CN106053509A - 湖泊藻类中有机磷提取及组成分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种湖泊藻类中有机磷提取方法，包括样品采集、磷的基本组成测定、有机磷(Po)的提取、样品测试预处理、液态磷核磁(31P‑NMR)分析和计算步骤。本发明采用0.5mol/L NaOH+25mmol/L EDTA提取剂，藻类粉末样品与提取剂的固液比为1：60获得最优的Po提取效果；31P‑NMR分析测试过程中，设置延迟时间(D1)为5s，扫描分析时间为15h可获得较好的谱图。本发明的藻类Po提取方法，总磷(TP)和Po的平均提取率分别在95.0％和94.9％以上，能准确检测出样品中Po的具体种类及含量，真实准确的反映湖泊中藻类Po的组成结构特征。为研究湖泊藻类在水华暴发过程中所做的贡献以及湖泊内源磷循环过程及其对政府决策具有重要科学依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种有机磷的提取及组成分析方法，特别是一种湖泊藻类中有机磷提取及组成分析方法。
背景技术
磷作为淡水湖泊生态系统新陈代谢作用中关键的元素之一，过量的磷导致藻类大量生长繁殖，引起水质恶化并危害生态系统安全。外源输入和内源循环是导致湖泊水体磷大幅度增加的主要因素。近年来，包括生活污水、工农业生产、土壤径流等过程携带的外源磷输入得到了一定的控制，湖泊内源磷的释放成为引起湖泊水质进一步恶化的关键因素。沉积物释放是湖泊内源磷污染重要的来源之一，但富营养化湖泊中广泛存在着由于水华暴发产生的藻类，其死亡腐烂分解后的产物可能是湖泊内源磷另一个重要的来源。例如，在藻类暴发期间，太湖北部(如梅梁湾)水体表面将会覆盖着大量藻类，且藻类暴发后，产生藻毒素危害生态系统健康，引起一系列环境问题。这些藻类死亡腐烂分解后，又会对水体造成二次污染，其中磷的释放率远高于碳和氮，半个月内磷的释放量就可高达70％。因此，针对湖泊藻类来源磷的研究十分重要。有机磷(Organic Phosphorus，Po)是藻类中磷的重要组成部分。另外，已有研究表明Po在水生生态系统的磷循环中扮演重要角色，一些Po组分可通过酶水解转化为生物可利用性活性磷酸盐，进而成为富营养化湖泊蓝藻水华持续暴发的重要磷源。
目前，由于分析测试方法的限制，对湖泊藻类中Po化学结构和形态等的研究还十分有限，多数研究一般仅限于Po总量的分析。目前，关于Po的测试分析其组成结构和特征方面的研究主要集中于土壤、沉积物及腐殖质等物质的研究。如文献CN102353567A公开了一种采用泡沫分离装置进行底泥中Po的分离和富集的方法。该方法包括以下步骤：(1)底泥样品采集；(2)泥样的冷冻干燥；(3)底泥中Po的萃取；(4)去除混合溶液中的杂质；(5)滤液pH调节；(6)滤液中Po的泡沫分离；(7)对泡沫分离收集的Po溶液再次进行真空冷冻干燥。该发明相比传统方法，泡沫分离方法，富集Po的能力更强，用于底泥Po核磁共振分析的样品中Po含量更高，且泡沫分离方法富集的Po检测到了一个磷酸二脂信号峰，而传统方法检测不到，且测定所需时间缩短到传统方法的2/3。文献CN10558242A公开了一种水体中颗粒态Po的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：采样、过滤、冻干、研磨、EDTA-Na2S2O4混合溶液中提取无机磷、NaOH溶液中提取Po的步骤；同时还公开了基于该提取方法的核磁共振测定方法。该发明的有益之处在于：能够检测出样品中具体Po的种类；通过现场过滤，减少了样品运输过程中Po形态的变化；分析需求的样品量少，减少了现场过滤的工作量；分析提取步骤少，不仅减少了提取过程中的磷损失，而且节省了分析样品的时间；利用相对回收率计算后发现，该发明的测定方法其分析测试的精度较高。上述文献主要公开了水体中底泥或颗粒态中Po的提取过程，且Po的提取效率不高，这对准确理解水生态系统的生物地球化学循环具有一定的影响。
