CN106069747A - 一种获得大豆耐盐突变体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种获得大豆耐盐突变体的方法，包括从大豆幼胚子叶诱导和继代大豆胚性愈伤组织；对愈伤组织进行EMS诱变；对诱变后的愈伤组织进行盐胁迫筛选；对盐胁迫筛选后的愈伤组织进行继代培养；对继代培养后的愈伤组织进行诱导分化获得体细胞胚，体细胞胚萌发生长后获得大豆耐盐突变体。本发明的方法整体操作简单，效率高、效果好，能大量获取具有较强耐盐性的大豆耐盐突变体，有利于改良与创制大豆种质资源。

Description

一种获得大豆耐盐突变体的方法
技术领域
本发明涉及植物细胞工程技术领域，尤其涉及一种甲基磺酸乙酯(EMS)诱变大豆胚性愈伤组织细胞获得大豆耐盐突变体的方法。
背景技术
我国耕地面积有限，其中盐碱耕地约有912万公顷，在盐胁迫下农作物的产量显著下降，严重影响农业生产和粮食安全，培育耐盐性植物是未来农业研究的重要方向。栽培大豆是中度耐盐的植物，进一步提高大豆的耐盐性对于大豆生产具有重要意义。筛选大豆耐盐种植资源对于培育耐盐大豆品种的研究具有重要意义，而获得耐盐突变体能够弥补耐盐野生大豆种类的不足，同时耐盐突变体的获得及研究有利于了解和探明大豆耐盐机理，为改善大豆耐盐性提供理论基础。
筛选和获得大豆突变体的方法有很多种，常见的是利用物理或者化学方法诱导遗传变异，物理诱变通过高能分子或者射线处理产生突变体，例如孙恺等通过60Co诱变筛选到高异黄酮大豆突变株SHIS-01，其异黄酮含量达到0.5％，是野生型ZN01含量的2倍。化学诱变通过化学诱变剂处理植物，例如NaN3(叠氮化钠)，EMS等，其中EMS能稳定且高效地诱发点突变。例如陈远东等通过EMS处理大豆“南农94-16”的种子，建立了大豆突变体材料，不仅获得大量的种质资源，同时促进大豆功能基因组研究的开展，然而使用大豆种子作为材料，需要对后期表型进行连续后代的追踪和鉴定才能获得稳定遗传的突变株，同时产生大量嵌合体存在，工作量大，操作耗时，育种周期长。
因此，本领域的技术人员致力于开发一种简便快速地获得能稳定遗传的耐盐突变体的诱导筛选方法。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何缩短育种周期，简便快速获得能稳定遗传的耐盐突变体。
为实现上述目的，本发明提供了一种获得大豆耐盐突变体的方法，包括：
1)从大豆幼胚子叶诱导和继代大豆胚性愈伤组织；
2)对愈伤组织进行EMS诱变；
3)对诱变后的愈伤组织进行盐胁迫筛选；
4)对盐胁迫筛选后的愈伤组织进行继代培养；
5)对继代培养后的愈伤组织进行诱导分化获得体细胞胚，体细胞胚萌发生长后获得大豆耐盐突变体。
进一步地，步骤1)之前，取开花后2-4周的大豆幼荚进行消毒，并用蒸馏水进行清洗，大豆幼胚取自该大豆幼荚。
优选地，该消毒为使用18％-22％的安替福民，在振荡下消毒15-25分钟。进一步优选地，使用20％的安替福民，在振荡下消毒20分钟。
进一步地，步骤1)中，大豆幼胚子叶切成小块接种在诱导培养基中，25℃±3℃暗培养3-4周生成愈伤组织，再将该愈伤组织转移到继代培养基中，25℃±3℃继代培养3-4周。其中，小块为0.5cm×0.5cm以下的小块，优选为0.3cm×0.3cm的小块。其中，生成的愈伤组织的直径约1-2mm，切下后转移到继代培养基中。
进一步地，步骤2)中，将愈伤组织接种在含有0.3％～0.4％EMS的诱变培养基中，25℃±3℃振荡培养3.5-4.5h进行EMS诱变。
