CN106053807A

CN106053807A - 一种牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接elisa检测试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN106053807A
Application number: CN201610596739.2A
Authority: CN
Inventors: 彭远义; 李能章; 程蓉; 李杜; 赵益萍; 刘舒萍
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2016-07-26
Filing date: 2016-07-26
Publication date: 2016-10-26
Anticipated expiration: 2036-07-26
Also published as: CN106053807B

Abstract

本发明公开一种牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包括用牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230包被的固相载体、HRP标记的IgG酶标二抗、标准阳性对照血清、标准阴性对照血清、样品稀释液、浓缩洗涤液、显色液和终止液；所述方法采用所述试剂盒进行检测，将待检测血清样品与固相载体上包被的牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230接触和保温孵育，用HRP标记的IgG酶标二抗特异地捕捉结合于0230蛋白抗原上的特异抗体，并用显色剂显色，从而测定得到待检测血清样品中针对0230蛋白的抗体水平。本发明检测试剂盒及检测方法具有特异性好、敏感性高、重复性好等特点。

Description

一种牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及兽医生物制品领域，更具体的说是涉及基于特异蛋白的一种牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

牛多杀性巴氏杆菌（Bovine Pasteurella multocida，Pm）是一种引起牛发生出血性败血症或呼吸系统疾病的重要病原菌。多杀性巴氏杆菌根据其菌体荚膜抗原的不同，可分为A、B、D、E和F 5种荚膜血清型，其中对牛致病的荚膜血清型有A、B、E及F型；A和F型主要导致牛呼吸系统疾病，B和E型主要导致牛出血性败血症。以往我国流行的牛多杀性巴氏杆菌病主要由荚膜血清B型引起，自2008年以来，A型多杀性巴氏杆菌病在我国许多省市相继流行，给养牛业造成了重大经济损失。目前，国内外针对疾病诊断和疫苗效力的检测方法主要有病原分离鉴定、PCR检测技术、琼脂扩散试验、间接血凝试验以及ELISA试验等。PCR检测技术主要用于实验室研究，琼脂扩散试验和间接血凝试验敏感性较低， ELISA检测方法具有灵敏性高和易批量检测等优点。

对于疫病诊断与疫苗效力检测，其ELISA抗体检测试剂盒具有一定差异，用于疫病诊断的ELISA抗体检测试剂盒要求靶标抗原特异（最好能区分感染抗体与免疫抗体，如不能区分则只能用于未免疫动物疫病诊断）；而用于疫苗效力检验的ELISA抗体检测试剂盒则要求所用靶标抗原为特异性保护性抗原，所检测抗体水平要与其免疫保护性呈现正相关性，传统疫苗中不是所有的抗原成分免疫产生的抗体水平都会与该疫苗的保护性呈现正相关，因此用于疫苗效力检测的ELISA抗体检测试剂盒的抗原选择就尤为重要。

目前我国尚无用于牛多杀性巴氏杆菌病血清流行病学调查和疫苗免疫效果评价的ELISA抗体检测试剂盒。因此，寻找特异性抗原靶标，研制一种快速、敏感、特异的ELISA抗体检测试剂盒，以用于疫苗免疫效果评价和疫病血清流行病学调查，对于有效防控牛多杀性巴氏杆菌病具有重要意义。

发明内容

本发明目的在于解决现有技术的缺点和不足，针对目前国内没有商品化针对牛源多杀性巴氏杆菌抗体水平进行检测的检测试剂盒的技术问题，提供一种能有效评价牛源多杀性巴氏杆菌疫苗免疫效果及未免疫牛群多杀性巴氏杆菌感染血清流行病学调查的牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒具有快速、特异、敏感、稳定等特点。

本发明的目的通过以下技术方案实现：一种牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒，包括用牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230包被的固相载体、HRP标记的IgG酶标二抗、标准阳性对照血清、标准阴性对照血清、样品稀释液、浓缩洗涤液、显色液和终止液；其中，所述牛源多杀性巴氏杆菌特异蛋白0230的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述阳性对照血清为犊牛感染牛源多杀性巴氏杆菌后的血清，阴性对照血清为未免疫和未感染多杀性巴氏杆菌的犊牛血清。

