CN106053618B - 分散液液微萃取-高效液相色谱测定食用油中酚类抗氧化剂含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分散液液微萃取‑高效液相色谱测定食用油中酚类抗氧化剂种类和含量的方法。它包括如下步骤：1)将待测食用油与分散剂混合，然后加入萃取剂混合，收集萃取相；2)采用高效液相色谱法分析测定所述萃取相中各个成分的保留时间和含量，经与酚类抗氧化剂标准品的保留时间与含量的对比与计算，即得到食用油中酚类抗氧化剂的种类和含量。本发明具有快速灵敏、使用有机溶剂少的特点，能检测量少的食用油待测样品即能测定其中酚类抗氧化剂的含量和种类；并能应用于多种食用油中酚类抗氧化剂的检测。

Description

分散液液微萃取-高效液相色谱测定食用油中酚类抗氧化剂 含量的方法

技术领域

本发明涉及一种分散液液微萃取-高效液相色谱测定食用油中酚类抗氧化剂种类和含量的方法，属于分析化学领域。

背景技术

酚类合成抗氧化剂作为一种食品添加剂，已被广泛的用来阻止或延缓运输贮藏过程中油脂的氧化变质。国际上常用的酚类合成抗氧化剂有没食子酸丙酯(PG)、特丁基对苯二酚(TBHQ)、丁基羟基茴香醚(BHA)、没食子酸十二酯(DG)、没食子酸辛酯(OG)及2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)，它们可以单独使用或者复合使用。然而，很多研究表明，这些物质具有一定的毒性及致癌作用，过量摄入有害于人们的身体健康。因此，合成抗氧化剂在食品中的用量受到严格控制，并且不同国家的限量值不同。如，TBHQ在美国允许使用，但在欧洲却禁止使用。一般来说，合成抗氧化剂单独或者混合使用的使用值范围为100-200mg kg^-1。

植物油是油不饱和脂肪酸和甘油化合而成的复杂化合物，是从植物的种子、果实、胚芽中得到的油脂。它是人类日常摄取油脂及矿物质的主要来源，因此植物油的质量控制非常重要。常用检测食用油中的抗氧化剂的方法有高效液相色谱法(HPLC)，高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)、气相色谱法(GC)、气相色谱-质谱法联用(GC-MS)、伏安法、毛细管电泳色谱法。然而，这些方法常常耗时长，在萃取过程中使用大量的有机溶剂并且需要大量的样品。因此，建立一种快速灵敏、节约有机溶剂、减少样品量的分析食用油中的合成抗氧化剂的方法是必要且迫切的。

发明内容

本发明的目的是提供一种分散液液微萃取-高效液相色谱测定食用油中酚类抗氧化剂种类和含量的方法。本发明具有快速灵敏、使用有机溶剂少的特点，能检测量少的食用油待测样品即能测定其中酚类抗氧化剂的含量和种类；并能应用于多种食用油中酚类抗氧化剂的检测。

本发明提供的分散液液微萃取-高效液相色谱测定食用油中酚类抗氧化剂种类和含量的方法，包括如下步骤：1)将待测食用油与分散剂混合，然后加入萃取剂混合，收集萃取相；

2)采用高效液相色谱法分析测定所述萃取相中各个成分的保留时间和含量，经与酚类抗氧化剂标准品的保留时间与含量的对比与计算，即得到食用油中酚类抗氧化剂的种类和含量。

上述的方法中，所述待测食用油为芝麻油、橄榄油、葡萄籽油、棉籽油、花生油、大豆油、玉米油和向日葵油中的至少一种。

上述的方法中，所述分散剂为正己烷、异丙醇和丙酮中的至少一种，分散剂有利于增加样品的流动性，扩大接触面积及加速相分离，分散剂必须同时与食用油及萃取剂相容。；

所述萃取剂为甲醇、乙腈和乙醇中的至少一种。

上述的方法中，所述待测食用油的质量与所述分散剂的体积比可为25mg：200μL～1mL，具体可为25mg：0.5mL或25mg：400μL～0.8mL；

所述待测食用油的质量与所述萃取剂体积比可为25mg：200μL～1mL，具体可为25mg：0.5mL或25mg：300μL～0.7mL。

上述的方法中，所述酚类抗氧化剂为没食子酸丙酯、特丁基对苯二酚、丁基羟基茴香醚、没食子酸十二酯、没食子酸辛酯和2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚中的至少一种。