进一步地，步骤3)中，将愈伤组织转移到含有4～8g/L NaCl的盐胁迫筛选培养基中，25℃±3℃培养1.5-2.5周进行筛选。
进一步地，步骤4)中，将愈伤组织接种到继代培养基中，25℃±3℃扩繁3-4周。
进一步地，步骤5)中，将愈伤组织接种到分化培养基中，25℃±3℃培养3～4周后得到体细胞胚，将该体细胞胚表面干燥2～5天后，接种在萌发培养基中。
优选地，步骤1)中，诱导采用诱导培养基，诱导培养基为含有30～40mg/L 2,4-D、7g/L琼脂粉和30g/L蔗糖的MS培养基，pH为6.8-7.2；
步骤1)和步骤4)中继代采用继代培养基，继代培养基为含有10～20mg/L 2,4-D、0.5～1g/L天冬氨酸、7g/L琼脂粉和30g/L蔗糖的MS培养基，pH为5.6-6；
步骤2)中，诱变采用诱变培养基，诱变培养基为含有10～20mg/L 2,4-D、0.5～1g/l天冬氨酸、0.3％～0.4％EMS和30g/l蔗糖的MS培养基，pH为5.6-6；
步骤3)中，盐胁迫筛选采用盐胁迫培养基，盐胁迫培养基为含有10～20mg/l 2,4-D、0.5～1g/l天冬氨酸、7g/l琼脂粉、30g/l蔗糖和4～8g/l NaCl的MS培养基，pH为＝5.6-6；
步骤5)中，诱导分化采用分化培养基，分化培养基为含有5～6％麦芽糖和0.5～1％活性炭的MS培养基，pH为5.6-6；萌发采用萌发培养基，萌发培养基为含有3％蔗糖的MS培养基，pH为5.6-6。
进一步地，使用的大豆品系为东农47、东农S16或东农P746。
本发明在常规的通过EMS诱导大豆种子发生突变从而获得耐盐突变体的方法基础上，研究发现，在大豆幼胚子叶产生的胚性愈伤组织的基础上，使用EMS进行诱导突变，能够达到更好的诱导突变效果，结合胚性愈伤组织的良好生长发育潜能，再EMS诱导突变及盐胁迫后，能获得更多的再生植株。并且，通过对愈伤组织的诱变及盐胁迫，能在细胞水平获得耐盐性更强的基因型，从而在在植株水平获得具有较强耐盐性的植株。另外，本发明的方法各阶段的培养基中生长激素、氨基酸的量的组合，为获得更好更多的突变体植株产生的积极的作用。该方法整体操作简单，并且由于前述原因，其效率高、效果好，能大量获取大豆耐盐突变体，有利于改良与创制大豆种质资源。
以下将结合具体实施例对本发明的构思、具体步骤及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
具体实施方式
实施例1
1)采摘开花后2周东农47大豆幼荚，浸没在20％安替福民150r/min振荡20分钟，无菌水浸泡并冲洗干净，取出大豆幼胚子叶切成小块，接种在诱导培养基(MS培养基+35mg/l2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)+7g/l琼脂粉+30g/l蔗糖，pH＝7)，25℃±3℃暗培养。较优地切成0.3cm×0.3cm的小块，这样有利于后期形成愈伤组织。3～4周后切下直径约1-2mm愈伤组织并转移到继代培养基(MS培养基+20mg/l 2,4-D+1g/l天冬氨酸+7g/l琼脂粉+30g/l蔗糖，pH＝5.8)中，25℃±3℃培养3～4周。
2)将胚性愈伤组织接种在诱变培养基(MS培养基+20mg/l 2,4-D+1g/l天冬氨酸+0.4％EMS+30g/l蔗糖，pH＝5.8)中25℃±3℃振荡培养4h后，无菌水冲洗干净。转移到盐胁迫筛选培养基(MS培养基+20mg/l 2,4-D+1g/l天冬氨酸+7g/l琼脂粉+30g/l蔗糖+6g/lNaCl，pH＝5.8)中，25℃±3℃培养2周后，接种在继代培养基(MS培养基+20mg/l 2,4-D+1g/l天冬氨酸+7g/l琼脂粉+30g/l蔗糖，pH＝5.8)中，25℃±3℃培养3～4周。
