CN106062565B - 用于评估生物可利用的锌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测来自口腔护理组合物的生物可利用的金属离子的方法和一种选择抑制细胞对金属离子的摄取的化合物的方法。

Description

用于评估生物可利用的锌的方法
技术领域
本发明涉及一种检测来自口腔护理组合物的生物可利用的金属离子诸如锌的方法。
背景技术
口腔护理和个人保健制剂向口腔中递送的分子不仅是苦的，而且还是涩的，例如，具有高度涩味和苦味的金属盐。一种确定苦味和涩味水平的方法是通过使用基于细胞的测定。颊面细胞，诸如TR146，已广泛用作药物摄取的筛网(H.M.Nielsen&M.R.Rassing.Int.J.Pharm.(1999)185(2):215-25)。此细胞系来源于鳞状上皮细胞癌，因此允许细胞系的连续增殖。先前已使用分子的TR146细胞摄取来确定与宿主组织的生物相互作用，但是这些细胞显著不同于健康组织的类似细胞。
因此，需要具有一种使用与人体中的细胞更密切相关的细胞或条件的用于确定由口腔护理产品递送的生物可利用的金属离子的量的基于细胞的测定。满足这种需要将允许预测口腔护理产品将递送的涩味的水平。TR146细胞还提供通过监测靶标分子的摄取水平来计量口腔中涩味水平的方法。另外，TR146细胞允许监测口腔护理制剂中可溶性锌的量。
发明内容
提供了一种用于检测细胞内Zn摄取的方法，所述方法包括：提供TR146细胞；使Zn与TR146细胞接触；添加Zn指示剂；测量TR146细胞内的Zn摄取量。
提供了一种用于筛选减少细胞内Zn摄取的化合物的方法，所述方法包括：提供TR146细胞；向TR146细胞添加潜在的Zn摄取阻滞剂；向TR146细胞添加Zn；添加Zn指示剂；测量TR146细胞内的Zn摄取量，以确定潜在的Zn摄取阻滞剂是否减少TR146细胞内的Zn摄取。
提供了一种用于测定含Zn离子的口腔护理组合物的涩味的方法，所述方法包括：提供TR146细胞；使含锌离子的口腔护理组合物与TR146细胞接触；添加Zn指示剂；测量TR146细胞内的Zn摄取量。
具体实施方式
颊面和舌下粘膜包含具有缓慢的细胞更新的平滑肌的固定扩展。由于大量的这些细胞是可利用的，即使少量的生物可利用或可溶性金属离子的摄取也将形成离子的贮存器。由于与口腔环境的平衡，这些离子在延长的时间段内可能是可利用的，以与味觉细胞、挥发性硫、以及微生物菌群相互作用(S.G.Singh、R.P.Singh、S.K.Gupta、R.Kalyanwat和S.Yadav,Research J.of Pharm.,Biol.，以及Chem.,Sciences(2011)2(3),358-372)。
除非另外指明，下文中所用的所有百分比和比率均按总组合物的重量计。除非另外指明，本文提及的所有成分的百分比、比例和含量均基于该成分的实际含量计，并且不包括在市售产品中可与这些成分一起使用的溶剂、填料或其它物质。
除非另外指明，本文所涉及的所有测量均在25℃下进行。
如本文所用，字词“或”在用作两个或更多个元素的连词时，是指包括单独的所述元素或所述元素的组合；例如X或Y是指X或Y或二者。
所谓“个人护理组合物”是指在常规使用过程中被施用至身体表面或与身体表面接触以提供有益效果的产品。身体表面包括皮肤，例如表皮或粘膜；身体表面还包括与身体表面相关联的结构，例如毛发、牙齿、或指/趾甲。个人护理组合物的示例包括被施用于人体以改善外观、清洁、以及气味控制或整体美观的产品。个人护理组合物的非限制性示例包括毛发着色组合物、口腔护理组合物、剃须后凝胶和霜膏、剃须前准备物、剃须凝胶、霜膏或泡沫、保湿剂和洗剂、咳嗽和感冒组合物、免洗型皮肤洗剂和霜膏、洗发剂、调理剂、沐浴凝胶、条皂、盥洗室条皂、止汗剂、除臭剂、脱毛剂、口红、粉底、睫毛膏、防晒美黑霜和防晒乳液。