一种牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测方法，采用上述牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒进行检测，将待检测血清样品与固相载体上包被的牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230接触和保温孵育，用HRP标记的IgG酶标二抗特异地捕捉结合于0230蛋白抗原上的特异抗体，并用显色剂显色，从而测定得到待检测血清样品中针对0230蛋白的抗体水平。

相比现有技术，本发明具有如下优点：

1、为了能够使本发明试剂盒能够全面对牛源A、B和F型多杀性巴氏杆菌的抗体进行检测，本发明从A型、B型及F型共有的200多个基因中筛选出32个候选基因，以这些基因翻译成蛋白的氨基酸序列调入NCBI数据库进行比较分析及抗原表位分析，根据其比对结果，综合分析其总得分值、覆盖率、同源性及抗原表位结果，筛选出0230基因，对筛选出的牛源多杀性巴氏杆菌0230的基因序列经克隆测序分析，显示其在牛源多杀性巴氏杆菌常见的不同血清型菌株中同源性高，保守性好，对其蛋白氨基酸序列进行分析，结果显示其在牛多杀性巴氏杆菌菌株基因组中具有高度同源性、保守性和通用性，能够对牛源A、B和F型多杀性巴氏杆菌具有优异的特异性和保守性，能够用于牛源A、B和F型多杀性巴氏杆菌抗体的检测抗原。

2、本发明所用的包被抗原牛多杀性巴氏杆菌0230蛋白可通过基因工程克隆表达获得，生物安全性高；本发明所用抗原牛多杀性巴氏杆菌0230蛋白本身具有免疫保护作用，该蛋白产生的抗体持续时间较长，用该蛋白建立的ELISA试剂盒所检出的抗体水平与牛源多杀性巴氏杆菌疫苗免疫保护力及该蛋白免疫保护力呈现线性正相关，可用于牛源多杀性巴氏杆菌疫苗免疫抗体水平监测、疫苗免疫效果评价及未免疫牛群多杀性巴氏杆菌感染血清流行病学调查，具有广阔的应用前景。

3、本发明采用筛选出的0230特异性蛋白包被固相载体，制备间接ELISA检测试剂盒，采用制得的检测试剂盒对牛源多杀性巴士杆菌抗体进行检测，该方法的检测原理为：向包被了0230蛋白的固相载体中加入待检测的牛血清样品，如果血清中含有牛源多杀性巴士杆菌特异性抗体时，抗体会与固相载体上的0230特异性蛋白抗原结合，然后加入能与特异性抗体键合的HRP标记兔抗牛IgG酶标二抗，再加入TMB显色液，在HRP的催化作用下TMB显色，颜色反应的强度与血清样品中牛多杀性巴氏杆菌抗体含量呈正相关，可以通过酶标仪读数显示，判断待检测样品中抗体含量水平，来判断抗体的保护效果。

4、采用本发明方法对牛源多杀性巴士杆菌抗体进行检测，检测步骤方便操作，检测时间短，本发明方法检出限低、检测灵敏度高，对A型、B型、F型牛源多杀性巴氏杆菌均具有良好的特异性，且稳定性能好，方法重复性良好，检测结果真实可靠，误判率低。

附图说明

图1为0230基因表达产物的SDS-PAGE检测图，其中：M：蛋白Marker；a：诱导产物（方框标记处为目的基因表达的融合蛋白）。

图2为纯化的重组蛋白0230 SDS-PAGE检测图；其中：M：蛋白Marker；a：纯化的融合蛋白。

图3为纯化的重组蛋白0230 Western-blot检测图；其中：M：蛋白Marker；a：纯化的融合蛋白。

图4为免疫攻毒后小鼠存活情况图。

图5为抗体水平与A型巴氏杆菌攻毒保护关系图。

图6为抗体水平与B型巴氏杆菌攻毒保护关系图。

图7为抗体水平与F型巴氏杆菌攻毒保护关系图。

图8 为灭活疫苗免疫不同时间试验兔攻毒生存曲线图。

图9 为灭活疫苗免疫不同时间试验兔抗体ELISA检测结果图。

图10 为抗体水平与攻毒保护关系图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和说明书附图对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程来说明本发明具有创造性，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。