上述的方法中，所述待测食用油与所述分散剂和所述萃取剂的混合依次采用超声处理和离心处理。

上述的方法中，所述超声处理的时间为0～7min，具体可为2min或1～6min，超声有利于加速待测食用油与萃取剂之间的质量传递，增加接触面积缩短萃取时间；

所述离心处理的时间可为0～10min，具体可为2min或1～8min；

所述离心处理的转速可为1000～6000r/min，具体可为3000r/min或2000～5000r/min。

本发明中，步骤2)高效液相色谱法测定酚类合成抗氧化剂的条件与现有技术中相同；高效液相色谱分析条件具体如下：流动相为乙腈(A)及含1％乙酸的水(B)。梯度洗脱程序为：0～9min，30％-90％(A)；9～13min，90％-100％(A)；流速为1.5mL/min，柱温为25℃，进样量为10μL，检测波长为280nm。每次结束后，用甲醇/水冲洗柱子至少30min。

本发明具有以下优点：

采用分散液液萃取技术结合高效液相色谱法对酚类合成抗氧化剂进行富集、检测的方法。整个预处理步骤仅消耗了待测食用油和有机溶剂的量少，具体可为25mg样品，1mL有机溶剂(0.5mL乙腈及0.5mL正己烷)，通过微萃取及离心分离两步完成。本发明采用乙腈作为萃取剂，有效的降低了实际待测食用油样品中所含成分种类的复杂程度，保护了色谱柱。本发明通过回收率实验及精密度实验，说明本发明方法适用于食用油中抗氧化剂含量的质量控制。

附图说明

图1为本发明中萃取剂种类对萃取效率的影响。

图2为本发明中分散剂种类对萃取效率的影响。

图3为本发明中分散剂体积对萃取效率的影响。

图4为本发明中超声时间对萃取效率的影响。

图5为本发明中实验测得的色谱图，其中图5a是空白食用油色谱图；图5b是加入100mg/L混合标准样品的色谱图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，PG、TBHQ、BHA、DG、OG及BHT的标准品均购买于Sigma-Aldrich试剂公司。甲醇、乙醇、正己烷、乙腈及丙酮均为色谱纯度，购买于Sigma-Aldrich试剂公司。不含有合成抗氧化剂的空白棉籽油样由农业部棉花质量监督检测中心提供。芝麻油、橄榄油、葡萄籽油、棉籽油、花生油、大豆油、玉米油及向日葵油均购买于超市。实验用水均为超纯水。使用标准品配制6种目标物的标准储备混合液，浓度为500mg/100mL，保存在4℃冰箱中，并且避光保存。

Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，色谱柱(150×4.6mm,5μm)，KQ-200VDE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，Eppendorf AG离心机(德国艾本德公司)，XP504分析天平(Mettle–Toledo,瑞典)；Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)。

实施例1、

分散液液微萃取-高效液相色谱测定食用油中酚类抗氧化剂种类和含量的方法，具体步骤如下：

1、样品前处理过程：分散液液微萃取

称取25mg的食用油样品止于配有螺旋盖的2mL的离心试管内。然后快速加入0.5mL正己烷分散剂，以增加食用油的流动性。充分混匀后，将0.5mL乙腈萃取剂快速注射进样品中，然后超声2min，再3000r/min离心2分钟。离心后，将萃取相转移入样品瓶中。