如本文所用，所谓“口腔护理组合物”是指在一般使用过程中不是被故意吞咽以用于特定治疗剂的全身给药的目的，而是在口腔中保留足够长的时间以接触牙齿表面或口腔组织的产品。口腔护理组合物的示例包括牙粉、漱口水、摩丝、泡沫、口喷剂、锭剂、咀嚼片、口香糖、牙齿增白条带、牙线及牙线涂层、口气清新可溶解条带、或义齿护理或粘合剂产品。所述口腔护理组合物还可掺到贴条或膜中，用于直接施用或粘附到口腔表面。
如本文所用，术语“牙粉”包括牙齿或龈下糊剂、凝胶、或液体制剂，除非另外指明。牙粉组合物可以是单相组合物，或可以是两种或更多种单独牙粉组合物的组合。牙粉组合物可呈任何期望的形式，如深条纹的、浅条纹的、多层的、糊剂周围有凝胶的、或它们的任意组合。在包括两种或更多种单独牙粉组合物的牙粉中，每种牙粉组合物均可被包含于物理上独立的分配器隔室中，并且并排分配。
鉴于与金属离子相关联的负面感受认知，本发明提供了用以测定生物可利用的金属离子诸如锌(Zn)的量的一种或多种方法和组合物。具体地，提供了用以检测细胞外和/或细胞内Zn浓度的变化并将它们与组合物干扰或阻滞细胞的Zn摄取的能力相关联的组合物和方法。此外，本公开一般涉及一种通过基于细胞的测定，例如通过使用可用于使Zn的细胞摄取可视化的TR146细胞系来评估生物可利用的金属离子的方法。TR146细胞系是来源于颊面粘膜的口腔癌细胞。通常，癌细胞具有一些不同寻常的特性(与体细胞相比)并且本发明人发现TR146细胞系具有增强的Zn运输。在某些实施方案中，用以检测Zn的方法使用响应于可溶性Zn发荧光的染料。大多数基于细胞的测定依赖于钙敏感性染料来确定特定细胞活性。钙的测量提供与本发明相比测量细胞应答水平的间接方法，本发明直接测量Zn水平的变化，从而允许一种预测活体组织中可能发生的趋势的体外方法。由于唾液冲洗和蛋白质层沉积以扩散通过，至活体宿主颊面细胞中的摄取可能将更低。本发明的体外方法提供了选择化合物的方法，所述化合物抑制细胞对金属离子的摄取，因此解释了将对可溶性金属离子起到什么制剂化学作用。
在某些实施方案中，本发明提供用于检测Zn浓度、含量、存在、或其变化的指示剂和其它试剂。在某些实施方案中，本发明提供Zn指示剂。在某些实施方案中，本文包括的指示剂和试剂提供体内或体外的Zn、和/或Zn的存在或浓度的变化的细胞内、细胞外、或非细胞检测和/或量化。在某些实施方案中，本文所述的指示剂能够(1)检测一种或多种Zn离子和/或含Zn组合物的存在(例如，通过与Zn结合)，以及(2)发出Zn离子和/或含Zn组合物的检测的信号(例如，以光学方式)。在某些实施方案中，指示剂包括以下中的一种或多种：Zn结合基团、发信号部分(例如荧光团)、以及一个或多个接头。在某些实施方案中，Zn指示剂包括任选地通过接头附接至发信号部分的Zn结合基团。在某些实施方案中，Zn结合基团和发信号部分直接附接。
在某些实施方案中，Zn结合基团包括结合其局部环境中存在的一个或多个Zn离子的化学官能团。在某些实施方案中，在Zn结合基团结合Zn离子时，Zn指示剂中的结构、构象、化学、物理、或其它变化导致来自发信号部分的信号的可检测变化(例如，发射最大值的偏移、激发最大值的偏移、强度变化等)。在某些实施方案中，来自发信号部分的信号的检测或量化提供用于检测和/或测量指示剂的局部环境中存在的Zn的存在或量的定性和/或定量方法。在某些实施方案中，来自发信号部分的信号的变化的检测或量化提供用于检测和/或测量指示剂的局部环境中存在的Zn的存在或量的变化的定性和/或定量方法。
在某些实施方案中，Zn指示剂包括美国专利7,105,680中所述的一个或多个结构或功能特征，所述专利全文以引用方式并入本文。
在某些实施方案中，Zn指示剂包含金属结合基团。在某些实施方案中，金属结合基团包括Zn结合基团。在某些实施方案中，Zn指示剂包括多于一个Zn结合基团(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10等)。在某些实施方案中，Zn结合基团为能够与一个或多个Zn离子稳定地相互作用的化学部分。在某些实施方案中，Zn结合基团能够与一个或多个Zn离子相互作用，同时共价附接至Zn指示剂的其它功能元件。在某些实施方案中，Zn结合基团通过共价和/或非共价结合与Zn离子相互作用。