3)将大豆胚性愈伤组织接种在分化培养基(MS培养基+6％麦芽糖+0.8％活性炭，pH＝5.8)中25℃±3℃培养3～4周后得到体细胞胚，表面干燥2～5天后，接种在萌发培养基(MS培养基+3％蔗糖，pH＝5.8)中待幼苗生根长大后移栽到温室中(25℃±3℃)。
此方法筛选到的耐盐突变体，能够在300mM NaCl盐胁迫下生长良好。
实施例2
1)采摘开花后3周S16大豆幼荚，浸没在20％安替福民150r/min振荡20分钟，无菌水浸泡并冲洗干净，取出大豆幼胚子叶切成0.3cm×0.3cm的小块，接种在诱导培养基(MS培养基+40mg/l 2,4-D+7g/l琼脂粉+30g/l蔗糖，pH＝7)，25℃±3℃暗培养。3～4周后切下直径约1-2mm愈伤组织并转移到继代培养基(MS培养基+15mg/l 2,4-D+0.6g/l天冬氨酸+7g/l琼脂粉+30g/l蔗糖，pH＝5.8)中，25℃±3℃培养3～4周。
2)将胚性愈伤组织接种在诱变培养基(MS培养基+20mg/l 2,4-D+1g/l天冬氨酸+0.4％EMS+30g/l蔗糖，pH＝5.8)中，25℃±3℃振荡培养4h后，无菌水冲洗干净。转移到盐胁迫筛选培养基(MS培养基+15mg/l 2,4-D+0.6g/l天冬氨酸+7g/l琼脂粉+30g/l蔗糖+7g/lNaCl，pH＝5.8)中，25℃±3℃培养2周后，接种在继代培养基(MS培养基+15mg/l 2,4-D+0.6g/l天冬氨酸+7g/l琼脂粉+30g/l蔗糖，pH＝5.8)中25℃±3℃培养3～4周。
3)将大豆胚性愈伤组织接种在分化培养基(MS培养基+5％麦芽糖+1％活性炭，pH＝5.8)中25℃±3℃培养3～4周后得到体细胞胚，表面干燥2～5天后，接种在萌发培养基(MS培养基+3％蔗糖，pH＝5.8)中待幼苗生根长大后移栽到温室中(25℃±3℃)。
此方法筛选到的耐盐突变体，能够在300mM NaCl盐胁迫下生长良好。
实施例3
1)采摘开花后2周P746大豆幼荚，浸没在20％安替福民150r/min振荡20分钟，无菌水浸泡并冲洗干净，取出大豆幼胚子叶切成0.3cm×0.3cm的小块，接种在诱导培养基(MS培养基+40mg/l 2,4-D+7g/l琼脂粉+30g/l蔗糖，pH＝7)，25℃±3℃暗培养。3～4周后切下直径约1-2mm愈伤组织并转移到继代培养基(MS培养基+20mg/l 2,4-D+0.8g/l天冬氨酸+7g/l琼脂粉+30g/l蔗糖，pH＝5.8)中，25℃±3℃培养3～4周。
2)将胚性愈伤组织接种在诱变培养基(MS培养基+20mg/l 2,4-D+1g/l天冬氨酸+0.3％EMS+30g/l蔗糖，pH＝5.8)中，25℃±3℃振荡培养4h后，无菌水冲洗干净。转移到盐胁迫筛选培养基(MS培养基+20mg/l 2,4-D+0.8g/l天冬氨酸+7g/l琼脂粉+30g/l蔗糖+8g/lNaCl，pH＝5.8)中，25℃±3℃培养2周后，接种在继代培养基(MS培养基+20mg/l 2,4-D+0.8g/l天冬氨酸+7g/l琼脂粉+30g/l蔗糖，pH＝5.8)中25℃±3℃培养3～4周。
3)将大豆胚性愈伤组织接种在分化培养基(MS培养基+6％麦芽糖+0.8％活性炭，pH＝5.8)中25℃±3℃培养3～4周后得到体细胞胚，表面干燥2～5天后，接种在萌发培养基(MS培养基+3％蔗糖，pH＝5.8)中待幼苗生根长大后移栽到温室中(25℃±3℃)。