发明内容
本发明的目的在于提供一种湖泊藻类中有机磷提取及组成分析方法，优化其有机磷的提取方法和31P-NMR测定过程中的参数设置，并分析藻类中磷的组成结构特征。
本发明的技术方案如下：
一种湖泊藻类中有机磷提取方法，包括以下步骤：
(1)样品采集：采集富营养化湖泊水体表层漂浮藻类，装入密封袋冷藏保存，运回实验室进行冷冻干燥，冷干后充分研磨，过2mm筛，得到藻类粉末样品，-20℃冷冻保存备用；
(2)磷的基本组成测定：取藻类粉末样品两份，一份于马弗炉中煅烧，样品降至室温后加入HCl振荡，离心分离后分析其中磷浓度，即总磷TP含量；另一份样品置于离心管中，加入HCl振荡，离心后测定磷浓度，即无机磷Pi含量；藻类中有机磷Po的含量由TP和Pi相减得到；
(3)Po的提取：取藻类粉末样品加入提取剂，室温下振荡、离心后，留取上清液，冷冻干燥形成粉末样品，冷冻保存备用；
(4)样品测试预处理：将步骤(3)得到的粉末样品用NaOH溶解，离心，加入D2O锁定信号；
(5)31P-NMR分析：采用BRUKER标准腔5mm BBO探头，31P的共振频率为161.98Hz，测定温度为20℃，谱峰宽度为5Hz，获取时间AQ为0.2102s；
(6)计算：通过步骤(5)中得到的波谱进行积分及对各磷组分进行定性分析，并根据步骤(2)得到的TP含量计算藻类中各磷组分的含量。
优选的，所述TP的测定为：准确称取0.5g藻类粉末样品一份，3个平行样，于马弗炉中450℃煅烧3h，降至室温后转移至离心管中，加入20mL3.5mol/L HCl振荡16h，离心分离后，上清液用0.45μm滤膜过滤得提取液，利用5％过硫酸钾121℃消解30min，分析其中磷浓度，即TP含量。
优选的，所述Pi的测定为：准确称取0.5g藻类粉末样品一份，3个平行样，置于离心管中，加入20mL1mol/L HCl振荡提取16h，离心分离后，上清液用0.45μm滤膜过滤得提取液，测定磷浓度，即Pi含量。
优选的，所述TP和Pi采用磷钼蓝法进行测定。
优选的，所述(3)Po的提取为：取藻类粉末样品0.5g加入提取剂，室温下振荡提取16h，4℃条件下，8000×g离心30min后留取上清液，冷冻干燥形成粉末样品，冷冻保存备用。
优选的，所述步骤(4)中NaOH为0.6mL 10mol/LNaOH；所述离心为8000×g离心15min；所述D2O为0.2ml。
优选的，所述藻类为微囊藻、小球藻和螺旋藻。
优选的，所述步骤(3)中，提取剂为(0.1，0.25，0.5)mol/L NaOH+(0，10，25，50)mmol/L EDTA相互组合。提取剂的选择对于在不破坏样品结构的前提下最大程度的提取藻类中的Po十分重要。不同样品研究中采用的提取剂或提取剂组合也存在差异。
优选的，所述提取剂为0.5mol/L NaOH+25m mol/LEDTA。
优选的，所述步骤(3)中，藻类粉末样品与提取剂的固液比为1:30或1：60。固液比的选择对于提取藻类中的Po组分及提取效果十分重要。不同样品研究中所采用的固液比也存在差异。
优选的，所述步骤(3)中，藻类粉末样品与提取剂的固液比为1：60。
优选的，所述步骤(5)中，31P-NMR参数中延迟时间D1的设置为2s、5s或15s，分析测试时间为12-15h。样品31P-NMR分析过程中参数设置，如延迟时间D1、分析测试时间等对于谱图分辨率以及样品中各磷的组分的的定性和定量十分重要。不同样品研究中所采用的参数也存在差异。
优选的，所述步骤(5)中，31P-NMR参数中延迟时间D1的设置为5s，分析测试时间为15h。
分析得到，藻类中磷由正磷酸盐、单酯磷、二酯磷以及焦磷酸盐组成，Po占TP的31.27％～72.96％，单酯磷为藻类中Po重要组分，其平均含量占Po的83％。
本发明应用不同的提取剂和固液比提取湖泊藻类中Po，并进一步采用液态核磁共振