本发明不限于任何特定类型或种类的Zn结合基团。在某些实施方案中，Zn结合基团包括能够瞬时或稳定地结合、配位和/或螯合一个或多个Zn离子(例如，游离的或处于另一络合物中)的官能团。在某些实施方案中，Zn结合基团为Zn特异性的。在某些实施方案中，与其它金属离子相比，Zn结合基团优先结合Zn。在某些实施方案中，Zn结合基团为通用金属结合部分。可用作本发明的Zn结合基团或用于Zn结合基团内的化学部分包括但不限于二乙基二硫代氨基甲酸酯(DEDTC)、乙二胺四乙酸(EDTA)、1,10-菲咯啉、含吡啶基化合物、含胺化合物(例如叔胺)、含组氨酸化合物、含磺酰胺化合物等。在某些实施方案中，Zn结合基团具有至少一个选自以下的官能团：亚烷基氧、羟基化基团、或具有至少一个胺的基团、铵盐、羧酸根、硫烷基、亚磺酰基、磺酰基、磷酸根、膦酸根、磷酸根、叔胺、吡啶基基团；或它们的组合。在某些实施方案中，Zn结合基团包括用于附接至Zn指示剂内的其它官能团(例如，发信号部分、接头、另一个Zn结合基团等)的一个或多个位点。
在某些实施方案中，发信号部分为可检测的化学部分。在某些实施方案中，发信号部分为光学可检测的化学部分(例如，荧光团、发色团等)。在某些实施方案中，发信号部分包括荧光染料或荧光团。在某些实施方案中，可使用发信号部分作为用于使用光学光谱法、荧光光谱法、共焦光谱法、共焦荧光光谱法、双光子激发(TPE)荧光显微法等中的一种或多种检测的荧光团。
在某些实施方案中，发信号部分被构造在Zn指示剂内，使得Zn结合基团对一个或多个Zn离子的配位导致来自发信号部分的信号的可检测变化。在某些实施方案中，信号的可检测变化包括信号(例如荧光)强度的变化(例如增加或减小)。在某些实施方案中，信号(例如荧光)强度的可检测变化(例如增加或减小)可使用本发明的组合物和方法由技术人员容易地检测(例如，1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍等)。在某些实施方案中，信号的可检测变化包括激发最大值的变化(例如增加或减小)。在某些实施方案中，信号的可检测变化包括激发光谱的变化。在某些实施方案中，信号的可检测变化包括发射大值的变化(例如增加或减小)。在某些实施方案中，信号的可检测变化包括发射光谱的变化。
本发明不限于任何特定的发信号部分。在某些实施方案中，如先前所述，发信号部分可为荧光团。本发明不限于任何特定的荧光团。可用作本发明的发信号部分或用于其内的荧光团和/或荧光标签包括但不限于例如，荧光素和罗丹明染料，诸如异硫氰酸荧光素(FITC)、6-羧基荧光素(通常已知为缩写FAM和F)、6-羧基-2',4',7',4,7-六氯荧光素(HEX)、6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素(JOE或J)、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA或T)、6-羧基-X-罗丹明(ROX或R)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5或G5)、6-羧基罗丹明-6G(R6G6或G6)、以及罗丹明110；花菁染料，例如Cy3、Cy5和Cy7染料；alexa染料，例如alexa fluor 555、alexa fluor 594；香豆素，例如伞形酮；苯甲亚胺染料，例如Hoechst33258；菲啶染料，例如德克萨斯红；溴化乙锭染料；吖啶染料；咔唑染料；吩噁嗪染料；卟啉染料；聚甲炔染料，例如花菁染料诸如Cy3、Cy5等；BODIPY染料和喹啉染料；以及它们的衍生物。合适的荧光标签包括美国专利6,723,509中所公开的多种荧光标签中的任一个，所述专利的公开内容以引用方式并入本文。在某些实施方案中，发信号部分包括用于附接至Zn指示剂内的其它官能团(例如，另一个发信号部分、接头、Zn结合基团等)的一个或多个位点。