下述实施例中牛源多杀性巴氏杆菌A型CQ2菌株及F型菌株：由西南大学动物科技学院预防兽医学实验室从患有呼吸道综合征的病死牛肺中分离鉴定保藏。牛源多杀性巴氏杆菌B型菌株（CVCC450）：购自中国兽医药品监察所。其他试剂如无特殊说明，即为普通市售产品。

实施例1 牛源多杀性巴氏杆菌特异性抗原蛋白的筛选：

对牛源多杀性巴氏杆菌A型、B型及F型菌株的全基因组序列进行测序，通过对本实验室测定的牛源多杀性巴氏杆菌A型、B型及F型菌株全基因组序列比较分析，根据预测具有信号肽的得分值，从A型、B型及F型共有的200多个基因中筛选出32个候选基因，以这些基因翻译成蛋白的氨基酸序列调入NCBI数据库进行比较分析（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）及抗原表位分析（http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/），根据其比对结果，综合分析其总得分值、覆盖率、同源性及抗原表位结果，筛选出0230基因；进一步对0230基因及其编码蛋白进行生物信息学和PCR分析，证明该基因及其编码蛋白具有多杀性巴氏杆菌属特异性，在牛源A、B和F型多杀性巴氏杆菌中均存在，具有较好的特异性和保守性，可以作为对牛源多杀性巴士杆菌抗体进行检测的间接ELISA试剂盒中的抗原。

实施例2 多杀性巴氏杆菌0230基因的克隆表达及表达蛋白免疫保护性测定：

根据牛源多杀性巴氏杆菌荚膜血清A型菌株CQ2基因组序列，设计0230基因的扩增引物：上游引物5’-gagtcagaattcgatgtgattgcagataattt；下游引物5’-gagtcactcgaggaacataagaagatgcccat。上游引物中划线段为EcoRI酶切位点，下游引物中划线段为XhoI酶切位点。

提取牛源多杀性巴氏杆菌荚膜血清A型菌株CQ2的基因组DNA，并以此为模板，采用上述设计的引物PCR扩增0230基因，扩增条件为94℃ 3min； 94 ℃ 30s，60℃ 30s，72 ℃ 1min，35个循环；72 ℃延伸10 min，4℃保存；将PCR产物经 EcoRI酶和XhoI酶酶切回收，将酶切回收产物与原核重组表达载体pET30a连接，获得0230基因的重组表达质粒pET30a-Pm0230，将该重组质粒转化大肠杆菌 E .coilBL21（DE3）感受态细胞进行表达，当重组菌液OD600≈0.5时，加入 IPTG（500 mmol/L）至在重组菌液中的终浓度为0.1 mmol/L，于37℃、220 r/min的条件下诱导3 h，获得表达产物，采用SDS-PAGE检测重组蛋白的表达，检测结果如图1所示，得到了与预期大小相当的重组蛋白（图1）。

采用与上述相同的方法对该重组菌进行大量诱导表达，获得大量的重组蛋白，通过Ni-NTA Superflow Cartridges His亲和层析柱（简称Ni柱）纯化并使用透析除盐后，采用SDS-PAGE检测纯化产物，检测结果如图2所示，从图2可以看出得到了与该蛋白大小相符的纯化产物。

采用感染牛源多杀性巴氏杆菌A型菌株CQ2的牛血清作为一抗，以Western blot方法检测上述方法得到的纯化蛋白，结果发现该纯化蛋白能够与牛血清发生免疫印迹反应（图3），表明感染多杀性巴氏杆菌A型菌株CQ2的牛血清中含有0230蛋白的抗体。

以纯化的重组蛋白0230制备抗原免疫昆明小鼠，2免后分别攻毒牛源多杀性巴氏杆菌A型、B型及F型菌株的各自的4倍半数致死剂量，观察1周，记录各自的小鼠存活率，绘制生存曲线（图4），从图4可以看出该蛋白对牛源多杀性巴氏杆菌A型、B型和F型菌株的保护率分别为80%、70%和60%，该结果同时提示B型及F型菌株也表达了该蛋白。