(31P-NMR)技术分析其组成特征。在采用0.5mol/L NaOH+25m mol/LEDTA提取剂，并控制藻类粉末样品与提取剂的固液比为1:60可获得最优的Po提取效果；31P-NMR分析测试过程中，设置延迟时间D1为5s，扫描分析时间为15h可获得较好的谱图，出峰效果好。本发明的藻类Po的提取方法，TP和Po的平均提取率分别在95.0％和94.9％以上，能准确检测出样品中Po的具体种类和含量，准确的反映湖泊藻类Po的组成结构特征。为研究湖泊藻类在水华爆发过程中所做的贡献以及湖泊内源磷循环过程及其对政府决策具有重要科学依据
附图说明
图1.实施例1-12磷组分的提取率(A-L依次代表实施例1-12)。
图2.本发明的提取方法对藻类磷提取的31P-NMR图谱。
图3.湖泊藻类磷组分不同延迟时间的液态31P-NMR图谱。
具体实施方式
湖泊藻类有机磷提取方法，包括以下步骤：
(1)样品采集：采集富营养化湖泊水体表层漂浮藻类，装入密封袋冷藏保存，运回实验室进行冷冻干燥，冷干后充分研磨，过2mm筛，得到藻类粉末样品，-20℃冷冻保存备用；
(2)磷的基本组成测定：总磷TP、无机磷Pi和Po的测定，
准确称取0.5g藻类粉末样品两份，每份3个平行样，一份于马弗炉中450℃煅烧3h，降至室温后转移至离心管中，加入20mL3.5mol/L HCl振荡16h，离心分离后，上清液用0.45μm滤膜过滤得提取液，利用5％过硫酸钾121℃消解30min，分析其中磷浓度，即TP含量；
另一份样品置于离心管中，加入20mL1mol/L HCl振荡提取16h，离心分离后，上清液用0.45μm滤膜过滤得提取液，测定磷浓度，即Pi含量；
由TP和Pi相减获得藻类Po含量；
采用磷钼蓝法在Agilent8453紫外分光光度计上测定TP和Pi；
(3)Po的提取：取藻类粉末样品0.5g加入提取剂，室温下振荡提取16h，4℃条件下，8000×g离心30min后留取上清液，冷冻干燥形成粉末样品，冷冻保存备用；
(4)样品测试预处理：将步骤(3)得到的粉末样品用0.6mL 10mol/LNaOH重新溶解，以8000×g离心15min，加入0.2mL D2O锁定信号；
(5)31P-NMR分析：采用BRUKER标准腔5mm BBO探头，31P的共振频率为161.98Hz，测定温度为20℃，谱峰宽度为5Hz，AQ为0.2102s；
(6)计算：通过步骤(5)中得到的波谱进行积分及对各磷组分进行定性分析，并根据步骤(2)得到的TP含量计算藻类中各磷组分的含量。
提取剂组成和提取比例对Po提取率的影响的研究。表1列出实施例1-12的所采用的提取剂和提取比例，按上述步骤进行实验。其中，31P-NMR参数中延迟时间D1的设置为5s，分析测试时间为15h。表2为实施例11藻类中TP和Po的提取率。表3为实施例11藻类中各个磷组分的含量及占TP的百分比。
表1实施例1-12所采用的提取剂和提取比例
表2.实施例11藻类中磷的提取率
| TP(％) | Po(％) | |
| 微囊藻 | 99.3 | 96.2 |
| 小球藻 | 89.4 | 95.9 |
| 螺旋藻 | 96.2 | 92.6 |
| 平均值 | 95.0 | 94.9 |
如图1所示，实施例1-3采用1:30提取比例，提取剂分别为0.25，0.5mol/L NaOH，藻类中TP和Po提取率高于提取剂为0.1mol/L NaOH时藻类中TP和Po的提取率，表明采用0.25mol/L和0.5mol/L NaOH作为提取剂，更有利于藻类中TP和Po的提取。
实施例4-6采用1:60提取比例，提取剂分别为0.1，0.25，0.5mol/L NaOH，则TP提取率分别高于1:30提取比例下的TP提取率，Po提取率也分别高于于1:30提取比例下的Po提取率。尤其，实施例5-6的TP提取率明显高于实施例2-3的TP提取率，实施例5-6的Po提取率明显高于实施例2-3的Po提取率。