2、高效液相色谱法分析测定萃取相中各个成分的保留时间和含量

高效液相色谱分析条件：流动相为乙腈(A)及含1％乙酸的水(B)。梯度洗脱程序为：0～9min，30％-90％(A)；9～13min，90％-100％(A)。流速为1.5mL/min，柱温为25℃，进样量为10μL，检测波长为280nm。每次结束后，用甲醇/水冲洗柱子至少30min。

实验结果如下：

(1)线性及检出限

DAD检测器的灵敏度是通过分析6种酚类抗氧化剂(PG、TBHQ、BHA、DG、OG及BHT)标准混合液来实现的。线性曲线是由峰面积与对应的各种物质浓度作图而得。该法对这6种抗氧化剂的线性范围均为0.1～500mg·L^-1，并且相关系数均大于0.998。将标准溶液稀释，以信噪比S/N＝3计，最低检出限(LOD)为0.01-0.07mg·L^-1。

(2)萃取过程优化

为了减少萃取剂的使用，萃取剂的体积定为0.5mL。食用油样品的量也应该少，因为在萃取过程中油基质可能会与有机溶剂共存，进样到HPLC系统中，会对色谱柱有一定程度的污染。一般来说，允许使用的抗氧化剂最大浓度是200mg/kg。如果一个食用油样品中含有200mg/kg的抗氧化剂并称量样品25mg，然后被0.5mL萃取剂稀释，那么抗氧化剂的最终浓度就是10mg/kg。这刚好在该方法的线性范围中。即使抗氧化剂在实际油样品中仅有5mg/kg，稀释后HPLC检测出的浓度为0.25mg/kg，这仍在该法的线性范围内(0.1-500mg L^-1)。因此食用油样品最少称量为25mg。

按照上述实验步骤采用不同萃取剂进行实验，萃取剂具体如下：甲醇、乙腈、乙醇及甲醇与乙腈的混合物(1:1，v/v)。将100μg的六种抗氧化剂加入到不含抗氧化剂的棉籽油中，混匀，从中取各50mg置于四个离心管内，进行萃取，最后取得的溶液直接进样高效液相色谱仪。测得的各种抗氧化剂的峰面积如图1所示。由图1可知，乙醇作为萃取剂，能与食用油混溶，离心后没有沉积相形成。其余三种有机溶剂都有不同程度的不溶于食用油样品。单独使用甲醇的萃取效率远远低于使用甲醇与乙腈的混合物(1:1，v/v)的，这可能是由于混合后溶剂极性的改变。乙腈的加入，油样迅速成为了乳浊液，离心后有沉积相形成，这有利用降低注射样品的复杂程度，有效的保护了色谱柱。因此乙腈作为最优萃取剂。

按照上述实验步骤采用不同的分散剂进行实验，分散剂具体如下：选择了正己烷、异丙醇及丙酮。实验结果如图2所示，正己烷的萃取效率最大，这是由于正己烷与油样的很好的互溶性及目标分析物在混合溶液低分布率两者的协同作用造成的。

按照上述实验步骤采用不同分散剂的体积(0.2-1mL)对萃取效率影响的测定，由图3可知，25mg待测食用油测定时，0.5mL正己烷时对6种氧化剂的萃取效率最强。因此最佳的分散剂加入体积为0.5mL。

按照上述实验步骤采用不同超声时间(1-10min)对萃取效率影响的测定。由图4知，时间超过2分钟后，6种酚类抗氧化物的峰面积变化很小，也就是说2min已经可以使溶液混匀。因此25mg待测食用油测定时，选择2min作为超声时间。然后，3000rpm离心分离2min样品，以使两相有效分离。

(3)食用油样品中萃取酚类抗氧化剂的色谱行为

向不含抗氧化剂的空白油样中加入一定量的6中抗氧化剂使最终浓度为100mg/L，得到空白油样及加入标准物的油样的色谱图。由图5可知，PG，TBHQ，BHA，OG，DG，及BHT的保留时间依次是3.76，5.42，7.81，7.99，11.13，11.75min。通过标准混合物质保留时间及谱图来确定各种分析物，由图5可知，油样中的其他杂质对分析物的检测是几乎没有干扰的。