此方法筛选到的耐盐突变体，能够在300mM NaCl盐胁迫下生长良好。
实施例4
1)采摘开花后4周P746大豆幼荚，浸没在18％安替福民150r/min振荡15分钟，无菌水浸泡并冲洗干净，取出大豆幼胚子叶切成约0.5cm×0.5cm的小块，接种在诱导培养基(MS培养基+30mg/l 2,4-D+7g/l琼脂粉+30g/l蔗糖，pH＝7.2)，25℃±3℃暗培养。3～4周后切下直径约1-2mm愈伤组织并转移到继代培养基(MS培养基+10mg/l 2,4-D+0.8g/l天冬氨酸+7g/l琼脂粉+30g/l蔗糖，pH＝6)中，25℃±3℃培养3～4周。
2)将胚性愈伤组织接种在诱变培养基(MS培养基+10mg/l 2,4-D+0.5g/l天冬氨酸+0.3％EMS+30g/l蔗糖，pH＝5.6)中，25℃±3℃振荡培养4.5h后，无菌水冲洗干净。转移到盐胁迫筛选培养基(MS培养基+10mg/l 2,4-D+0.5g/l天冬氨酸+7g/l琼脂粉+30g/l蔗糖+4g/l NaCl，pH＝6)中，25℃±3℃培养2.5周后，接种在继代培养基(MS培养基+10mg/l 2,4-D+0.5g/l天冬氨酸+7g/l琼脂粉+30g/l蔗糖，pH＝6)中25℃±3℃培养3～4周。
3)将大豆胚性愈伤组织接种在分化培养基(MS培养基+5.5％麦芽糖+1％活性炭，pH＝5.6)中25℃±3℃培养3～4周后得到体细胞胚，表面干燥2～5天后，接种在萌发培养基(MS培养基+3％蔗糖，pH＝5.8)中待幼苗生根长大后移栽到温室中(25℃±3℃)。
此方法筛选到的耐盐突变体，能够在300mM NaCl盐胁迫下生长良好。
实施例5
1)采摘开花后4周P746大豆幼荚，浸没在22％安替福民150r/min振荡25分钟，无菌水浸泡并冲洗干净，取出大豆幼胚子叶切成约0.4cm×0.4cm的小块，接种在诱导培养基(MS培养基+30mg/l 2,4-D+7g/l琼脂粉+30g/l蔗糖，pH＝6.8)，25℃±3℃暗培养。3～4周后切下直径约1-2mm愈伤组织并转移到继代培养基(MS培养基+10mg/l 2,4-D+0.8g/l天冬氨酸+7g/l琼脂粉+30g/l蔗糖，pH＝5.6)中，25℃±3℃培养3～4周。
2)将胚性愈伤组织接种在诱变培养基(MS培养基+15mg/l 2,4-D+0.75g/l天冬氨酸+0.35％EMS+30g/l蔗糖，pH＝6)中，25℃±3℃振荡培养3.5h后，无菌水冲洗干净。转移到盐胁迫筛选培养基(MS培养基+20mg/l 2,4-D+1g/l天冬氨酸+7g/l琼脂粉+30g/l蔗糖+5g/lNaCl，pH＝6)中，25℃±3℃培养1.5周后，接种在继代培养基(MS培养基+20mg/l 2,4-D+1g/l天冬氨酸+7g/l琼脂粉+30g/l蔗糖，pH＝5.6)中25℃±3℃培养3～4周。
3)将大豆胚性愈伤组织接种在分化培养基(MS培养基+5％麦芽糖+0.5％活性炭，pH＝6)中25℃±3℃培养3～4周后得到体细胞胚，表面干燥2～5天后，接种在萌发培养基(MS培养基+3％蔗糖，pH＝5.8)中待幼苗生根长大后移栽到温室中(25℃±3℃)。
此方法筛选到的耐盐突变体，能够在300mM NaCl盐胁迫下生长良好。
对比例