另外，藻类粉末样品与提取剂的固液比为1:30的提取比例会导致提取液过于黏稠，固液分离效果差，当提取比例为1：90，1：100时，稀释倍数过大导致样品浓度过低，提取率也差，而提取比例为1:60时，提取液既能充分与样品粉末融合又不会过于黏稠且易分离，提取率更高，这表明采用固液比为1:60的提取比例更适合磷组分的提取。因此，湖泊藻类Po的提取比例为1:60。
进一步地，从实施例7-12表明NaOH与EDTA同时作为提取剂藻类中的TP和Po的提取率明显高于NaOH单独作为提取剂藻类中TP和Po的提取率。实施例11中，当提取剂为0.5mol/L NaOH+25mmol/L EDTA时，水体中藻类的TP和Po的提取率最高。如表2所示，实施例11中藻类中的TP和Po的提取率分别高达95.0％和94.9％。
如图2所示，采用本发明的提取方法，得到藻类中磷组分的组成特征，表明藻类磷组分由正磷酸盐、单酯磷、二酯磷、焦磷酸盐组成，其中，Po以单酯磷为主要组成部分。
表3.实施例11藻类中各个磷组分的含量(mg/kg)及占总磷的百分比(％)
从表3可以看出，藻类Pi占TP的27.04％～68.73％，而Po甚至可达TP总量的31.27％～72.96％。藻类单酯磷占TP的28.73％～56.27％，平均含量高达Po的83％。因此，单酯磷是藻类中Po的主要组分。
31P-NMR分析及其延迟时间的设定研究。实施例13-15中31P-NMR的参数设置见表4。按上述步骤进行实验。表4为不同延迟时间的藻类磷组分含量。表5为不同延迟时间D1的藻类磷组分积分比例。
表4.不同延迟时间(D1)的藻类磷组分含量(mg/kg)
| 含量 | 延迟时间(s) | 测试时间(h) | 正磷酸盐 | 单酯磷 | 二酯磷 | 焦磷酸盐 |
| 实施例13 | 2 | 12 | 2835 | 4989 | 425 | 1531 |
| 实施例14 | 5 | 15 | 3028 | 4754 | 424 | 1575 |
| 实施例15 | 15 | 49 | 3543 | 4464 | 107 | 1665 |
表5.不同延迟时间的藻类磷组分积分比例(％)
| 积分比例 | 延迟时间(s) | 测试时间(h) | 正磷酸盐 | 单酯磷 | 二酯磷 | 焦磷酸盐 |
| 实施例13 | 2 | 12 | 29.0 | 51.0 | 4.4 | 15.7 |
| 实施例14 | 5 | 15 | 31.0 | 48.6 | 4.3 | 16.1 |
| 实施例15 | 15 | 49 | 36.2 | 45.7 | 1.1 | 17.0 |
如图3和表4-5所示，随着测试时间的增长，单酯磷和二酯磷含量及积分比例均降低，正磷酸盐和焦磷酸盐含量及积分比例均上升。D1从2s到5s时，单酯磷含量降低4.71％，二酯磷含量降低不足0.5％，而相应的正磷酸盐和焦磷酸盐分别上升6.36％和1.10％。D1从5s到15s导致分析结果的变化较为明显，其单酯磷含量降低6.08％，二酯磷分解的更为剧烈，从424mg/kg降低到107mg/kg，约有75％二酯磷分解了，相应的正磷酸盐和焦磷酸盐含量分别上升14.55％和7.08％。因此，为防止Po在分析过程中造成大量的降解，延迟时间不宜过长，测试时间尽量控制在12～15h之间。进一步比较D1＝2s和5s的图谱，D1＝5s时焦磷酸盐的峰信号更加尖锐些，而D1＝2s的焦磷酸盐谱峰相对较宽，D1＝2s时单酯磷区域出现6个详细尖峰，而D1＝5s时检测出来8个尖峰。因此，从31P-NMR图谱分辨率的角度考虑，对于藻类样品，选择D1＝5s时相对较优。综上分析，对湖泊藻类样品NaOH-EDTA提取液的31P-NMR分析时，选择D1＝5s，测试时间在15h。
以上对本发明实施例所提供的一种湖泊藻类中有机磷提取及组成分析方法，进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (10)
1.一种湖泊藻类中有机磷提取方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)样品采集：采集富营养化湖泊水体表层漂浮藻类，装入密封袋冷藏保存，运回实验室进行冷冻干燥，冷干后充分研磨，过2mm筛，得到藻类粉末样品，-20℃冷冻保存备用；