(4)回收率及精密度实验

将50.0、100.0及200.0μg的各种抗氧化剂分别加入到1.000g不含抗氧化剂的棉籽油中，混合均匀以保证抗氧化剂与油样完全相溶。平均回收率及相对标准偏差结果如表1。回收率为85.8％～102.5％，相对标准偏差均低于3.2％。

表1样品回收率测定(n＝3)

使用日间相对标准偏差及日内标准偏差来检验该方法的重复性。日内精密度是通过一天注射10mg/L的6种标准物质混合液五次来实现的。日间精密度是连续五天测10mg/L的6种标准物质混合液来实现的。结果表明，日间及日内精密度均低于3.8％(n＝5)。上述结果说明抗氧化剂的稳定性对样品处理及HPLC检测均没有太大影响。

(5)实际样品检测

按照上述实验步骤对8种食用油样品(芝麻油、橄榄油、葡萄籽油、棉籽油、花生油、大豆油、玉米油及向日葵油)中酚类抗氧化剂的种类和含量进行分析。采用外标法进行计算实样中的抗氧化剂含量，结果如表2所示。由表2可知，TBHQ是最常用的食用油抗氧化剂，有7个样品中检测到了TBHQ，浓度从4.66mg/kg到44.1mg/kg。这8个样品中均未检测到BHA。这8种食用油各自抗氧化剂含量总和或者单独未超过标准200mg/kg。厂家仅仅标明含有抗氧化剂，但未明确其种类及含量。本发明方法可以测得抗氧化剂的种类和含量。

表2实际样品中抗氧化剂的检测(n＝3)

^aRSD，相对标准偏差；n＝3.

^b总量，各种抗氧化剂的总和

^c ND，未检测到.

^d用AOAC方法检测验证

(6)与其他分析方法比较

为了进一步验证本发明方法的准确性，使用AOAC方法(AOAC OfficialMethod983.15AOAC.1995)对食用油中抗氧化剂的起始含量进行测定。如表2所示，这两种方法的结果是一致的。然后将本发明方法与现有的其他分析方法进比较，本发明方法有较好的灵敏度，及前处理有机溶剂使用量低，样品消耗量低，处理时间短。

其中AOAC方法为：抗氧化剂用乙腈萃取后富集，用异丙醇进一步稀释，然后用液相色谱-紫外检测器测定。流动相为:A,5％乙酸/水；B,乙腈/甲醇(1:1，v/v)。

Claims (4)

1.分散液液微萃取-高效液相色谱测定食用油中酚类抗氧化剂种类和含量的方法，包括如下步骤：1)将待测食用油与分散剂混合，然后加入萃取剂混合，收集萃取相；

所述萃取剂为乙腈；

所述待测食用油的用量为25mg；

所述分散剂的用量为0.5mL；

所述萃取剂的用量为0.5mL；

所述待测食用油与所述分散剂和所述萃取剂的混合依次采用超声处理和离心处理；

2)采用高效液相色谱法分析测定所述萃取相中各个成分的保留时间和含量，经与酚类抗氧化剂标准品的保留时间与含量的对比与计算，即得到食用油中酚类抗氧化剂的种类和含量；

所述酚类抗氧化剂为没食子酸丙酯、特丁基对苯二酚、丁基羟基茴香醚、没食子酸十二酯、没食子酸辛酯和2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述待测食用油为芝麻油、橄榄油、葡萄籽油、棉籽油、花生油、大豆油、玉米油和向日葵油中的至少一种。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述分散剂为正己烷、异丙醇和丙酮中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述超声处理的时间为1～6min；

所述离心处理的时间为1～8min；

所述离心处理的转速为1000～6000r/min。