在本发明的某些实施方案中，Zn指示剂可包括一个或多个接头、连接部分、连接基团、或接头区域。在某些实施方案中，接头连接Zn指示剂的两个或更多个官能团(例如，发信号部分、Zn结合基团等)。在某些实施方案中，接头包括1-1000个原子(例如，1-10、1-100等)。在某些实施方案中，接头将发信号部分连接至Zn结合基团。在某些实施方案中，Zn指示剂的一个或多个官能团(例如，发信号部分、Zn结合基团)可通过多个接头连接至Zn指示剂的多于一个其它官能团(例如，发信号部分、Zn结合基团)。在某些实施方案中，接头是支链，以用于连接Zn指示剂的三个或更多个官能团(例如，发信号部分、Zn结合基团)。
本发明不限于任何特定的接头基团，因为涵盖了多种接头基团，合适的接头可包括但不限于烷基基团、醚、聚醚、烷基酰胺接头、肽接头、修饰的肽接头、聚乙二醇(PEG)接头、链霉亲合素-生物素或亲和素-生物素接头、聚氨基酸(例如聚赖氨酸)、官能化的PEG、多糖、糖胺聚糖、树枝状聚合物(WO93/06868和Tomalia等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.29:138-175(1990)，以引用方式全文并入本文)、PEG-螯合剂聚合物(WO94/08629、WO94/09056和WO96/26754，以引用方式全文并入本文)、寡核苷酸接头、磷脂衍生物、烯基链、炔基链、二硫化物、或它们的组合。
在某些实施方案中，接头包括将Zn指示剂的一个官能团(例如，发信号部分、Zn结合基团)连接至Zn指示剂的另一个官能团(例如，发信号部分、Zn结合基团)的单链。在某些实施方案中，存在将多个Zn结合基团连接至单个发信号部分的多个接头。在某些实施方案中，接头可将多个Zn结合基团彼此连接。在某些实施方案中，接头可将多个发信号部分彼此连接。在某些实施方案中，接头可为支链的。在某些实施方案中，接头可为柔性的或刚性的。
Zn指示剂的示例包括但不限于FluoZin-3(CAS#404335-95-1)、RhodZin-3(CAS#677716-65-3)、FluoZin-1(CAS#411209-53-5)、以及Newport Green DCF(CAS#288374-37-8)。
在某些实施方案中，本发明提供用于检测、测量、鉴定、和/或量化Zn离子和/或含Zn化合物或组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供用于检测、测量、鉴定、和/或量化Zn浓度的方法。在某些实施方案中，本发明提供用于检测、测量、鉴定、和/或量化Zn浓度的变化的方法。在某些实施方案中，本发明提供用于将生物和/或细胞事件、变化、过程、和/或现象与Zn浓度或其变化(例如，细胞外Zn浓度、细胞内Zn浓度等)相关联的方法。在某些实施方案中，任何合适的检测和/或定量Zn离子的存在和/或浓度、或其变化的方法可用于本发明。在某些实施方案中，通过使用Zn敏感性指示剂诸如本文描述的那些来检测和或定量Zn离子。
在某些实施方案中，本发明提供用于检测来自细胞的Zn释放和/或摄取、以及其与Zn摄取阻滞剂的效果的相关性的组合物和方法。
锌摄取阻滞剂包括使TR146细胞对锌的摄取减慢或抑制所述摄取并且将允许计量分子系留锌离子的强度的分子。如在实施例中所展示对于锌具有特异性的螯合剂示出这些分子抑制细胞的锌摄取的效果。因此，游离的锌将减少，如细胞读数所指出。
上文已提供了具体实施方式，出于例示本发明的目的给出以下实施例并且不应解释为对本发明或权利要求范围的限制。
实施例
实施例1
如同对于大多数金属离子，指示剂的选择取决于细胞类型、离子通道和金属特异性。在Zn的情况下，通过筛选可从Life Technologies,Grand Island,NY商购获得的Zn指示剂选择特定指示剂。表1示出使用TR146细胞筛选的指示剂。