(2)磷的基本组成测定：取藻类粉末样品两份，一份于马弗炉中煅烧，样品降至室温后加入HCl振荡，离心分离后分析其中磷浓度，即总磷TP含量；另一份样品置于离心管中，加入HCl振荡，离心后测定磷浓度，即无机磷Pi含量；藻类中有机磷Po的含量由TP和Pi相减得到；
(3)Po的提取：取藻类粉末样品加入提取剂，室温下振荡、离心后，留取上清液，冷冻干燥形成粉末样品，冷冻保存备用；
(4)样品测试预处理：将步骤(3)得到的粉末样品用NaOH溶解，离心，加入D2O锁定信号；
(5)31P-NMR分析：采用BRUKER标准腔5mm BBO探头，31P的共振频率为161.98Hz，测定温度为20℃，谱峰宽度为5Hz，获取时间AQ为0.2102s；
(6)计算：通过步骤(5)中得到的波谱进行积分及对各磷组分进行定性分析，并根据步骤(2)得到的TP含量计算藻类中各磷组分的含量。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述藻类为微囊藻、小球藻和螺旋藻。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述TP的测定具体为：准确称取0.5g藻类粉末样品一份，3个平行样，于马弗炉中450℃煅烧3h，降至室温后转移至离心管中，加入20mL3.5mol/L HCl振荡16h，离心分离后，上清液用0.45μm滤膜过滤得提取液，利用5％过硫酸钾121℃消解30min，分析其中磷浓度，即TP含量。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述Pi的测定具体为：准确称取0.5g藻类粉末样品一份，3个平行样，置于离心管中，加入20mL1mol/L HCl振荡提取16h，离心分离后，上清液用0.45μm滤膜过滤得提取液，测定磷浓度，即Pi含量。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(3)Po的提取具体为：取藻类粉末样品0.5g加入提取剂，室温下振荡提取16h，4℃条件下，8000×g离心30min后留取上清液，冷冻干燥形成粉末样品，冷冻保存备用。
6.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(4)中NaOH为0.6mL 10mol/LNaOH；所述离心为8000×g离心15min；所述D2O为0.2ml。
7.根据权利要求6所述的提取方法，其特征在于，所述提取剂为0.5mol/L NaOH+25mmol/L EDTA。
8.根据权利要求1-7任一项所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(3)中，藻类粉末样品与提取剂的固液比为1：60。
9.根据权利要求1-7任一项所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(5)中，31P-NMR参数中延迟时间D1的设置为2s、5s或15s，分析测试时间为12-15h。
10.根据权利要求1-7任一项所述的提取方法，其特征在于，分析得到，藻类中磷由正磷酸盐、单酯磷、二酯磷以及焦磷酸盐组成，Po占TP的31.27％～72.96％，单酯磷为藻类中Po重要组分，其平均含量占Po的83％。
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| CN108613999A (zh) * | 2016-12-12 | 2018-10-02 | 中国石油天然气股份有限公司 | 测定含磷润滑剂中磷分布的测定方法 |
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