实施例3 牛源多杀性巴氏杆菌间接ELISA试剂盒

试剂盒的组分包括用纯化的牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230包被的固相载体，标准阳性对照血清，标准阴性对照血清，HRP标记的兔抗牛IgG酶标二抗，显色液，终止液，浓缩洗涤液、样品稀释液和血清稀释板。所述牛源多杀性巴氏杆菌特异蛋白0230的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

其中，固相载体为96孔聚苯乙烯酶标板；所述牛源多杀性巴氏杆菌特异蛋白0230为采用上述实施例的方法大肠杆菌重组表达后纯化的产物；用纯化的牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230包被固相载体是指采用浓度为10 μg/mL的纯化重组抗原蛋白0230于4℃包被固相载体过夜，而后用1 wt.%卵清蛋白37℃封闭1.5h；阳性对照血清为犊牛感染牛源多杀性巴氏杆菌后的血清，阴性对照血清为未免疫和未感染多杀性巴氏杆菌的犊牛血清；显色液为TMB，反应终止液为2 mol/L的H₂SO₄，浓缩洗涤液为25倍PBST 洗涤液，样品稀释液是含0.5%BSA、0.05%Tween 20、5 mmol/L EDTA、0.35 mol/L NaCl、pH7.2的PBS液。

具体地，本实施例设计了如下规格的试剂盒商品：

1、用纯化的牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230包被板：96孔/板×1。

2、标准阳性对照血清：30 μL/支×1支。

3、标准阴性对照血清：30 μL /支×1支。

4、样品稀释液：50 mL/瓶×1。

5、HRP标记的兔抗牛IgG酶标二抗：50 μL /支×1支。临用前以样品稀释液稀释按照1:500的体积比稀释。

6、25×PBST浓缩洗涤液： 30mL/瓶×1瓶。

7、终止液：10mL/瓶×1瓶（2 mol/L H₂SO4）。

8、TMB显色液：20 mL/瓶×1瓶。

9、血清稀释板：96孔/板×1块

实施例4 检测方法

采用上述检测试剂盒进行检测，检测时需要使用1）酶标仪（建议参考仪器使用说明提前预热）；2）微量加液器及吸头，EP管；3）蒸馏水或去离子水。

采用该试剂盒进行检测的原理为：酶标板上包被了牛源多杀性巴氏杆菌特异性抗原0230蛋白，加入待测血清样品；如果血清中含有特异性抗体，将与酶标板上的特异性抗原结合；然后加入能与抗体结合的用HRP标记的兔抗牛IgG酶标二抗，再加入TMB显色液显色，颜色反应的强度与血清样品中牛多杀性巴氏杆菌抗体含量呈正相关，可以通过酶标仪读数显示。

具体检测操作步骤如下：

1）实验开始前，各试剂均应平衡至室温；对待检测的血清样品用样品稀释液按照1:100的体积比进行稀释，以使稀释后的样品检测的吸光度值符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数；阳性标准血清和阴性标准血清也用样品稀释液按照1:100的体积比进行稀释。

2）加样：在96孔板固相载体中分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加100 μL样品稀释液，阳性标准孔加100 μL稀释后的阳性对照血清，阴性标准孔加100 μL稀释后的阴性对照血清，待检测样品孔加100 μL稀释后的待测样品，加样时注意不要使孔中有气泡，将各溶液加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，于37℃孵育反应90分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

3）洗涤：步骤2）孵育结束后，弃去并甩干孔内液体，向甩干后的每孔中加洗涤液350 μL浸泡4-5分钟，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）后再进行第二次洗涤，总共洗涤5次。

4）HRP标记的兔抗牛IgG酶标二抗：向步骤3）洗涤后的每孔中加稀释过的酶标二抗（酶标二抗与样品稀释液按照l:500的体积比稀释，在使用前十分钟内稀释）100μL，37℃孵育30分钟。