为了筛选Zn指示剂，使用FLIPR(荧光成像读板机)测定进行进入TR146细胞中的Zn摄取测量。使用Zn指示剂的细胞膜可透过型式FluoZin-3AM(Life Technologies,GrandIsland,NY)建立测定。在37℃下，在设置为5％CO2的哺乳动物细胞培养箱中，使TR146细胞在75cm2烧瓶中的15ml生长培养基[补充有10％FBS(胎牛血清)，100个单位/mL青霉素和100μg/ml链霉素的高葡萄糖DMEM(Dulbecco's Modification of Eagle's Medium)]中生长3天至汇合。加入10ml PBS(磷酸盐缓冲盐水)并且手动轻轻振荡使细胞分离，并转移至50ml管中，并以850rpm离心3分钟，以除去PBS。离心后，细胞沉淀物形成在管子底部，使它们与上层溶液分离。弃去上清液，将细胞沉淀物悬浮在1ml新鲜生长培养基中，其中加入5μl(12.5μg)FluoZin-3AM Zn指示剂并轻轻振荡温育30分钟。FluoZin-3AM是一种用于定量在1nM至100nM范围内的细胞内Zn浓度的荧光染料。在30分钟结束时，加入45mL测定缓冲液[1xHBSS(Hank平衡盐溶液)、20mM HEPES(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸)]以洗涤细胞，然后将所得组合物在850rpm下离心3分钟以除去过量的缓冲液和FluoZin-3AM Zn指示剂。将沉淀细胞重悬于10ml测定缓冲液中，并将每孔90μl等分试样(～50,000细胞)递送至96孔测定平板并且将平板置于荧光计量成像读板机(得自Molecular Devices,Sunnyvale,CA的FLIPR384)中并记录基础荧光(激发波长494nm以及发射波长516nm)。然后添加Zn盐(例如，乳酸锌)并记录5分钟内的荧光增加。
表1
染料 亲和力Kd(Zn2+)和荧光的成倍增加
FluoZin-3 15nM(响应于Zn2+的饱和水平，荧光增加>50倍)
RhodZin-3 65nM(响应于Zn2+的饱和水平，荧光增加>50倍)
FluoZin-1 8uM
Newport Green DCF 30uM
发现FluoZin-3和RhodZin-3对于进入TR146细胞系的Zn的通量具有最大亲和力。FluoZin-3用于本文报告的数据。
实施例2：Zn盐在TR146中的通量
使用FLIPR(荧光成像读板机)测定进行进入TR146细胞中的Zn摄取的测量。使用Zn染料的细胞膜可透过型式FluoZin-3AM(Life Technologies,Grand Island,NY)建立测定。在37℃下，在设置为5％CO2的哺乳动物细胞培养箱中，使TR146细胞在75cm2烧瓶中的15ml生长培养基[补充有10％FBS(胎牛血清)，100个单位/mL青霉素和100μg/ml链霉素的高葡萄糖DMEM(Dulbecco's Modification of Eagle's Medium)]中生长3天。加入10ml PBS(磷酸盐缓冲盐水)并且手动轻轻振荡使细胞分离，并使其转移至50ml管中，并以850rpm离心3分钟，以除去PBS。离心后，细胞沉淀物形成在管子底部，使它们与上层溶液分离。弃去上清液，将细胞沉淀物悬浮在1ml新鲜生长培养基中，其中加入5μl(12.5μg)FluoZin-3AM Zn指示剂并轻轻振荡温育30分钟。FluoZin-3AM是一种用于定量在1nM至100nM范围内的细胞内Zn浓度的荧光染料。在30分钟结束时，加入45mL测定缓冲液[1xHBSS(Hank平衡盐溶液)、20mMHEPES(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸)]以洗涤细胞，然后将所得组合物在850rpm下离心3分钟以除去过量的缓冲液和FluoZin-3AM Zn指示剂。将沉淀细胞重悬于10ml测定缓冲液中，将每孔90μl等分试样(～50,000细胞)递送至96孔测定平板并且将平板置于荧光计量成像读板机(得自Molecular Devices,Sunnyvale,CA的FLIPR384)中并记录基础荧光(激发波长494nm以及发射波长516nm)。然后添加Zn盐(例如，乳酸锌)并记录5分钟内的荧光增加。以乳酸锌值作为参照(100％)，在不同的Zn盐下观察到的Zn通量在下表2中示出。