没有经过诱导筛选的野生型东农47、东农S16、东农P746大豆，分别采用如实施例1、2或3中相应的条件进行培养及处理，其中，诱变培养基中不加EMS。转移到盐胁迫筛选培养基(3g/l NaCl)，愈伤组织不能正常生长；如果直接接种在分化培养基上获得植株，用150mM NaCl处理，植株不能正常生长发育。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种获得大豆耐盐突变体的方法，其特征在于，所述方法包括：
1)从大豆幼胚子叶诱导和继代大豆胚性愈伤组织；
2)对所述愈伤组织进行EMS诱变；
3)对诱变后的所述愈伤组织进行盐胁迫筛选；
4)对盐胁迫筛选后的所述愈伤组织进行继代培养；
5)对继代培养后的所述愈伤组织进行诱导分化获得体细胞胚，所述体细胞胚萌发生长后获得所述大豆耐盐突变体。
2.如权利要求1所述的获得大豆耐盐突变体的方法，其特征在于，在步骤1)之前，取开花后2-4周的大豆幼荚进行消毒，并用蒸馏水进行清洗，所述大豆幼胚取自所述大豆幼荚。
3.如权利要求2所述的获得大豆耐盐突变体的方法，其特征在于，所述消毒为使用18％-22％的安替福民，在振荡下消毒15-25分钟。
4.如权利要求1所述的获得大豆耐盐突变体的方法，其特征在于，步骤1)中，所述大豆幼胚子叶切成小块接种在诱导培养基中，25℃±3℃暗培养3-4周生成愈伤组织，再将所述愈伤组织转移到继代培养基中，25℃±3℃继代培养3-4周。
5.如权利要求1所述的获得大豆耐盐突变体的方法，其特征在于，步骤2)中，将所述愈伤组织接种在含有0.3％～0.4％EMS的诱变培养基中，25℃±3℃振荡培养3.5-4.5h进行EMS诱变。
6.如权利要求1所述的获得大豆耐盐突变体的方法，其特征在于，步骤3)中，将所述愈伤组织转移到含有4～8g/L NaCl的盐胁迫筛选培养基中，25℃±3℃培养1.5-2.5周进行筛选。
7.如权利要求1所述的获得大豆耐盐突变体的方法，其特征在于，步骤4)中，将所述愈伤组织接种到继代培养基中，25℃±3℃扩繁3-4周。
8.如权利要求1所述的获得大豆耐盐突变体的方法，其特征在于，步骤5)中，将所述愈伤组织接种到分化培养基中，25℃±3℃培养3～4周后得到体细胞胚，将所述体细胞胚表面干燥2～5天后，接种在萌发培养基中。
9.如权利要求1所述的获得大豆耐盐突变体的方法，其特征在于：
步骤1)中，所述诱导采用诱导培养基，所述诱导培养基为含有30～40mg/L2,4-D、7g/L琼脂粉和30g/L蔗糖的MS培养基，pH为6.8-7.2；
步骤1)和步骤4)中所述继代采用继代培养基，所述继代培养基为含有10～20mg/L 2,4-D、0.5～1g/L天冬氨酸、7g/L琼脂粉和30g/L蔗糖的MS培养基，pH为5.6-6；
步骤2)中，所述诱变采用诱变培养基，所述诱变培养基为含有10～20mg/L2,4-D、0.5～1g/l天冬氨酸、0.3％～0.4％EMS和30g/l蔗糖的MS培养基，pH为5.6-6；
步骤3)中，所述盐胁迫筛选采用盐胁迫培养基，所述盐胁迫培养基为含有10～20mg/l2,4-D、0.5～1g/l天冬氨酸、7g/l琼脂粉、30g/l蔗糖和4～8g/l NaCl的MS培养基，pH为＝5.6-6；
步骤5)中，所述诱导分化采用分化培养基，所述分化培养基为含有5～6％麦芽糖和0.5～1％活性炭的MS培养基，pH为5.6-6；所述萌发采用萌发培养基，所述萌发培养基为含有3％蔗糖的MS培养基，pH为5.6-6。
10.如权利要求1所述的获得大豆耐盐突变体的方法，其特征在于，使用的大豆品系为东农47、东农S16或东农P746。
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