5）洗涤：步骤4）孵育后弃去并甩干孔内液体，同步骤3）方法洗涤孔5次。

6）显色：依序向每孔中加入显色液 100 μL，37℃避光反应10分钟。

7）终止反应：依序每孔加终止液100 μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。

8）测定：加终止液后立即进行检测，用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。测定应在加终止液后15 分钟以内进行。

9）结果判定：阳性对照血清D _450nm值大于1.0，阴性对照血清D _450nm 值小于0.30时，实验结果判定为合格；反之，为不合格，需重新检测；阴阳性临界值为0.388，待测样品的D _450nm 值大于0.388时为阳性，小于或等于0.388时为阴性。

实施例5 蛋白0230免疫抗体水平与攻毒保护之间的相关性测定：

以上述重组蛋白0230制备的抗原免疫小鼠，每组10只，免疫12组，对照3组，共15组，分别在免疫5d、10d、15d、21d尾静脉采血分离血清。

采用本发明检测试剂盒和方法对分离得到的血清中免疫抗体水平进行测定。结果表明（表1），该蛋白免疫抗体水平随着免疫时间的延长而升高。每次采血后分别以牛源多杀性巴氏杆菌A型、B型及F型菌株进行攻毒保护性试验，攻毒后观察7天，记录小鼠存活率，构建了免疫抗体水平与不同血清型牛源多杀性巴氏杆菌攻毒保护率相关曲线图（图5、6、7），结果表明，基于0230蛋白构建的ELISA试剂盒所测定的该蛋白免疫抗体水平高低与其免疫保护呈正相关。

表1 小鼠血清0230蛋白抗体ELISA检测结果（OD450nm值）

Date	5d	10d	15d	21d	Ck
						平均OD值（450nm测定）	0.447	0.687	0.795	1.015	0.245

实施例6 灭活疫苗免疫抗体水平与攻毒保护之间的相关性测定：

按照灭活菌苗制定标准，制备多杀性巴氏杆菌PmCQ2菌株灭活疫苗。选择30只健康家兔，随机分为6组，每组5只（1.5kg/只）。其中1组试验兔注射1mL生理盐水作为阴性对照，其余5组按疫苗最佳免疫剂量（5.6×10⁹CFU）依次免疫，第一次免疫第1组，一周之后免疫第2组，以此类推，第5周时免疫第5组，第6周分别对每组试验兔进行耳缘静脉采血，并肌肉接种最小致死量（1.5×10⁹CFU）的PmCQ2，至此使得每组试验兔分别在免疫后的第35d、第28d、第21d、第14d和第7d受到攻毒感染。攻毒后，饲养观察20d，记录试验兔存活情况。耳缘静脉采血后，分离血清，采用基于重组蛋白0230所建立的ELISA方法测定血清抗体效价，研究免疫抗体水平与攻毒保护之间的相关性。

结果表明，以最佳免疫剂量免疫7d、14d、21d、28d、35d后攻毒，对照组家兔3天内全部死亡，免疫7d组在第3d死亡2只，在第4、11d各死亡一只，存活率为20%；免疫14d组，在第3、5d各死亡一只，存活率为60%；免疫21d组仅在第4d死亡一只，存活率为80%；免疫28d、35d组试验兔全部健活，存活率均为100%（图8）。

免疫7d、14d、21d、28d、35d组试验兔抗体水平D _450nm平均值分别为0.762、1.092、1.290、1.484、1.530，且各试验组抗体水平随免疫时间的延长而逐渐增加（图9）；其攻毒保护率依次为20%、60%、80%、100%、100%（图10）。

从以上结果可以看出，测定多杀性巴氏杆菌特异蛋白0230抗体水平，能够反映多杀性巴氏杆菌所制备菌苗免疫动物后其抗体产生的动态变化，同时抗体水平与其保护率呈现正相关性。

实施例7 特异性、稳定性和灵敏度检测

对本发明试剂盒和检测方法的特异性、稳定性和灵敏度进行检测验证：

特异性试验表明，包被重组抗原0230与牛支原体、牛病毒性腹泻、牛/羊口蹄疫阳性血清均不发生交叉反应，而与A型、B型、F型牛源多杀性巴氏杆菌阳性血清均呈阳性反应。结果显示，以0230重组蛋白构建的间接ELISA方法有较好的特异性（表2）。