表2
Zn盐 浓度 荧光单位 乳酸锌通量％
甘氨酸锌 4.40％ 41086.61 86.93
ZnCl2 1mM 47853.41 101.25
ZnSO4 1mM 47853.41 101.25
磷酸锌 饱和 49686.65 105.13
草酸锌 饱和 55389.93 117.2
乙酸锌 10uM 48547.79 102.72
氧化锌 饱和 50391.21 106.62
吡啶硫酮锌 10mM 50467.87 106.78
水 1901.26 4.02
表2示出相对于进入TR146细胞中的Zn离子的通量，具有不同抗衡离子的Zn盐的作用。甘氨酸锌示出比其它盐更小的Zn通量(乳酸锌通量的86.93％)。这说明，由于抗衡离子或螯合剂，细胞可区分锌的不同溶解度。即使在4.4％下(206mM)，Zn通量也比在浓度低得多的其它Zn盐下所观察到的慢。
实施例3：聚季铵盐阻滞进入TR146细胞中的Zn摄取的初始测试
使用由Cancer Research Technologies Ltd.提供的在高葡萄糖Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)(Life Technologies,Grand Island,NY)中的整瓶细胞(大约1ml)，使可购自Cancer Research Technologies Ltd.,U.K.的TR146颊面粘膜细胞在75cm2烧瓶中增殖。培养基补充有3.7mg/ml NaHCO3、10％FCS、50个单位/ml青霉素G、以及50mg/ml硫酸链霉素。当达到90％汇合度时，将细胞传代。弃去培养基，将细胞用无菌DPBS(没有钙和镁，Mediatech,Inc.,Manassas,VA)洗涤两次并添加0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液(LifeTechnologies,Grand Island,NY)。将75cm2烧瓶在37℃下放置10分钟，然后将分离的细胞悬浮于生长培养基中并接种于96孔微滴定板中。
如实施例2中所述进行用于测试Zn摄取和聚季铵盐对其造成的阻滞的过程。
表3
在表3示出的聚季铵盐中，仅有Mirapol A-15示出>10％的对TR146细胞的Zn摄取的阻滞。当将这种方案应用于完全配制的牙粉时，可易于观察生物可利用的Zn的水平，如表2中所示。
实施例4：来自配制的牙粉的Zn的生物利用率
对具有下表4中所示的组分的样品A、B、C、D进行测试，以确定Zn螯合对Zn摄取的影响。
表4
牙粉样品(样品A和B)为0.1克/1ml提取的DMSO并且DMSO提取物在生长培养基中稀释40倍；漱口液样品(样品C和D)直接稀释于生长培养基中。将20μl的各样品添加至100ul细胞(大约10,000个细胞)高葡萄糖DMEM(Dulbecco's Modification of Eagle's Medium)中，所述DMEM补充有10％FBS(胎牛血清)、青霉素/链霉素(100个单位/mL青霉素和100μg/ml链霉素)。使用FLIPR(荧光成像读板机)测定进行进入TR146细胞中的Zn摄取测量，如实施例2中所述。
样品A、B、C、D(表4中所示)表明，可由通过TR146细胞的通量确定Zn的螯合的增加，因为表5中的值越低，相当于通量可获得的锌越少，因此指示了更强效的螯合剂。该方法的重要性在于能够提供体外方法，该体外方法可预测配方组分在体内将如何表现，具体地，Zn以及其在牙垢移除、口气减轻和抗微生物活性中的后续可用性。
表5
