔荧光强度，根据各加入筛选复合药物的孔相对于未加筛选复合药物的孔的荧光相对值作为评价筛选复合药物抑制炭疽杆菌水肿因子的强弱，荧光相对值为0.8～1.0时，抑制能力为弱；荧光相对值0.5～0.8时，抑制能力为中等； 荧光相对值<0.5时，抑制能力为强；选择荧光相对值<0.5时的筛选复合药物进行肿瘤防治试验；
b）将雄性昆明小鼠的皮肤组织在培养皿中进行体外培养，各皮肤组织的尺寸大小相等，并将皮肤组织分为模型组、组合物高剂量组、组合物中剂量组、组合物低剂量组，每组20个，模型组中不添加筛选复合药物，组合物高剂量组中保持培养皿中培养基中筛选复合药物为100～300mg/kg，组合物中剂量组中保持培养皿中培养基中筛选复合药物为50～150mg/kg，组合物低剂量组中保持培养皿中培养液中筛选复合药物为10～30mg/kg，模型组添加等剂量的生理盐水，用紫外线(UVB 275～390nm) 30 mJ/cm2 照射皮肤组织2次/周，连续44周；每天1次, 连续44周，计数各组出现皮肤肿瘤的组数和每组皮肤出现的肿瘤数。
2.根据权利要求1所述的一种靶向炭疽杆菌水肿因子的中药小分子组合在肿瘤防治中的应用，其特征在于：所述的筛选复合药物包括大黄素，厚朴酚，乌头碱，且大黄素：厚朴酚：乌头碱按照5：3：2的比例组成，所述的筛选复合药物能够使荧光相对值<0.5，抑制能力表现为强。
3.根据权利要求1所述的一种靶向炭疽杆菌水肿因子的中药小分子组合在肿瘤防治中的应用，其特征在于：组合物高剂量组中保持培养皿中培养基中筛选复合药物为200mg/kg，组合物中剂量组中保持培养皿中培养基中筛选复合药物为80mg/kg，组合物低剂量组中保持培养皿中培养液中筛选复合药物为20mg/kg。
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