表2 特异性检测结果

阳性血清	MB	BVD	FMD	PmA	PmB	PmF
							OD_450nm值	0.235	0.167	0.188	1.165	1.135	1.001

稳定性试验表明，同批次包被板检测10份血清OD450nm值变异系数介于2.15%~5.18%之间，不同批次包被板检测10份血清OD450nm值变异系数介于5.18%~9.76%之间，说明该方法重复性良好。

随机选取阳性样本，对阳性样本进行倍比稀释后，用建立的ELISA方法检测，结果显示，当血清以1:1280倍的体积比稀释后，仍可以检测到阳性，说明此该方法具有良好的灵敏性（表3）。

表3 灵敏性试验

阳性血清稀释度	1:20	1:40	1:80	1:160	1:320	1:640	1:1280	1:2560
									OD_450nm值	1.361	1.281	1.177	1.006	0.841	0.696	0.438	0.258

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

<110> 西南大学；

<120> 一种牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒及其检测方法；

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO.1的核苷酸序列

<400> 1

gatgtgattg cagataattt aacggtaaat cagacctcta attttaaagg tgcagccact 60

ttcgatacag ctacattcaa gagtattgct actacaactt taactgttgg tggtaaaacg 120

gttgcaacag atgaaaaagt gactacatta acggaaacag tgaatcaaaa agcaaaccaa 180

acggatgtta atgaattaaa gacagataag gcagataaat cagtagtcga tggactaagt 240

acagaagtta atacactaaa aaccaataaa gcagataaat cagaaattaa tacattaaaa 300

actagtaaag cagataaatc agtagttgat ggattaacta cagaagttaa tacattaaaa 360

aacactaaag cagataaatc cgagttaact aaactcagca accttgttac atctttaggt 420

gtaccagaag gcacaacaac gtatacaggg attaaatatt tccgtgcgaa gtcagagctt 480

gaagatgcgg ctgcagaagg aaaagattct ttagctatcg gtccaaaagc gaaaacaggc 540

aaaacagcca ctgattcagt tgctttaggt catgacagta cagccaatgc aacagaatct 600

attgcaattg gtaaaaaagc ttatgcagta aaaaccgcaa ataaaggtat cgcgattggt 660

gaacatgctc gtgtaggttc taaacaagat ggtgatgtgg tttatgatgg gcatcttctt 720

atgttc 726

<210> 2

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SEQ ID NO.2的氨基酸序列

<400> 2

DVIADNLTVN QTSNFKGAAT FDTATFKSIA TTTLTVGGKT VATDEKVTTL TETVNQKANQ 60

TDVNELKTDK ADKSVVDGLS TEVNTLKTNK ADKSEINTLK TSKADKSVVD GLTTEVNTLK 120

NTKADKSELT KLSNLVTSLG VPEGTTTYTG IKYFRAKSEL EDAAAEGKDS LAIGPKAKTG 180

KTATDSVALG HDSTANATES IAIGKKAYAV KTANKGIAIG EHARVGSKQD GDVVYDGHLL 240

MF 242

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 上游引物的核苷酸序列

<400> 3

gagtcagaat tcgatgtgat tgcagataat tt 32

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 下游引物的核苷酸序列

<400> 4

gagtcactcg aggaacataa gaagatgccc at 32

Claims

1.一种牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括用牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230包被的固相载体、HRP标记的IgG酶标二抗、标准阳性对照血清、标准阴性对照血清、样品稀释液、浓缩洗涤液、显色液和终止液；其中，所述牛源多杀性巴氏杆菌特异蛋白0230的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述标准阳性对照血清为犊牛感染牛源多杀性巴氏杆菌后的血清，标准阴性对照血清为未免疫和未感染多杀性巴氏杆菌的犊牛血清。