牙粉样品B和C示出少于对照乳酸锌的Zn摄取。样品B的减少的Zn摄取可能是由于牙粉中的螯合剂(葡萄糖酸钠)。这些结果表明了缺乏生物可利用的Zn，如样品B、C和D中的Zn摄取量减少所显示的。无论是针对牙垢移除还是口臭的减轻，这可能影响Zn的最终有益效果。这种体外方法因此提供了针对高度生物可利用的Zn或其缺乏来优化制剂的方法，而无需进行人测试进行制剂的Zn功效的首先了解。样品D和水空白示出测量过程的背景噪音(分别为5.43％和4.02％)。
实施例5：通过TR146测量获得的螯合剂对Zn通量的影响
表6示出螯合剂和锌的组合的作用。将50μM的各螯合剂与50μM的乳酸锌组合，如表6中第三栏所示。将5μM的各螯合剂与5μM的乳酸锌组合，如表6中第四栏所示。然后将这些组合放置在生长培养基中并且使用FLIPR(荧光成像读板机)测定进行进入TR146细胞中的Zn摄取的测量，如实施例2中所述。对照(即分别在第5栏和第6栏中示出的50μM或5μM的单独的螯合剂)显示，螯合剂不引起荧光应答。
表6
*所有百分比均是相对于乳酸锌对照的通量的。
表6示出如通过进入TR146细胞中的通量所测量的高Zn螯合的作用。Zn的强效螯合剂，诸如50μM的酸式焦磷酸钠和三聚磷酸钠不允许在TR146细胞荧光系统中检测到任何可测量水平的Zn。
实施例6：螯合剂对生物可利用的Zn的影响
表7示出在TR146细胞摄取50μM乳酸锌时各种阳离子聚合物和牙粉粘结剂的作用。这些材料与乳酸锌组合并在引入染料之前放置到TR146细胞的生长培养基中，如实施例2中所述。
表7
实施例7：来自胺聚合物的竞争性抑制
表8示出与氯化锌结合的胺聚合物的组合。将聚合物与氯化锌组合(将20ul生长培养基中的聚合物和Zn组合与TR146细胞(100μl生长培养基中大约10,000个)混合)，在引入染料之前组合到TR146细胞的生长培养基中，如实施例2中所述。
表8
表8示出可在不同pH下质子化的聚合物与伯胺、仲胺和叔胺的作用。它们的作用可用于提供阳离子电荷拒斥力，因此阻止生物可利用的Zn进入TR146细胞。Lupasol材料的作用是Zn通量的明显抑制，其中Lupamine仅仅示出微小的Zn通量减少。
本文所公开的量纲和值不应理解为严格限于所引用的精确值。相反，除非另外指明，否则每个这样的量纲旨在表示所述值以及围绕该值功能上等同的范围。例如，公开为“40mm”的量纲旨在表示“约40mm”。
除非明确地排除或换句话讲有所限制，本文中引用的每一篇文献，包括任何交叉引用或相关专利或专利申请以及本申请对其要求优先权或其有益效果的任何专利申请或专利，均据此全文以引用方式并入本文。任何文献的引用均不是对其作为本文所公开的或受权利要求书保护的任何发明的现有技术，或其单独地或与任何其它参考文献的任何组合，或者参考、提出、建议或公开任何此类发明的认可。此外，当本发明中术语的任何含义或定义与以引用方式并入的文件中相同术语的任何含义或定义矛盾时，应当服从在本发明中赋予该术语的含义或定义。
虽然已经举例说明和描述了本发明的具体实施方案，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明实质和范围的情况下可以做出多个其它改变和变型。因此，本文旨在所附权利要求中涵盖属于本发明范围内的所有这些改变和变型。

Claims (22)

1.用于检测细胞内Zn摄取的方法，所述方法包括：
提供TR146细胞；
使Zn与所述TR146细胞接触；
添加Zn指示剂；
测量所述TR146细胞内的Zn摄取量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述Zn指示剂包含任选地通过接头附接到发信号部分的Zn结合基团。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述Zn结合基团包括能够瞬时结合或稳定结合一个或多个Zn离子的官能团。
4.根据权利要求2所述的方法，其中其中所述Zn结合基团包括能够配位一个或多个Zn离子的官能团。