2.根据权利要求1牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230采用如下方法获得：以牛源多杀性巴氏杆菌荚膜血清A型CQ2菌株的DNA作为模板，利用设计合成的特异性引物进行PCR扩增，回收PCR扩增后的目的基因片段，将所述目的基因片段与原核表达载体pET30a连接，构建重组表达质粒pET30a-Pm0230，将重组表达质粒pET30a-Pm0230转化入大肠杆菌 E.coli BL21（DE3）感受态细胞，并采用异丙基硫代半乳糖苷诱导表达，将获得的表达产物经过His标签纯化柱纯化和透析除盐处理，获得所述牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230；所述特异性引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要求1所述牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为含0.5 wt.% BSA、0.05 wt.% 吐温20、5 mmol/L EDTA和0.35 mol/LNaCl的PBS缓冲液，所述样品稀释液的pH为7.2。

4.根据权利要求1所述牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液为25×PBST 洗涤液。

5.根据权利要求1所述牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述显色液为TMB，反应终止液为2 mol/L的硫酸溶液。

6.根据权利要求1所述牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述用牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230包被的固相载体采用如下方法制得：向固相载体中加入浓度为10 μg/mL的牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230溶液，于4 ℃包被过夜后，弃去所述牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230溶液，向固相载体中加入质量浓度为1%的卵清蛋白溶液，于37 ℃下封闭1.5 h。

7.根据权利要求1所述牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述固相载体为96孔聚苯乙烯酶标板。

8.根据权利要求1所述牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述HRP标记的IgG酶标二抗为HRP标记的兔抗牛IgG酶标二抗。

9.一种牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，采用权利要求1~8任一所述牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测试剂盒进行检测，将待检测血清样品与固相载体上包被的牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230接触和保温孵育，用HRP标记的IgG酶标二抗特异地捕捉结合于0230蛋白抗原上的特异抗体，并用显色剂显色，从而测定得到待检测血清样品中针对0230蛋白的抗体水平。

10.根据权利要求9所述牛源多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

1）将待检测血清样品、标准阳性对照血清和标准阴性对照血清分别与样品稀释液按照1:100的体积比进行稀释，获得待检测血清样品稀释液、阳性对照血清稀释液和阴性对照血清稀释液；

2）分别设置空白组、阳性标准组、阴性标准组和待检测血清样品组，所述空白组向用牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230包被的固相载体中加入100 μL样品稀释液，阳性标准组向用牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230包被的固相载体中加入100 μL所述阳性对照血清稀释液，阴性标准组向用牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230包被的固相载体中加入100 μL所述阴性对照血清稀释液，待检测血清样品组向用牛源多杀性巴氏杆菌特异性蛋白0230包被的固相载体中加入100 μL所述待检测血清样品稀释液，将加样后的空白组、阳性标准组、阴性标准组和待检测血清样品组于37 ℃孵育反应90分钟；

3）步骤2）孵育结束后，弃去空白组、阳性标准组、阴性标准组和待检测血清样品组固相载体中的液体，用浓缩洗涤液分别洗涤各组固相载体若干次；

4）将HRP标记的IgG酶标二抗与样品稀释液按照1:500的体积比进行稀释，获得酶标二抗稀释液，分别向步骤3）洗涤后的空白组、阳性标准组、阴性标准组和待检测血清样品组固相载体中加入所述酶标二抗稀释液100 μL，于37℃孵育30分钟；

5）步骤4）孵育后，弃去各组固相载体中的液体，用浓缩洗涤液分别洗涤各组固相载体若干次；

6）分别向步骤5）洗涤后的各组固相载体中加入100 μL显色液，于37 ℃下避光显色反应10~15分钟；

7）步骤6）显色反应结束后，分别向各组固相载体中加入终止液100 μL终止反应，并测定空白组、阳性标准组、阴性标准组和待检测血清样品组中液体在 D _450nm处的吸光度值，当阳性标准组 D _450nm值大于1.0，阴性标准组 D _450nm 值小于0.30时，待检测血清样品组数据有效，待检测血清样品组 D _450nm值大于0.388时判断为阳性，即待检测血清样品中含有牛源多杀性巴氏杆菌抗体，待检测血清样品组 D _450nm值小于或等于0.388时判断为阴性，即待检测血清样品中不含有牛源多杀性巴氏杆菌抗体。