5.根据权利要求2所述的方法，其中其中所述Zn结合基团包括能够螯合一个或多个Zn离子的官能团。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的方法，其中所述Zn结合基团包括含吡啶基化合物、含胺化合物、含组氨酸化合物、或含磺酰胺化合物中的至少一种。
7.根据权利要求3-5中任一项所述的方法，其中所述Zn结合基团包括二乙基二硫代氨基甲酸酯(DEDTC)、乙二胺四乙酸(EDTA)或1,10-菲咯啉中的至少一种。
8.根据权利要求3-5中任一项所述的方法，其中所述Zn结合基团包括聚亚烷基氧化物、羟基化基团、铵盐、羧酸根、硫烷基、亚磺酰基、磺酰基、磷酸根、膦酸根、叔胺、或吡啶基基团中的至少一者。
9.根据权利要求2所述的方法，其中所述发信号部分包括可检测的化学部分。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述发信号部分包括荧光染料。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述发信号部分包括荧光团。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述发信号部分包括荧光素染料、罗丹明染料、花菁染料、alexa染料、苯甲亚胺染料、溴化乙锭染料、吖啶染料、咔唑染料、吩噁嗪染料、卟啉染料、聚甲炔染料、BODIPY染料、或喹啉染料中的至少一者。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述Zn指示剂为FluoZin-3(CAS#404335-95-1)、RhodZin-3(CAS#677716-65-3)、FluoZin-1(CAS#411209-53-5)、以及Newport Green DCF(CAS#288374-37-8)中的至少一者。
14.用于筛选减少细胞内Zn摄取的化合物的方法，包括：
提供TR146细胞；
向所述TR146细胞添加潜在的Zn摄取阻滞剂；
向所述TR146细胞添加Zn；
添加Zn指示剂；
测量所述TR146细胞内的Zn摄取量，以确定所述潜在的Zn摄取阻滞剂是否减少所述TR146细胞内的Zn摄取。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述Zn指示剂包含任选地通过接头附接到发信号部分的Zn结合基团。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述Zn结合基团包括能够瞬时结合或稳定结合一个或多个Zn离子的官能团。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述Zn结合基团包括能够配位一个或多个Zn离子的官能团。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述Zn结合基团包括能够螯合一个或多个Zn离子的官能团。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述发信号部分包括可检测的化学部分。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述发信号部分包括荧光染料。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述发信号部分包括荧光团。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述发信号部分包括荧光素染料、罗丹明染料、花菁染料、alexa染料、苯甲亚胺染料、溴化乙锭染料、吖啶染料、咔唑染料、吩噁嗪染料、卟啉染料、聚甲炔染料、BODIPY染料、或喹啉染料中的至少一者。
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